陸地棉L-D1等位基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

姜輝，鄭錦秀，王永翠，張超，王秀麗，陳瑩，高明偉，王家寶，柴啟超，趙軍勝*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，濟南 250100；2.汶上縣第一中學(xué)，山東 濟寧 272500）

陸地棉屬于喜光作物，良好的冠層結(jié)構(gòu)可使中下部獲取更多光能，緩解蕾鈴脫落及爛鈴問題，為實現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)目標(biāo)奠定基礎(chǔ)[1-2]。針對不同生態(tài)條件及種植方式，我國西北內(nèi)陸、黃河流域和長江流域三大棉區(qū)棉花分別形成了獨具特色的群體結(jié)構(gòu)[3]，為各棉區(qū)棉花單產(chǎn)的提高奠定了基礎(chǔ)。近年來，隨著高效輕簡化植棉技術(shù)的深入研究及不斷應(yīng)用，群體的冠層結(jié)構(gòu)需要進(jìn)一步優(yōu)化[4-7]。

棉花冠層結(jié)構(gòu)受到外界因素的影響，但主要與本身的生物學(xué)特性如葉形、葉傾角、果枝長度、果枝夾角等[8-10]密切相關(guān)。葉形主要分為常態(tài)葉、亞雞腳葉、雞腳葉和超雞腳葉4種類型。雞腳葉棉在澳大利亞大面積種植，在部分棉區(qū)的種植面積接近50%[11]。在我國西北內(nèi)陸棉區(qū)，雞腳葉棉光能利用效率高，皮棉產(chǎn)量達(dá)到超高產(chǎn)水平（3 500 kg·hm－2以上）[12-13]，亞雞腳葉棉在黃河流域和長江流域棉區(qū)均表現(xiàn)出產(chǎn)量優(yōu)勢[14-15]。

L-D1位點是調(diào)控陸地棉葉形的主要位點，Andres等[16]將該位點定位在陸地棉15號染色體短臂5.4 cM區(qū)間內(nèi)，通過共線性分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間對應(yīng)雷蒙德氏棉2號染色體337 kb的區(qū)域，包含34個候選基因，推測其中的2個HD-ZIPⅠ轉(zhuǎn)錄因子基因Gorai.002G244000和Gorai.002G244200為候選基因。Zhu等[17]利用棉花SNP63K芯片將定位區(qū)間進(jìn)一步縮小，推斷Gorai.002G244000是陸地棉雞腳葉基因L2o的同源基因，并發(fā)現(xiàn)非互易同源重組在葉形等位基因起源中發(fā)揮了重要作用。Chang等[18-19]通過圖位克隆獲得了L2o的序列，分析發(fā)現(xiàn)常態(tài)葉基因編碼區(qū)有8 bp和1 bp的2個缺失，基因沉默及過表達(dá)分析表明L2o調(diào)控葉形的發(fā)育，并且與KNOX1基因共同調(diào)控葉形。Andres等[20]對L-D1位點4個復(fù)等位基因編碼區(qū)和啟動子區(qū)域的多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)和3’端非翻譯區(qū)的差異位點均存在于常態(tài)葉基因l2中，5’端非翻譯區(qū)的差異位點全部為單核苷酸多態(tài)性 （Single nucleotide polymorphism,SNP）位點，l2中6個，L2o和L2s各1個；同時發(fā)現(xiàn)L2o和L2s啟動子區(qū)域的133 bp的串聯(lián)重復(fù)序列與基因表達(dá)量的升高密切相關(guān)。He等[21]發(fā)現(xiàn)海島棉中亞雞腳葉基因L2e的表達(dá)與植物激素信號密切相關(guān)，其中油菜素內(nèi)酯對葉形的影響最大。

