基于表型性狀的核桃品種區(qū)分研究

趙 燦，莫 琰，劉傳菊，豁銀強(qiáng)，張 倩，楊 瑩，湯尚文,*

（1.湖北文理學(xué)院，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 襄陽 441057；3.襄陽市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 襄陽 441104）

核桃屬胡桃科胡桃屬，為世界著名的四大堅(jiān)果之一，在我國有著悠久的栽培歷史，是我國重要的栽培經(jīng)濟(jì)樹種[1]。核桃營養(yǎng)價(jià)值豐富，其加工品如干核桃、炒核桃（仁）、核桃油和核桃粉等廣受消費(fèi)者青睞。經(jīng)自然演變和人工培育，目前我國核桃種質(zhì)資源十分豐富，已有記載的無性系優(yōu)良品種（系）216 個(gè)，農(nóng)家實(shí)生良種164 個(gè)，優(yōu)良單株（系）486 個(gè)[2]。雖然在研究人員長期實(shí)踐下，我國已篩選出一批核桃優(yōu)良新品種，如溫185、魯香、綠嶺和香玲等，但各核桃產(chǎn)區(qū)因成本、管理等原因，核桃品種混雜、良莠不齊[3]。

從加工角度來看，不同品種核桃的加工適宜性差別很大，有些品種油脂含量高，適宜于加工核桃油；有些品種蛋白含量高，適宜于加工核桃蛋白飲料；有些核桃香味突出、口感酥脆，適宜于干制鮮食。如何準(zhǔn)確識(shí)別核桃品種、確定其加工適宜性以指導(dǎo)原料采購，是眾多中小核桃加工企業(yè)面臨的首要問題。有眾多研究人員采用分子標(biāo)記[4-6]、光譜法[7-8]、同位素法[9]、元素分析法[10]、X 射線[11]、營養(yǎng)成分分析[12]和表型性狀[13]等方法研究核桃種質(zhì)資源和產(chǎn)地的鑒定、分類。但DNA分子標(biāo)記等方法對(duì)于試驗(yàn)平臺(tái)和技術(shù)人員水平要求較高，普通加工企業(yè)難以具體操作。

眾多方法中通過表型性狀鑒定核桃品種是較為簡單易行的一種方法[13]，其通過簡單的測量和對(duì)外觀的觀察即可初步鑒定核桃品種。我國分別于2011 年和2016 年先后出臺(tái)了GB/T 26909—2011[14]《植物新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性測試指南 核桃屬》和NY/T 2935—2016[15]《核桃種質(zhì)資源描述規(guī)范》，兩份文件均以表型性狀為主要指標(biāo)給出了核桃種質(zhì)資源描述的方法，其對(duì)于核桃種質(zhì)的鑒定具有指導(dǎo)性的作用。但兩份標(biāo)準(zhǔn)中均有大量指標(biāo)需要通過研究人員的主觀觀察進(jìn)行確定，例如堅(jiān)果形狀、縫合線、核殼溝紋、核殼刻窩、取仁難易程度等，這些指標(biāo)的判定會(huì)由于觀察人員的經(jīng)驗(yàn)和主觀性產(chǎn)生較大的差異。

鑒于上述問題，本文擬從核桃表觀性狀中挑選一批能夠客觀測量的指標(biāo)，結(jié)合主成分分析法和聚類分析法研究不同品種核桃的差異，建立基于表型性狀的核桃品種區(qū)分方法，以期為核桃加工廠提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)測試核桃均由襄陽金康園農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，其中綠嶺核桃（LL）由公司在保康收購，溫185 核桃（W）、新新2 號(hào)（XX）采購于新疆，大泡核桃（DP）采購于云南，綿核桃（M）采購于山西。脂肪和蛋白質(zhì)測定所用試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

K1100 全自動(dòng)凱氏定氮儀和SOX406 索氏提取儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；MS-70 快速水分測定儀，日本AND 公司；OXITEST 油脂氧化測定儀，意大利VELP 公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃形態(tài)數(shù)據(jù)采集

1.2.1.1 單果質(zhì)量、果仁質(zhì)量和出仁率

參照NY/T 2935—2016[15]采用稱重計(jì)算核桃堅(jiān)果的單果質(zhì)量、果仁質(zhì)量和出仁率。不同樣品隨機(jī)選取10 個(gè)堅(jiān)果，手工去殼取出核桃仁，稱核桃單果質(zhì)量和果仁質(zhì)量，并計(jì)算出仁率。

