基于隸屬函數(shù)法對不同基因型棉種萌發(fā)期抗氧化能力的綜合評價

王洪博，付媛媛，楊鴻基，孫文君，高陽，王興鵬*

（1.塔里木大學(xué)水利與建筑工程學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)田灌溉研究所，河南 新鄉(xiāng) 453000）

關(guān)鍵字：棉種萌發(fā)；環(huán)境脅迫；隸屬函數(shù)；聚類分析；抗氧化酶

2017年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所成功培育出適于新疆地區(qū)無膜直播的特早熟棉花新品種——中棉619。新品種的成功選育和無膜栽培技術(shù)取得的突破性進展，為解決棉田殘膜污染提供了可行的技術(shù)途徑[1]。在南疆地區(qū)，植物生長發(fā)育常受鹽漬、干旱、高低溫、強光照等不利因素的影響[2-4]，其中干旱[5]、低溫[6]和鹽漬[4]是植物生長最主要的逆境生態(tài)因子，顯著影響種子的萌發(fā)[7-8]。在環(huán)境脅迫或生物脅迫條件下，過量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在植物體內(nèi)造成氧化脅迫[5]，而植物利用超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過 氧 化 物 酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）等抗氧化酶促保護系統(tǒng)和非酶促保護系統(tǒng)清除植物體內(nèi)多余的活性氧，降低膜脂過氧化水平，減輕細胞膜受害程度[9-11]。

干旱脅迫會破壞植物體內(nèi)活性氧代謝平衡，引起膜脂過氧化[12]，對膜系統(tǒng)、細胞、器官甚至整株植物造成傷害[13]。抗旱性強的棉花品種的SOD活性隨著干旱處理時間延長而增加[14]，過表達SOD能提高植物對干旱、鹽漬等非生物脅迫的適應(yīng)性[15]，即抗氧化酶活性的提高可增強植物的綜合抗性[5]。鹽脅迫誘使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，導(dǎo)致活性氧代謝失衡，膜脂過氧化程度加重，膜結(jié)構(gòu)和功能被破壞，蛋白質(zhì)和葉綠素降解，從而降低植物光合性能[16]。然而，鹽脅迫下植物體內(nèi)合成累積的一些小分子有機物質(zhì)，如氨基酸、可溶性糖等可以減輕鹽脅迫對植物的傷害[17]。低溫逆境會導(dǎo)致植物多方面損傷，包括生物膜透性增大[18]、活性氧積累引起的氧化脅迫[19-20]、滲透調(diào)節(jié)失衡、多種蛋白質(zhì)變性，酶活性降低甚至喪失[21]。而植物在低溫逆境中會通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性[22]和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[23]增強植物抗逆性。棉花由覆膜種植轉(zhuǎn)為無膜種植，導(dǎo)致棉種萌發(fā)的外界環(huán)境發(fā)生改變。因此，本試驗以南疆膜下滴灌主栽品種新陸中37（具有適應(yīng)性好、抗性強的特點）為對照，研究了水、鹽、溫及其交互作用對無膜直播中棉619可溶性蛋白含量、淀粉酶及抗氧化保護酶活力的影響，評估其抗氧化能力，以期為抗旱、耐鹽及耐寒棉花品種選育和種植栽培提供依據(jù)，從而促進棉花無膜栽培技術(shù)的大面積推廣，進而解決地膜殘留問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019年在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物需水與調(diào)控重點實驗室進行。供試棉花品種為T1：中棉619（無膜滴灌主栽棉種）；T2：新陸中37（膜下滴灌主栽棉種）。選擇PEG（因素A）、NaCl（因素B）及溫度（因素C）3個主要環(huán)境因子，每個因子設(shè)置5個水平 （因素A1～A5：5.0%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0%（質(zhì)量分數(shù)，下同）；因素B1～B5：0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%；因素C1～C5：13℃、16℃、19℃、22℃和25℃），參考6因素5水平的L25（56）的正交表設(shè)計[24]，如表1所示。