L-D1位點的4個復(fù)等位基因彼此間是不完全顯性遺傳關(guān)系。朱偉等[15]利用超雞腳葉、雞腳葉和正常葉棉花不育系及其恢復(fù)系為親本創(chuàng)制的F1代材料的葉形可分為超雞腳葉、雞腳葉、中雞腳葉、大雞腳葉和常態(tài)葉5類，一些葉形形態(tài)極為相似，難以準(zhǔn)確區(qū)分，同時各種葉形在后期才能基本穩(wěn)定，這給種質(zhì)的早期鑒定及育種應(yīng)用帶來一定困難。前人研究發(fā)現(xiàn)L-D1等位基因在啟動子區(qū)域存在較為豐富的多態(tài)性[14]，本研究通過深入分析L-D14個等位基因啟動子區(qū)域的多態(tài)性位點，設(shè)計特異性分子標(biāo)記，為不同葉形基因的鑒定及分子輔助選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以超雞腳葉形種質(zhì)R132163、雞腳葉形T586和亞雞腳葉形S131189為父本，分別與常態(tài)葉品種魯棉研28號（LMY28-N，基因型為l2 l2）雜交，再以常態(tài)葉魯棉研28號為輪回親本經(jīng)過連續(xù)6代回交和1代自交得到具有魯棉研28號遺傳背景的超雞腳葉魯棉研28號（LMY28-S，基因型為L2sL2s）、雞腳葉魯棉研28號（LMY28-O，基因型為L2o L2o）、亞雞腳葉魯棉研28號（LMY28-Su，基因型為L2u L2u）近等基因系。將LMY28-S、LMY28-O、LMY28-Su分別與LMY28-N雜交，F(xiàn)1基因型分別為L2s l2、L2o l2和L2u l2。以上材料均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所種植及保存。

本試驗于2020年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所試驗站（山東臨清）進(jìn)行，試驗材料種植4行區(qū)，大小行種植，大行行距90 cm，小行行距72 cm，行長8m，株距20 cm，常規(guī)大田管理。

1.2 葉片形態(tài)參數(shù)的測量

測量近等基因系不同葉位葉片的主裂片長度（L1）和寬度（b1）、葉片長度（L）和寬度（b）[14]，按照以下公式計算主裂深度比（Main lobe depth ratio,rL）及主裂寬度比（Main lobe w idth ratio,rb）：rL=L1/L，rb=b1/b。

1.3 棉花基因組DNA提取

選取苗期嫩葉，利用CTAB法提取基因組DNA[22]，利用Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度與純度。

1.4 L-D1等位基因啟動子克隆及序列分析

在CottonFGD數(shù)據(jù)庫（https://cottonfgd.org/）中提取陸地棉TM-1基因組中l(wèi)2（基因ID：Gh_D01G2042.1 ）起始密碼子前約4 kb的啟動子序列，利用Primer-Blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計引物 （正向引物：GGTTCCAAGCCTCTCCACT，反向引物TCGTGGATACGATCTTCCCT），分 別 以LMY28-S、LMY28-O、LMY28-Su和LMY28-N的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴增，目的條帶經(jīng)1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳后分離，用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，連接至pMD20T克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，篩選獲得陽性克隆后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。利用BioEdit軟件進(jìn)行序列分析。

1.5 分子標(biāo)記檢測

分子標(biāo)記檢測所用的PCR及酶切過程參考試劑說明書。PCR所用的GoTaqDNA聚合酶反應(yīng)體系購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，NlaⅢ內(nèi)切酶購于紐英倫生物技術(shù)有限公司，MfeⅠ內(nèi)切酶購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。酶切產(chǎn)物用8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，用快速銀染法染色觀察。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用DPS 7.05 和MS Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 近等基因系主莖葉葉裂變化

由圖1可以看出，棉花葉片葉裂的形成是一個漸變的過程，葉裂深度隨葉位的增加逐漸加深，最后穩(wěn)定。LMY28-S、LMY28-O、LMY28-Su和LMY28-N的第1片和2片真葉均無葉裂，第3片真葉開始出現(xiàn)葉裂，第4片至第8片真葉葉裂不斷加深，從第9片葉開始葉裂深度基本保持不變，各葉位葉裂深度比均以LMY28-S最大，其次 為LMY28-O和LMY28-Su，LMY28-N最 小。從9葉期開始，LMY28-O、LMY28-Su和LMY28-N葉片的主裂深度比分別為0.94 、0.75 和0.58 。LMY28-S葉裂深度自第7片葉開始保持不變，主裂深度比為1（圖2）。

