不明原因心臟性猝死相關(guān)分子標(biāo)志物研究進(jìn)展及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

何享旺，李林峰，張付，云利兵

1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.廣東省公安廳法醫(yī)病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510050

心臟性猝死（sudden cardiac death，SCD）[1]被定義為：機(jī)體各方面（心血管系統(tǒng)除外）無(wú)異常表現(xiàn)的個(gè)體在癥狀發(fā)作的1 h 內(nèi)或24 h 內(nèi)他人目擊其身體狀態(tài)正常情況下突然發(fā)生死亡。其中一些案例通過(guò)涵蓋組織學(xué)和毒理學(xué)檢測(cè)的全面尸體檢驗(yàn)，仍無(wú)法確定死亡原因，稱為不明原因心臟性猝死（unexplained sudden cardiac death，USCD），此類案例約占SCD 的40%，通常表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)無(wú)異常，且高發(fā)于年輕人，夜間（18:00—06:00）居多[1]。

探尋SCD 的原因一直都是醫(yī)學(xué)研究和法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐所面臨的挑戰(zhàn)，特別是USCD 的鑒定還存在相當(dāng)程度的困難：目擊信息多缺乏或準(zhǔn)確性有限，易被誤認(rèn)為暴力性死亡；相關(guān)的疾病譜廣，既有心肌、血管等形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，也有電生理紊亂所致的節(jié)律失常等功能紊亂；部分遺傳性因素已獲證實(shí)，卻也存在疾病外顯率差異較大的不確定因素。已有研究[2-4]力圖從多方面探明其機(jī)制，不僅從組織學(xué)層面解釋了心臟肥大、心臟瓣膜病等與SCD 的相關(guān)性，也結(jié)合法醫(yī)病理學(xué)系統(tǒng)檢驗(yàn)心臟的案例進(jìn)一步考量了存在的風(fēng)險(xiǎn)因素。近期人群調(diào)查[5]發(fā)現(xiàn)，成癮性藥物和精神病類藥物與年輕群體的SCD 案例存在明顯相關(guān)性；當(dāng)組織病理學(xué)和毒理學(xué)檢測(cè)等方法無(wú)法明確死因時(shí)，對(duì)相關(guān)分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，為識(shí)別USCD 提供了新的探究路徑。本文從分子病理學(xué)角度出發(fā)，結(jié)合DNA、RNA、蛋白質(zhì)與USCD 的相關(guān)性，對(duì)最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為USCD 的法醫(yī)學(xué)鑒定及研究提供借鑒。

1 USCD 相關(guān)基因的突變

1.1 心臟離子通道蛋白的編碼基因突變

部分USCD 系離子通道蛋白異常所致的遺傳性心律失常引發(fā)，有研究[6]探索了此類被稱作離子通道病相關(guān)蛋白的編碼基因所發(fā)生的突變及其功能紊亂機(jī)制。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了長(zhǎng)QT 間期綜合征、Brugada 綜合征和兒茶酚胺敏感性多形性室性心動(dòng)過(guò)速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia，CPVT）等遺傳性心律失常的致病基因，如涉及長(zhǎng)QT 間期綜合征主要亞型的KCNQ1 和KCNH2 等基因突變，與Brugada 綜合征相關(guān)且與長(zhǎng)QT 間期綜合征存在關(guān)聯(lián)的SCN5A基因，與CPVT 相關(guān)的RYR2基因突變等[7]。2019 年國(guó)內(nèi)學(xué)者[8]研究USCD 案例發(fā)現(xiàn)，編碼膜通道蛋白的HCN4基因存在新的無(wú)義突變c.1578C＞T，進(jìn)一步驗(yàn)證了心臟離子通道病在USCD中扮演的重要角色。