表1 正交表Table 1 Orthogonal table

棉種消毒后在超純水中浸泡24 h，取出后剝掉種皮[25]，各處理挑選大小一致、籽粒飽滿的30粒種子播種于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿（經(jīng)150℃高溫滅菌2 h，底部鋪有2層經(jīng)酒精浸泡后風(fēng)干的濾紙）[26]，加入5m L處理液，以超純水為空白對照，置入不同溫度的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，自萌發(fā)后第4天給予光照，晝/夜時間為12 h/12 h。

1.2 測定指標(biāo)與方法

種子連續(xù)萌發(fā)8 d，其間每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，以胚根突破種皮長度達到種子長度的一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[27]，于第8天分3份收取培養(yǎng)皿內(nèi)所有胚芽，并利用南京生物建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶試劑盒（WST-1法）、過氧化物酶試劑盒（分光光度比色法）、過氧化氫酶試劑盒（鉬酸銨法）、可溶性蛋白試劑盒（BCA微板法）及β-淀粉酶試劑盒（分光光度比色法），按照試劑盒說明書要求操作，分別測定可溶性蛋白含量和SOD、POD、CAT、及淀粉酶的活力。

1.3 相關(guān)指標(biāo)的計算

（1）綜合指標(biāo)CIi參考程建權(quán)模糊數(shù)學(xué)建模[28]的方法計算：

式中：CI i表示第i個綜合指標(biāo)；Eij表示第i個主成分第j個單項指標(biāo)對應(yīng)的特征向量；Xj表示第j個單項指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值。

（2）隸屬函數(shù)μij、綜合指標(biāo)權(quán)重wj及綜合評價值D參照王賀正[29]的方法計算：

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：運用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對萌發(fā)指標(biāo)進行標(biāo)準(zhǔn)化，如公式（2）和（3）：

權(quán)重處理：采用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)法，計算標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)Vj，歸一化后得到各個萌發(fā)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)W j，如公式（4）：

綜合評價值D：棉種抗旱、耐鹽及生長綜合評價值D的計算，如公式（5）：

式中：μij表示i種類j指標(biāo)的隸屬值；Xij表示i種類j指標(biāo)的測定值；Xjmax、Xjmin分別表示指標(biāo)的最大值和最小值；Vj表示標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用M icrosoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 26軟件進行主成分程序運算及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境因子下棉種萌發(fā)的生理指標(biāo)直觀分析

由試驗指標(biāo)和平均值計算判斷試驗因素的優(yōu)水平和優(yōu)組合，根據(jù)極差計算判斷試驗因素的主次順序，本文以2種棉種可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶活性力7個生理指標(biāo)進行極差分析。由表2可知，不同水、鹽、溫脅迫組合下2個棉種生理指標(biāo)在呈現(xiàn)不同程度的變化，如中棉619棉種POD和SOD的活力分別在PEG濃度為5%、NaCl濃度為0.1%及溫度為25℃，PEG濃度為7.5%、NaCl濃度為0.6%及溫度為25℃時最高；而新陸中37棉種POD和SOD分別在PEG濃度為5%、NaCl濃度為0.2%及溫度為19℃，PEG濃度為5%、NaCl濃度為0.1%及溫度為16℃時活力最高。

表2 （續(xù)）Table 2(Continued)

表2 棉種萌發(fā)生理指標(biāo)的極差分析Table 2 Range analysis of physiological indexes of cotton seed germ ination

2.2 不同環(huán)境因子下棉種萌發(fā)生理指標(biāo)主成分分析

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進行主成分分析，用SPSS 26軟件進行主成分程序運算，得到樣本相關(guān)矩陣的特征向量和累計貢獻率，如表3所示。對于中棉619棉種而言，前2個主成分的貢獻率分別為74.4 7%和15.3 3%，表明PC1和PC2代表了原來7個單項指標(biāo)89.8 0%的變化。而對于新陸中37棉種而言，前2個主成分的貢獻率分別為75.2 2%和14.4 6%，表明PC1和PC2代表了原來7個單項指標(biāo)89.6 7%的變化。兩棉種可將原來的7個單項指標(biāo)轉(zhuǎn)換為2個新的相互獨立的綜合指標(biāo)，在2個新確定的綜合指標(biāo)中，中棉619棉種第1主成分中SOD、α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶的特征值較大，分別為0.44 、0.43 、0.43 及0.43 ，第2主成分中CAT的特征值最大，為0.86 。而新陸中37棉種第1主成分中SOD、β-淀粉酶及總淀粉酶的特征值較大，均為0.43 ，第2主成分中CAT的特征值最大，為0.99 。表明SOD和CAT指標(biāo)的貢獻率較大，影響程度較高，可作為棉種抗旱、耐鹽、耐寒性篩選的依據(jù)。