圖2 4個近等基因系主莖不同葉位葉片的主裂深度比Fig.2 rL of leaf at different positions in four near isogenic lines

L-D1復(fù)等位基因的不同組合形成相似的葉形。如圖3所示，超雞腳葉的LMY28-S和常態(tài)葉LMY28-N雜交F1的葉形（圖3A）與純合的雞腳葉LMY28-O葉形（圖3B）極為相似，主裂深度比和主裂寬度比差異均不顯著（圖3G～H）；亞雞腳葉LMY28-Su和常態(tài)葉LMY28-N雜交F1的葉形（圖3C）與純合的亞雞腳葉LMY28-Su葉形（圖3D）也極為相似，二者的主裂深度比和主裂寬度比的差異均不顯著（圖3G～H）。

圖3 不同材料第9片葉的形態(tài)Fig.3 Morphology of the ninth leaf of different cotton lines

2.2 L-D1等位基因啟動子克隆及序列分析

克隆獲得L-D1位點4個等位基因4 kb左右的啟動子片段，序列分析發(fā)現(xiàn)2個缺失和24個SNPs（表1和附圖1）。2個缺失分別為133 bp和14 bp，其中133 bp缺失于L2u和l2啟動子區(qū)域。14 bp缺失位于L2s、L2o和L2u的啟動子中。

表1 L-D1等位基因啟動子區(qū)域的差異位點Table 1 Polymorphism of L-D1 alleles promoter region

圖1 4個近等基因系主莖不同葉位葉片形態(tài)變化Fig.1 Morphology of leaves at different positions in four near isogenic lines

L2s中有1個SNP，L2o中有2個SNP，其 它21個SNPs位點均位于l2中。SNP位點可用于開發(fā)酶切擴增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS）標(biāo)記或者衍生酶切擴增多態(tài)性序列標(biāo)記（Derived cleaved amplified polymorphic sequences,dCAPS）標(biāo)記，分析24個SNPs位點所在區(qū)域的序列，結(jié)合限制性內(nèi)切酶信息發(fā)現(xiàn)－166 bp、－2 638 bp、－2 917 bp這3個位點所在區(qū)域分別包含NlaⅢ、CviAⅡ、A luⅠ的酶切位點，而其它位點可通過點突變與前后序列形成不同的內(nèi)切酶切位點，如－192 bp和－519 bp的SNP可以通過突變分別形成MfeⅠ和NlaⅢ的酶切位點（表2）。

2.3 L-D1等位基因特異分子標(biāo)記設(shè)計及檢測

根據(jù)序列差異設(shè)計引物（表2），特異性鑒定各等位基因。利用l2基因編碼區(qū)的8 bp缺失[20]設(shè)計分子標(biāo)記InDel_8，是l2的特異分子標(biāo)記（圖4）。根據(jù)－192 bp處的SNP設(shè)計dCAPS_192標(biāo)記，能將L2o同L2s、L2u、l2區(qū)分開，可作為L2o的特異分子標(biāo)記（圖4）。利用－519 bp處的SNP位點，在正向引物端引入了1個堿基替換（A替換為C），形成NlaⅢ的酶切位點，設(shè)計dCAPS_519標(biāo)記可將L2s同L2o、L2u、l2區(qū)分開，可作為L2s的特異分子標(biāo)記（圖4）。

表2 L-D1葉形等位基因的特異分子標(biāo)記Table 2 The specific DNA markers for L-D1 alleles

圖4 不同葉形材料中L-D1等位基因的檢測Fig.4 Detection of L-D1 alleles in different leaf shape materials