出仁率（%）=m1/m2×100式中：m1為果仁質(zhì)量，g；m2為核桃單果質(zhì)量，g。

1.2.1.2 核桃單果3 徑測量

參照文獻(xiàn)[16]的方法，各樣品隨機(jī)選取10 個(gè)堅(jiān)果，使用游標(biāo)卡尺，按圖1 所示量取核桃3 徑。核桃堅(jiān)果中部胴部之間的距離記為側(cè)徑D1，核桃堅(jiān)果中部縫合線之間的距離記為橫徑D2，核桃堅(jiān)果頂部與底部之間的距離記為縱徑H，側(cè)徑、橫徑、縱徑的3 徑平均值為A。以上單位均為mm。

圖1 核桃測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of walnut measurement

1.2.2 測定項(xiàng)目與方法

水分含量：參照GB 5009.3—2016[17]中第一法（直接干燥法）規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行測定。

脂肪含量：參照GB 5009.6—2016[18]中第一法（索氏抽提法）規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行測定。

蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2016[19]中第一法（凱式定氮法）規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行測定。

由于單個(gè)核桃仁質(zhì)量在6～10 g 的樣品量較少，水分、蛋白、脂肪檢測時(shí)將多個(gè)核桃仁混合后進(jìn)行檢測，脂肪和蛋白質(zhì)含量測定后折算成干物質(zhì)含量表示，單位為g/100 g 干物質(zhì)。

1.2.3 核桃氧化誘導(dǎo)期測試

核桃去殼后研磨混合均勻稱取10 g 樣品，放入樣品盤平鋪后密封，向樣品倉充入純氧至氧壓為600 kPa，測試溫度設(shè)置為90 ℃。每種核桃平行測試3 次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 2018 計(jì)算及進(jìn)行顯著性分析，表示方法為±s；主成分分析和聚類分析采用Origin 2018（Principal Component Analysis 插件和Heat Map with Dendrogram 插件）進(jìn)行分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃外觀形貌分析

圖2 為供試5 種核桃的外觀形貌。根據(jù)NY/T2935—2016[15]中所述方法，對(duì)5 種核桃表型差異進(jìn)行觀察并描述。DP 核桃在外觀上與其他4 種有明顯不同，核桃堅(jiān)果形狀為方圓形，截面呈橢圓形，果頂有明顯凹陷，核桃仁呈圓形；顏色較深，果形較??；表面核殼溝紋密集，核殼刻窩較深。W、LL、XX 和M 核桃在果實(shí)表型上較為接近，但亦有細(xì)微差別。XX 核桃果頂較平，M核桃堅(jiān)果形狀為長橢圓形，W 核桃相對(duì)LL、XX 和M3 核殼溝紋密集且核殼刻窩較深。根據(jù)核桃果實(shí)表型形狀對(duì)核桃進(jìn)行分類和鑒定雖然簡便易行，但受觀察人員主觀判斷因素影響較大，不同觀察人員對(duì)同一核桃果實(shí)外觀表型的觀察結(jié)果很可能各不相同。

圖2 五種核桃外觀形貌Fig.2 The appearance morphology of five kinds of walnuts

2.2 核桃表型及成分分析

為方便在加工前對(duì)核桃品種進(jìn)行準(zhǔn)確辨識(shí)，對(duì)5 種核桃的D1、D2、H、A、D1/D2、D1/H、D2/H、m1、m2和m1/m2共10 項(xiàng)表型數(shù)據(jù)以及蛋白質(zhì)和脂肪含量進(jìn)行了測量和計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 核桃表型及成分?jǐn)?shù)據(jù)Table 1 Phenotype and composition data of walnuts

表1 中表型數(shù)據(jù)均為單個(gè)核桃的測量和計(jì)算數(shù)據(jù)。由表1 可以看出，DP 核桃的3 徑平均值A(chǔ)、橫徑D2和縱徑H 均顯著低于其他品種（P＜0.05）；W 和LL核桃的側(cè)徑D1、3 徑平均值A(chǔ) 和單果質(zhì)量m2相近，均顯著高于其他3 個(gè)品種（P＜0.05）；W 核桃的橫徑D2、橫縱徑比D2/H、果仁質(zhì)量m1和出仁率m1/m2以及LL核桃的縱徑H 顯著高于其他品種（P＜0.05）；W 核桃脂肪含量顯著低于其他品種（P＜0.05），LL 核桃的脂肪以及蛋白含量較高。從商品屬性上來說，較大的單果尺寸和出仁率有利于核桃的銷售[20-21]，蛋白和脂肪含量較高也意味著營養(yǎng)價(jià)值高，因此W 核桃和LL 更適合于作為商品化品種。