表3 各主成分的特征向量及貢獻率Table 3 The feature vector and contribution rate of each principal com ponent

2.3 不同環(huán)境因子下棉種萌發(fā)生理指標(biāo)綜合評價

棉種萌芽期各處理的綜合指標(biāo)、隸屬函數(shù)值、權(quán)重、綜合評價值和排序，如表4所示。中棉619棉種綜合評價值的變化范圍0.06 ～0.91 ，在PEG濃度為15%、NaCl濃度為0.4%及溫度為13℃時綜合評價值達到最高，而新陸中37棉種綜合評價值的變化范圍0.07 ～0.85 ，在PEG濃度為5%、NaCl濃度為0.4%及溫度為19℃時綜合評價值達到最高。表明在此環(huán)境下，可溶性蛋白含量較高，POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶活性達到最大值。

表4 萌芽期各處理的綜合指標(biāo)、隸屬函數(shù)值、權(quán)重、綜合評價值和排序Table 4 Com prehensive index,subordinate function value,weight,com prehensive evaluation value and ranking of each treatment in the germ ination stage

2.4 不同環(huán)境因子下棉種萌發(fā)生理指標(biāo)聚類分析

采用標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后的綜合評價值、歐氏距離及類平均法對各處理的生理指標(biāo)進行聚類分析，結(jié)果見圖1。以綜合評價值最高為依據(jù)，在距離為12時可將25種組合處理分為三大類。第一類（C1）可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶活性較高，中棉619包含4種組合，而新陸中37包含15種組合；第二類（C2）各組合抗氧化酶活性中等，中棉619包含14種組合，而新陸中37包含9種組合；第三類（C3）各組合抗氧化酶活性較低。較高的可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶活性，反映出棉種受逆境脅迫的程度較大。

圖1 棉種生理指標(biāo)的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of cotton seed physiological indicators

3 討論

當(dāng)植物受到外界環(huán)境脅迫時，可溶性蛋白含量及抗氧化保護酶活力等生理代謝指標(biāo)發(fā)生變化，常被用于評價作物的抗逆性[30]。本研究對2個棉種的可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶活力7個生理指標(biāo)進行極差分析，發(fā)現(xiàn)2個棉種的上述生理指標(biāo)在不同水、鹽、溫脅迫組合下呈現(xiàn)不同程度的變化，說明種質(zhì)資源間的抗性存在較大的差異[31]。同時，不同類型的脅迫下，棉種的生理生化指標(biāo)的表現(xiàn)也存在差異[32]，這是因為起主導(dǎo)作用的抗氧化酶活力有差異[33]。因此，要確切鑒定一個品種的抗性強弱，不能根據(jù)某個單一生理生化指標(biāo)或形態(tài)表現(xiàn)進行判定[34]，而應(yīng)根據(jù)多個指標(biāo)進行綜合分析。

主成分分析是數(shù)據(jù)降維的一種方法，既減少了變量的個數(shù)，又能體現(xiàn)變量間的內(nèi)在聯(lián)系。本研究對外界環(huán)境脅迫下2個棉種的7個單項指標(biāo)進行主成分分析，前兩個主成分累計貢獻率分別為89.8 0%（中棉619）和89.6 7%（新陸中37），其中主成分1分別解釋了中棉619 74.4 7%和新陸中37 75.2 2%的變化。通過主成分分析，發(fā)現(xiàn)SOD和CAT可以作為2個棉種抗旱、耐鹽、耐寒性的篩選指標(biāo)，這與胡根海等[33]的研究結(jié)果類似。有研究發(fā)現(xiàn)酶促保護系統(tǒng)中SOD是植物體內(nèi)ROS的清除劑，是ROS防御的第一道防線[35]，可催化O2－生成H2O2的歧化反應(yīng)[36]；CAT則直接催化H2O2生成H2O和O2，減少體內(nèi)過量ROS，降低膜脂過氧化水平[13]。

