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    秦皮中香豆素提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

    2022-01-07 02:25:18童天嬌胥鑫萌李恒睿劉軍海
    保鮮與加工 2021年12期
    關(guān)鍵詞:秦皮香豆素提取液

    童天嬌,劉 偉,胥鑫萌,李恒睿,劉軍海

    (陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,陜西 漢中 723000)

    近年來國內(nèi)外學(xué)者在對(duì)秦皮的大量研究中發(fā)現(xiàn),秦皮具有極高的臨床藥用價(jià)值[1-2],秦皮的主要化學(xué)成分是香豆素[3]。白芷[4]、北沙參[5]等植物中都含有香豆素類成分,其多以糖類化合物的形式存在于植物器官中,如花、嫩葉、果實(shí)等,此外,在某些真菌中也發(fā)現(xiàn)有香豆素類成分存在[6]。香豆素類成分的生物活性極高,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)香豆素類成分對(duì)于多種人類頑疾[7]具有治療功效,且存在進(jìn)一步的研究價(jià)值。醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)香豆素對(duì)腫瘤、過敏、發(fā)炎具有一定的治療效果[8-13],香豆素還是一種天然抗氧化劑[14],可延緩人體的衰老,增強(qiáng)自身抵抗力。大量研究從生物化學(xué)分子構(gòu)成上闡述了天然香豆素的藥理功效,天然香豆素的母核不同位置的不同取代基對(duì)于其生物活性的影響起決定性作用[15]。秦皮甲素屬于香豆素類化合物,因此本文以秦皮甲素標(biāo)準(zhǔn)品[16]來研究提取總香豆素的含量。借助超聲波輔助法提取秦皮中香豆素,并對(duì)提取物進(jìn)行抗氧化性研究,以期為秦皮中香豆素的提取、開發(fā)以及綜合利用提供理論參考和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 材料與試劑

    秦皮,購自藥材店,符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定,無水乙醇(分析純,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7%);秦皮甲素對(duì)照品(分析標(biāo)準(zhǔn)級(jí),質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),酷爾生物科技有限公司。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    FW100 型高速萬能粉碎機(jī)、WGLL-230BE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司;BSA2245-CW型電子天平,維多利斯科學(xué)儀器(北京)公司;JP-010型數(shù)控超聲波清洗器,深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;722G 型紫外可見分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;LC-2030 型液相色譜儀,島津企業(yè)管理有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 原料預(yù)處理

    精確稱取秦皮粉末1.00 g,將其置于燒杯中,將乙醇作為提取溶劑,固定超聲功率100 W;超聲溫度50 ℃;超聲時(shí)間50 min;提取次數(shù)為3 次,用200 目紗篩進(jìn)行過濾,將濾液趁熱減壓抽濾,最后用乙醇定容于100 mL 容量瓶中,測定香豆素的含量并計(jì)算得率。

    1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.2.1 表面活性劑用量的篩選

    分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%(0.01 g)、3%(0.03 g)、5%(0.05g)、7%(0.07g)的表面活性劑十二烷基硫酸鈉,按“1.2.1”中的條件提取,研究不同表面活性劑用量對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

    1.2.2.2 乙醇濃度的篩選

    加入的乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%,按“1.2.1”中的條件提取,研究不同乙醇濃度對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

    1.2.2.3 提取溫度的篩選

    分別設(shè)定提取溫度為30、40、50、60、70 ℃,按“1.2.1”中的條件提取,研究不同提取溫度對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

    1.2.2.4 提取時(shí)間的篩選

    分別設(shè)定提取時(shí)間為20、30、40、50、60 min,按“1.2.1”中的條件提取,研究不同提取時(shí)間對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

    1.2.2.5 料液比的篩選

    用60%乙醇進(jìn)行提取,設(shè)置料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL),按“1.2.1”中的條件提取,研究不同料液比對(duì)秦皮香豆素得率的影響。

    1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    以提取時(shí)間、提取溫度、溶劑濃度、料液比為主要影響因素,以香豆素得率為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),試驗(yàn)因素與水平見表1。

    表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L9(34)orthogonal test factors and levels table