3 討論

葉片不僅是作物最重要的光合器官，也是作物冠層結(jié)構(gòu)的重要組成部分，因此一直是作物高光效育種研究的重點。在選育適于機械化收獲的棉花品種過程中，葉形及冠層光合改良被視為提高光能向生物產(chǎn)量轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素[23-25]。在禾本科作物水稻和玉米中已發(fā)現(xiàn)多個與葉傾角[26-31]、葉片寬度[32-33]、卷曲度[26,34-35]及披垂度[36]等葉形性狀相關(guān)的基因，為高光效品種培育提供了基因資源。棉花屬于闊葉作物，且具有無限生長習(xí)性，葉片形狀、枝條長度及角度變化比禾本科作物更復(fù)雜，這給棉花的冠層結(jié)構(gòu)改良帶來很大難度。

L-D1位點是目前可用于棉花冠層改良的重要基因資源。與其它控制葉形的基因位點不同，該位點包含4個復(fù)等位基因，兩兩組合可形成4種純合葉形、6種雜合葉形，為從葉形的角度改良棉花冠層結(jié)構(gòu)提供了多種選擇[15]。但是由于4個復(fù)等位基因彼此間是不完全顯性關(guān)系，組合后可生成相似的葉形，如純合超雞腳葉棉花與常態(tài)葉棉花雜交F1的葉形與純合雞腳葉極為相似，純合雞腳葉棉花和與常態(tài)葉棉花雜交F1的葉形與純合亞雞腳葉極為相似。在近等基因系轉(zhuǎn)育過程中，我們發(fā)現(xiàn)純合亞雞腳葉棉花與常態(tài)葉棉花雜交F1的葉形與純合亞雞腳葉也極易混淆，因此需要借助于分子標(biāo)記對其中的等位基因進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確鑒定不同葉形及其基因型。

基于插入缺失突變的共顯性標(biāo)記是區(qū)分純合和雜合基因型的理想標(biāo)記。圖位克隆分析發(fā)現(xiàn)L-D1位點是1個HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子基因，l2基因5’端非翻譯區(qū)、編碼區(qū)和3’端非翻譯區(qū)分別有6個、4個和1個特異性SNP，同時第3個外顯子含有1個8 bp缺失；L2o和L2s在5’端非翻譯區(qū)均含有1個特異性SNP和1個133 bp的重復(fù)序列[18-20]。為了獲得可能的差異序列，本研究克隆了4個等位基因起始密碼子上游4 kb左右的序列，經(jīng)測序：在l2中新發(fā)現(xiàn)16個SNPs和1個14 bp的插入。基于l2第3個外顯子中8 bp的缺失成功開發(fā)出l2特異分子標(biāo)記InDel_8；基于14 bp的插入（缺失）未開發(fā)出標(biāo)記，可能與其中脫氧腺苷酸含量較高有關(guān)（附圖1）。

在棉花育種過程中，分子標(biāo)記輔助選擇主要針對遺傳背景和關(guān)聯(lián)性狀。對遺傳背景的選擇是利用分子標(biāo)記對棉花新品種進(jìn)行復(fù)壯提純和純度檢驗[37-38]，而關(guān)聯(lián)性狀的分子標(biāo)記輔助篩選主要是基于基因定位、關(guān)聯(lián)分析或者圖位克隆獲得與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記或者功能標(biāo)記。雖然緊密連鎖的分子標(biāo)記可以提高攜帶目標(biāo)性狀單株的篩選效率[39-40]，但是由于交換的存在導(dǎo)致其篩選準(zhǔn)確率低于基于目標(biāo)基因內(nèi)部序列開發(fā)的功能標(biāo)記，因此功能標(biāo)記是進(jìn)行分子輔助選擇的理想標(biāo)記。本研究設(shè)計的功能標(biāo)記，可保證對相應(yīng)等位基因鑒定的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

L-D1位點的4個復(fù)等位基因可以調(diào)控棉花形成多種形態(tài)相似的葉片，本研究利用等位基因啟動子及編碼區(qū)的插入缺失突變、SNP開發(fā)了特異性分子標(biāo)記，可準(zhǔn)確鑒定4個等位基因，為L-D1等位基因的鑒定及其在棉花冠層改良中的育種應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

附件參見http://journal.cricaas.com.cn

附圖1L-D1等位基因啟動子序列比對分析

Fig.S1 Multiple sequence alignment of promotes ofL-D1alleles