2.3 核桃表型數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）

核桃的表型性狀數(shù)據(jù)通過簡單的測量取和稱量即可獲得，操作簡單易行。對(duì)5 種核桃的10 項(xiàng)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和計(jì)算后，采用主成分分析法（PCA）和系統(tǒng)聚類分析法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（核桃脂肪和蛋白含量未納入PCA 和聚類分析基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，主要由于這兩種統(tǒng)計(jì)方法要求由同一樣品完成所有測試指標(biāo)數(shù)據(jù)采集，相互間才有可比較性，但單個(gè)核桃仁質(zhì)量僅為6～10 g，樣品質(zhì)量達(dá)不到重復(fù)檢測3 次的要求），以期能通過簡單的表型數(shù)據(jù)對(duì)核桃進(jìn)行分類和鑒定，結(jié)果見表2～4 及圖3～4。

PCA 分析法可將原來有一定相關(guān)的指標(biāo)重新組合成一組相互無關(guān)的綜合指標(biāo)來明確度量各個(gè)指標(biāo)的重要性[22]，以找出核桃表型分類的主要貢獻(xiàn)因子。從表2 可知，前3 個(gè)主成分因子提取特征值均大于1[23]，且累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到93.079%，能夠覆蓋試驗(yàn)樣本的大部分表型信息。因此確定提取前3 個(gè)主成分因子進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

表2 核桃表型數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)因子特征值和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 2 Evaluation factor eigenvalues and cumulative variance contribution rates of walnuts phenotypic data

由表3 可知，D2、A 和m1等指標(biāo)在第1 主成分（PC1）上有較高的載荷（一般認(rèn)為因子載荷絕對(duì)值大于0.5 表明該變量對(duì)提取的主成分有較大貢獻(xiàn)，下同），說明第1 主成分主要涵蓋與核桃尺寸和質(zhì)量相關(guān)的信息，可將其歸納為核桃大小信息（貢獻(xiàn)率為53.712 7%）；D1/H 和D2/H 在第2 主成分（PC2）上有較高的載荷，因D1/H 和D2/H 均為計(jì)算數(shù)據(jù)，從數(shù)據(jù)意義上可反映出核桃縱向剖面的形狀，因此可將其歸納為核桃縱向形狀信息（貢獻(xiàn)率為26.866 7%）；D1/D2在第3 主成分（PC3）上有較高的載荷，D1/D2可反映出核桃橫向截面的形狀，可將其歸納為核桃橫向形狀信息（貢獻(xiàn)率為12.499 4%）。

表3 核桃表型數(shù)據(jù)初始因子載荷和特征向量Table 3 Initial factor loads and eigenvectors of walnuts phenotypic data

將D1、D2、H、D1/D2、D1/H、D2/H、A、m1、m2和m1/m2共10 個(gè)指標(biāo)原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后分別用X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10表示，經(jīng)主成分分析建立核桃表型信息模型，得到如下線性關(guān)系式，式中F1、F2和F3表示3 個(gè)主成分的得分值，F(xiàn) 為綜合得分，各主成分系數(shù)由表2 中特征值計(jì)算得出。

根據(jù)表3 推測，F(xiàn)1（核桃大小）正向取值越大，核桃尺寸越大，核桃仁質(zhì)量越大；F2（核桃縱向形狀）正向取值越大，核桃縱向剖面越趨向于圓形，取值越小，果形越長；F3（核桃橫向形狀）正向取值越大，核桃橫向剖面越趨向于橢圓形，取值越小，截面越圓。

提取PC1、PC2、PC3 主成分繪制主成分得分圖，如圖3 所示。從圖3 可以看出，W 核桃在PC1 正向取值上分布較多，說明W 核桃尺寸大、核桃仁質(zhì)量大；DP 核桃在PC1 負(fù)向取值上分布較多，說明DP 核桃尺寸小、核桃仁質(zhì)量?。籛 核桃在PC2 正向取值和PC3 負(fù)向取值上分布較多，說明W 核桃形狀呈圓球形；DP 核桃在PC2 正向取值和PC3 正向取值上分布較多，說明DP 核桃形狀呈扁橢圓形；LL 核桃在PC3正向取值上分布較多，XX 核桃在PC2 負(fù)向取值和PC3 負(fù)向取值上分布較多，M 核桃在PC2 負(fù)向取值上分布較多，說明LL、XX 和M 3 種核桃形狀呈長橢圓形。從圖3 亦可看出，圖中橢圓形區(qū)域?yàn)椴煌贩N核桃表型數(shù)據(jù)PCA 因子的95%置信區(qū)間，圖中各橢圓區(qū)域均有交集，說明未能完全分離不同品種。由上可知，僅靠核桃表型數(shù)據(jù)很難將不同品種完全分離。