隸屬函數(shù)法通過無量綱化將各指標(biāo)都轉(zhuǎn)換為0～1的數(shù)值，從而將不同指標(biāo)放到了同一量級上，增強不同指標(biāo)間的可比性，可以較好地定量評價每個處理[37]。本研究通過隸屬函數(shù)法計算棉種萌發(fā)生理指標(biāo)的綜合得分，進行隸屬函數(shù)值比較，綜合評價值越大，表明棉種萌發(fā)生理指標(biāo)越強，對環(huán)境脅迫的抗性越高。對中棉619而言，PEG濃度為15%、NaCl濃度為0.4%及溫度為13℃時綜合評價值D達到最大，為0.91 。而新陸中37棉種在PEG濃度為5%、NaCl濃度為0.4%及溫度為19℃時綜合評價值D達到最大，為0.85 。中棉619在環(huán)境脅迫較嚴(yán)重時，生理指標(biāo)才表現(xiàn)為較高的強度，說明新陸中37棉種的抗旱及耐寒性均低于中棉619，對環(huán)境的適應(yīng)能力較差，這與孫小芳等[38]得出棉花萌發(fā)和生長的極限土壤含鹽量約為0.4%～0.6%的結(jié)論相一致。棉種在較嚴(yán)重的環(huán)境脅迫下仍能完成萌發(fā)進程，這是因為受到環(huán)境脅迫時，通過提高體內(nèi)抗氧化保護酶的活性，能有效地調(diào)節(jié)ROS代謝平衡，降低膜脂過氧化程度，保護膜結(jié)構(gòu)的完整性，增強其在環(huán)境脅迫下的抗氧化能力[39]。

聚類分析作為一種無管理模式的識別方法，可將相同或相似的一類進行劃分[40]。通過聚類分析將中棉619在25個處理下的抗氧化酶活性分成三類，其中處理1、8、19和23的可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及總淀粉酶活性較高。而較高的抗氧化酶活性反映了植株受到嚴(yán)重的外界環(huán)境脅迫，因此，C1類別的水、鹽、溫組合條件對中棉619造成較嚴(yán)重的脅迫。此外，植物對不同脅迫因素存在交叉適應(yīng)，例如，土壤鹽分及溫度可影響干旱脅迫對植物的傷害。土壤鹽分一方面導(dǎo)致植物細胞內(nèi)的離子積累[41]，有利于降低組織滲透勢、增強吸水動力，積累離子參與滲透調(diào)節(jié)；另一方面還可減少干旱條件下有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成所需的物質(zhì)和能量消耗，這對植物的水分代謝和同化物積累可能是有益的[5]。而在適宜的溫度條件下，干旱脅迫對種子發(fā)芽的抑制強度低于亞適溫和超適溫條件，通過激活體內(nèi)酶保護機制，累積滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)用以抵御水分脅迫，維持正常的生理代謝，緩解干旱對種子發(fā)芽的不利影響[42]。

4 結(jié)論

本文基于正交試驗、主成分分析、隸屬函數(shù)法及聚類分析，研究了水、鹽、溫及其交互作用等環(huán)境因子對無膜滴灌棉種及膜下滴灌棉種萌發(fā)時抗氧化系統(tǒng)的影響，得出SOD和CAT活性可以作為棉種抗旱、耐鹽、耐寒性篩選的依據(jù)。無膜滴灌棉種中棉619在PEG濃度為15%、NaCl濃度為0.4%及溫度為13℃時抗氧化酶活性達到最大，而新陸中37的抗氧化酶活性在PEG濃度為5%、NaCl濃度為0.4%及溫度為19℃時達到最大，表明中棉619抗氧化酶活性優(yōu)于膜下滴灌主栽棉種新陸中37，具有較高的抵抗環(huán)境脅迫的能力。