    1.2.4 香豆素得率的測定

    用電子天平稱取秦皮甲素標(biāo)準(zhǔn)品8 mg,用無水乙醇溶解定容至100 mL 的容量瓶中,制備成質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,然后分別量取2.5、5、7.5、10、12.5、15 mL,用無水乙醇定容到50 mL 的容量瓶中,搖勻后靜置,配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    色譜條件:C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液∶甲醇=1∶9 進(jìn)行洗脫,檢測波長:334nm,進(jìn)樣量:10 μL,柱溫:30 ℃,流速:0.6 mL/min,保留時(shí)間約為3 min,測定香豆素色譜峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到峰面積(Y)與香豆素質(zhì)量濃度X(μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=39 564.45 X-19 828.13,其中R2=0.999 53。按照香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定樣品色譜峰面積,按下式計(jì)算香豆素得率。

    式中:c 為香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的提取液濃度(mg/mL);v 為樣品溶液體積(mL);n 為稀釋倍數(shù);m為秦皮粉末質(zhì)量(mg)。

    1.2.5 抗氧化性試驗(yàn)

    1.2.5.1 DPPH 自由基清除率的測定

    參照謝佳函等[17]的方法,稍作修改。精密稱取DPPH 2.5 mg,用無水乙醇定容到100 mL 容量瓶中,取7支10mL 具塞試管,分別量取1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL 濃度為1.897 mg/mL 的香豆素提取液,分別加入2 mL 的DPPH 溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用,避光放置),搖勻后靜置30 min,用可見分光光度計(jì)測量吸光度值為A,波長調(diào)至517nm,以無水乙醇加DPPH 溶液為空白對(duì)照,記為A0;待測樣品和無水乙醇加DPPH 溶液的混合液為空白,記為B??瞻讓?duì)照中DPPH 的濃度與加入不同體積的香豆素提取液的濃度一致。VC 作為對(duì)照組。按下式計(jì)算清除率。

    1.2.5.2 羥自由基清除率的測定

    參照薛天樂[18]的方法,稍作修改。取7 支20 mL具塞試管依次加入0.5 mL 濃度為9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液,分別量取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL濃度為1.897 mg/mL 的香豆素提取液于試管中,加入0.5 mL 濃度為9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液、3.5 mL 蒸餾水,最后再加入5.0 mL 濃度為88 mmol/L 的雙氧水,搖勻,靜置15 min。待溶液反應(yīng)完全,于510 nm 處測定吸光度A,參比為蒸餾水。用0.5 mL 的蒸餾水代替雙氧水溶液測得的吸光度為B,參比為蒸餾水。用0.5 mL 的蒸餾水代替秦皮中香豆素提取液所測得的吸光度為A0,參比為蒸餾水。空白對(duì)照中DPPH 的濃度與加入不同體積的香豆素提取液濃度一致。VC 作為對(duì)照組。按“1.2.5.1”中公式計(jì)算清除率。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理

    使用Origin 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 香豆素提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 表面活性劑用量對(duì)秦皮香豆素得率的影響

    由圖1 可知,隨表面活性劑的增加,秦皮中香豆素得率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)表面活性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí),得率達(dá)到最大,這可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┧赜械碾p親分子結(jié)構(gòu)在香豆素提取過程中使表面張力降低,更容易讓乙醇滲入到香豆素中,內(nèi)擴(kuò)散速度加快。綜上考慮,表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%較為適宜。

    圖1 表面活性劑用量對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.1 Effects of surfactants additions on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

    2.1.2 乙醇濃度對(duì)秦皮香豆素得率的影響

    由圖2 可知,隨著乙醇濃度的增大,得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí),香豆素得率達(dá)到最高點(diǎn),這可能是因?yàn)?0%乙醇濃度的極性與香豆素的極性非常接近。所以,選擇60%的乙醇濃度較為適宜。

    圖2 乙醇濃度對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentrations on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

    2.1.3 提取溫度對(duì)秦皮香豆素得率的影響

    由圖3 可知,隨著溫度升高,得率先上升后下降,當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí),得率達(dá)到最高點(diǎn),而超過50 ℃開始下降??赡苁且?yàn)闇囟冗^高,當(dāng)接近或達(dá)到沸點(diǎn)時(shí),乙醇揮發(fā)變快,浸出過程難以穩(wěn)定,從而造成得率降低。另外,高溫條件下可能有更多的雜質(zhì)溶出,因此綜合考慮,選取50 ℃為較適宜的提取溫度。