圖3 核桃表型數(shù)據(jù)主成分得分圖Fig.3 Principal component scores of walnuts phenotypic data

按上述模型分別計(jì)算提取3 個(gè)主成分的得分及綜合得分，結(jié)果見表4。F1、F2和F3得分最高的分別為W、W/DP 和LL 核桃，綜合得分F 最高的為W 核桃，其次為LL 核桃。說明，W 和LL 核桃從表型數(shù)據(jù)上看具有更好的商品屬性。

表4 核桃表型數(shù)據(jù)主成分綜合得分及排序Table 4 Comprehensive scores and ranking of principal components in walnuts phenotypic data

2.4 核桃表型數(shù)據(jù)的系統(tǒng)聚類分析

對(duì)5 種核桃本的10 項(xiàng)表型數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類方法采用平均法，距離類型采用歐氏距離，聚類熱圖如圖4 所示。圖中顏色由綠到紅表示指標(biāo)值由低到高，顏色越紅代表指標(biāo)值越高，顏色越綠代表指標(biāo)值越低。

圖4 核桃表型數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類分析圖Fig.4 Systematic cluster analysis diagrams of walnuts phenotypic data

由圖4 可以看出，在歐氏距離為3.309 2～4.295 2時(shí)，可將50 個(gè)樣本分為4 類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），每類分別含5、10、28 和7 個(gè)樣本；在歐氏距離為4.295 2～4.863 5 時(shí)，可分為3 類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ），每類分別含5、10 和35 個(gè)樣本；在歐氏距離大于4.863 5 時(shí)，可分為2 類（Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ），每類分別含5 和45 個(gè)樣本。但無論歐氏距離如何取值劃分，DP 核桃在表型數(shù)據(jù)聚類中均可自成一類，與其他4 種核桃在表型上有顯著性差異，其他品種核桃單果樣本聚類分析結(jié)果相互混雜，無法有效區(qū)分。且D1/D2和D1/H 兩個(gè)指標(biāo)在DP核桃上顯著高于其他品種，這兩個(gè)指標(biāo)較高代表DP核桃在外型上趨近于扁橢圓形。

對(duì)于10 個(gè)表型數(shù)據(jù)指標(biāo)，在歐氏距離為6.129 7～8.132 8 時(shí)，可將指標(biāo)分為3 類（Ⅰ#、Ⅱ#、Ⅲ#）；在歐氏距離＞8.132 8 時(shí)，可將指標(biāo)分為2 類（Ⅰ#、Ⅱ#+Ⅲ#）。其中Ⅰ#可解釋為核桃大小信息，Ⅲ#可解釋為核桃形狀信息，這與前述PCA 分析結(jié)果類似。但Ⅱ#中形狀（D2/H）和質(zhì)量信息（m1/m2）均存在，單獨(dú)作為一類指標(biāo)進(jìn)行分析較為牽強(qiáng)，可將10 個(gè)指標(biāo)按Ⅰ#和Ⅱ#+Ⅲ#兩類進(jìn)行分類，Ⅰ#代表核桃大小信息，Ⅱ#+Ⅲ#代表核桃形狀信息。

2.5 核桃的氧化曲線及氧化誘導(dǎo)期

干制核桃水分降低至安全水分含量之下時(shí)即可長期貯藏[24]，但由于核桃油脂含量豐富，在較長的貯藏期內(nèi)會(huì)逐漸被氧化，影響其食用品質(zhì)。采用油脂氧化測定儀繪制不同品種核桃的加速氧化曲線，同時(shí)推算其氧化誘導(dǎo)期。氧化誘導(dǎo)期從側(cè)面反映了核桃的耐貯藏性，誘導(dǎo)期越長說明其貯藏性越好[25]。圖5 為核桃的加速氧化曲線和5 種核桃的氧化誘導(dǎo)期，圖中Y1和Y2的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)間即為氧化誘導(dǎo)期。氧化曲線分為兩個(gè)階段：Ⅰ階段在測試開始至誘導(dǎo)期這段時(shí)間內(nèi)，油脂緩慢吸收氧氣形成過氧化物；Ⅱ階段從誘導(dǎo)期時(shí)間點(diǎn)開始，油脂迅速吸收氧氣，過氧化物形成的同時(shí)由于高溫的影響迅速分解[26]。從圖中可以看出DP 核桃誘導(dǎo)期顯著大于其他4 種核桃（P＜0.05），其次為W、XX 和LL/M 核桃。