    圖3 提取溫度對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

    2.1.4 提取時(shí)間對(duì)秦皮香豆素得率的影響

    由圖4 可知,隨著提取時(shí)間的延長,得率先上升后下降,提取時(shí)間為50 min 時(shí)得率最高,之后得率下降,這可能是因?yàn)槌暡ň哂袡C(jī)械剪切作用,長時(shí)間作用破壞了香豆素的結(jié)構(gòu),使得后續(xù)處理過程中秦皮香豆素?fù)p失而影響得率。因此,選擇提取時(shí)間為50 min 較為適宜。

    圖4 提取時(shí)間對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

    2.1.5 料液比對(duì)秦皮香豆素得率的影響

    由圖5 可知,在料液比(g/mL)為1∶5~1∶10 范圍內(nèi),秦皮香豆素得率呈上升趨勢,這可能是因?yàn)楫?dāng)秦皮質(zhì)量一定時(shí),溶劑用量越大,它的體系滲透壓就越大,香豆素越容易提取出來。但繼續(xù)增大溶劑用量,得率趨于下降,這是因?yàn)楫?dāng)提取溶劑用量增大到一定程度后,隨著提取的進(jìn)行,滲透壓變化減小,滲透壓的改變對(duì)香豆素提取不再有明顯的作用,當(dāng)溶劑用量過大時(shí),增加了超聲波破碎細(xì)胞的阻力,使細(xì)胞破碎程度開始下降,故降低了有效成分的提取。因此,綜合考慮,選取料液比1∶10(g/mL)較為適宜。

    圖5 料液比對(duì)秦皮香豆素得率的影響Fig.5 Effects of material-liquid ratios on extraction yields of coumarin from cortex fraxini

    2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    由表2 可知,秦皮中香豆素提取的最佳工藝條件為A2B1C1D2,即提取時(shí)間40 min、提取溫度60 ℃、乙醇濃度50%、料液比為1∶10(g/mL)。按此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),取平均值,得到秦皮中香豆素得率為1.038%。由表3 可知,4 種因素對(duì)得率的影響均不顯著。

    表2 超聲輔助提取秦皮香豆素L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9(34)orthogonal test results of ultrasonic-assisted extraction of coumarin from cortex fraxini

    表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

    2.3 香豆素抗氧化性研究結(jié)果

    2.3.1 香豆素提取液對(duì)DPPH 自由基的清除能力

    由圖6 可知,香豆素提取液對(duì)DPPH 自由基有較好的清除能力,隨著濃度的升高清除能力逐漸增強(qiáng),且顯著高于對(duì)照組VC 的清除率(P<0.05),當(dāng)溶液體積為3 mL 以后清除作用逐漸平穩(wěn)。香豆素提取液和VC 對(duì)DPPH 自由基都具有良好的清除能力,表明香豆素具有很好的抗氧化作用,相同濃度下對(duì)DPPH 自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

    圖6 香豆素提取液和VC 對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of coumarin extract and VC on DPPH free radicals

    2.3.2 香豆素提取液對(duì)羥自由基的清除能力

    由圖7 可知,香豆素提取液對(duì)羥自由基具有很強(qiáng)的清除能力,并且隨著樣品濃度升高其對(duì)羥自由基的清除作用加強(qiáng)。當(dāng)溶液體積增至2.5 mL 以后,VC 清除率趨于穩(wěn)定,香豆素提取液在3 mL 以后清除率趨于平穩(wěn),且在相同濃度下,樣品溶液羥自由基清除能力均顯著高于VC 溶液(P<0.05),說明香豆素提取液抗氧化活性高于VC 溶液。

    圖7 香豆素提取液和VC 對(duì)羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of coumarin extract and VC on hydroxyl radicals

    3 結(jié)論

    本文采用表面活性劑強(qiáng)化技術(shù),通過超聲波輔助提取秦皮中香豆素,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝。得到秦皮中香豆素的最佳提取工藝條件為:表面活性劑用量3%,提取時(shí)間40 min,提取溫度60 ℃,乙醇濃度50%,料液比1∶10(g/mL),平均得率為1.038%??寡趸囼?yàn)結(jié)果表明,秦皮中香豆素具有很好的抗氧化作用,相同濃度下樣品溶液對(duì)DPPH 自由基和羥自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

    本文選取十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑,對(duì)秦皮香豆素提取有強(qiáng)化作用,且成本較低,具有較好的發(fā)展前景,可為香豆素的提取以及秦皮的開發(fā)提供積極的參考價(jià)值。

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