圖5 核桃的加速氧化曲線（A）和5 種核桃的氧化誘導(dǎo)期（B）Fig.5 Accelerated oxidation curves of walnuts and oxidation induction periods of five kinds of walnuts

2.6 表型、成分和氧化誘導(dǎo)期綜合聚類分析

以D1、D2、H、A、D1/D2、D1/H、D2/H、m1、m2、m1/m2、脂肪、蛋白質(zhì)和氧化誘導(dǎo)期共13 項(xiàng)指標(biāo)的平均值為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步采用聚類分析法直觀地反映不同核桃指標(biāo)間的差異，結(jié)果見圖6。

由圖6 可以看出，DP 核桃在D1/D2、D1/H、氧化誘導(dǎo)期和脂肪共4 項(xiàng)指標(biāo)上顯著高于其他品種，在D2、A 和H 共3 項(xiàng)指標(biāo)上顯著低于其他品種；W 核桃在D2、m1、D2/H 和m1/m2共4 項(xiàng)指標(biāo)上顯著高于其他品種，在脂肪指標(biāo)上顯著低于其他品種；LL 和XX 核桃在蛋白質(zhì)指標(biāo)上顯著高于其他品種；XX 核桃在D1和D1/H 共2 項(xiàng)指標(biāo)上顯著低于其他品種；M 核桃在蛋白質(zhì)含量上顯著低于其他品種。

圖6 核桃的聚類熱圖Fig.6 Clustering heat maps of walnuts

在歐氏距離小于2.805 1 時(shí)，5 種核桃可以很好地被區(qū)分；歐氏距離在2.805 1～3.338 3 時(shí)，5 種核桃被分為4 類，其中M 和XX 核桃被歸為一類；歐氏距離在3.338 3～5.122 5 時(shí)，核桃被分為3 類，其中M、XX 和LL 核桃被歸為一類；歐氏距離大于5.122 5時(shí)，除DP 核桃外，其他核桃歸為一類。說明表型（尺寸、質(zhì)量、成分）和氧化特性指標(biāo)相結(jié)合可有效區(qū)分不同品種的核桃。

所有檢測指標(biāo)在歐式距離大于2.812 4 時(shí)被分為兩類。D1、D2、H、A、D2/H、m1、m2、m1/m2和蛋白質(zhì)共9 個(gè)指標(biāo)被分為一類，這類指標(biāo)主要和核桃大小及蛋白質(zhì)含量有關(guān)；D1/D2、D1/H、脂肪和氧化誘導(dǎo)期共4 個(gè)指標(biāo)被分為一類，這類指標(biāo)主要和核桃形狀及脂肪含量、組成（脂肪組成與氧化誘導(dǎo)期相關(guān)）有關(guān)。

3 結(jié)論

（1）采用核桃表型數(shù)據(jù)對(duì)核桃品種進(jìn)行區(qū)分，其操作簡便易行，經(jīng)PCA 分析，結(jié)果表明：采用主成分得分圖無法直觀有效地區(qū)分核桃品種，但采用主成分綜合評(píng)分法可對(duì)不同品種核桃的商品屬性進(jìn)行評(píng)分和排序，5 種核桃中W 和LL 核桃具有較好的商品屬性。

（2）將表型（尺寸、質(zhì)量、成分）和氧化特性指標(biāo)相結(jié)合，采用系統(tǒng)聚類分析，通過聚類熱圖可直觀反映不同品種核桃的指標(biāo)差異，能有效區(qū)分不同品種核桃。

（3）采用PCA 和系統(tǒng)聚類法區(qū)分不同品種核桃時(shí)，數(shù)據(jù)的采集以單個(gè)核桃為基本單元進(jìn)行采集，尺寸和質(zhì)量等數(shù)據(jù)采集較為簡單，但水分、脂肪、蛋白質(zhì)和氧化誘導(dǎo)期等數(shù)據(jù)采集需要較多的樣品量，單個(gè)核桃仁不能滿足檢測量的需求。后續(xù)研究中可采用隨機(jī)抽樣方法擴(kuò)大樣本數(shù)量，將不同品種的核桃隨機(jī)分為多份，每一份進(jìn)行數(shù)據(jù)采集取平均值后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。