圍繞部分基因突變的致病機(jī)制及功能驗(yàn)證開(kāi)展的研究亦獲得了進(jìn)展，如SCN5A基因，該基因位于人類3 號(hào)染色體（3p21），擁有28 個(gè)外顯子，主要編碼心臟鈉離子通道NaV1.5 的α 亞基，參與心臟動(dòng)作電位的形成過(guò)程，其突變會(huì)引發(fā)鈉離子通道功能亢進(jìn)或功能減退，從而導(dǎo)致心臟電生理的異常[9]。通過(guò)系統(tǒng)整理SCN5A基因突變的位點(diǎn)、人群特點(diǎn)、臨床及實(shí)驗(yàn)室表現(xiàn)等特征[10]，Meta 分析亦表明攜帶已知突變基因SCN5A的Brugada 綜合征患者具有更早發(fā)病、更高比例的心電圖異常、更顯著的心臟節(jié)律傳導(dǎo)或心臟動(dòng)作電位復(fù)極化異常及更嚴(yán)重的心臟損傷[11]。最新研究[12]發(fā) 現(xiàn)，NaV1.5蛋白脯氨酸-酪氨酸（prolinetyrosine，PY）模體是泛素連接酶Nedd4-2 識(shí)別的位點(diǎn)，SCN5A基因突變導(dǎo)致的PY 模體改變將影響NaV1.5 蛋白的降解效率，可能是功能蛋白異常的潛在機(jī)制之一。除此之外，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)心電圖Q-T 間期特性研究[13]，發(fā)現(xiàn)其與SCN5A基因順式作用元件的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）相關(guān)，即SCN5A基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等的SNP 將影響其與反式作用因子的結(jié)合強(qiáng)度，進(jìn)而對(duì)最終基因表達(dá)產(chǎn)生影響。

1.2 心肌細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)蛋白的基因變異

隨著分子病理學(xué)研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的基因突變被發(fā)現(xiàn)與SCD 相關(guān)，并且已不再局限于編碼離子通道蛋白的基因。2018 年的研究從一個(gè)大家族中發(fā)現(xiàn)編碼橋粒蛋白（desmoplakin，DSP）基因的框內(nèi)缺失突變（c.243_251del CTTGATGCG）與該家族連續(xù)三代人出現(xiàn)雙室心律失常致SCD 相關(guān)[14]，同年也發(fā)現(xiàn)心肌閏盤相關(guān)的Xrip 蛋白變異與USCD 相關(guān)[15]。隨后對(duì)SCD的研究又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了編碼核纖層蛋白的LMNA基因的無(wú)義突變、NEXN基因非編碼區(qū)的突變、線粒體DNA 的突變[16-18]；其中LMNA基因編碼核纖層蛋白A和C（lamin A/C）還參與細(xì)胞核完整性的維持及DNA的翻譯活動(dòng)。最新研究[19]發(fā)現(xiàn)，LMNA基因K219T 突變會(huì)促進(jìn)lamin A/C 與SCN5A基因增強(qiáng)子的結(jié)合，通過(guò)阻礙轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成抑制SCN5A基因的表達(dá)，從而影響心肌細(xì)胞鈉離子內(nèi)流電流。高通量測(cè)序的應(yīng)用極大提高了可疑致病性基因變異的發(fā)現(xiàn)，已有研究[20]通過(guò)創(chuàng)建USCD 分子病變譜，實(shí)現(xiàn)了20%左右的USCD 分子病因的解析?；诟髽颖玖块_(kāi)展USCD 的高通量分子病理學(xué)研究，有利于更全面闡釋致病基因，也將推動(dòng)系統(tǒng)的功能學(xué)驗(yàn)證及猝死機(jī)制分析。

致病基因突變研究領(lǐng)域的快速發(fā)展極大豐富了候選基因庫(kù)[21]，目前逾百個(gè)致病基因的數(shù)千個(gè)突變位點(diǎn)已見(jiàn)諸報(bào)道，將其用于闡釋USCD 的嘗試也相繼開(kāi)展（表1）。2016 年一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查對(duì)USCD 案例的4 個(gè)基因（KCNQ1、KCNH2、SCN5A和RYR2）進(jìn)行分子解剖分析，僅9%案例被確診存在基因變異；在此基礎(chǔ)上額外分析了55 個(gè)被認(rèn)為與心臟疾病相關(guān)的基因（包括心律失常、長(zhǎng)Q-T 間期綜合征和心肌病的相關(guān)基因），最終有27%的案例可確診基因突變[1]。2019年開(kāi)展的SCD 案例調(diào)查檢測(cè)了100 個(gè)心臟疾病相關(guān)基因，僅在16%的案例中找到基因異常[22]；絕大部分案例無(wú)法確診，凸顯了候選基因的結(jié)構(gòu)和功能、相互間的復(fù)雜作用尚待闡明。

表1 USCD 相關(guān)致病基因Tab.1 USCD-related pathogenic genes

2 檢測(cè)USCD 相關(guān)的蛋白質(zhì)分子

功能基因突變所致異常最終可影響其表達(dá)蛋白質(zhì)的含量，而常規(guī)的法醫(yī)病理學(xué)研究已利用免疫組織化學(xué)技術(shù)直接檢測(cè)相關(guān)功能基因產(chǎn)物的表達(dá)情況。心肌細(xì)胞的肌鈣蛋白Ⅰ、肌球蛋白輕鏈3、腦利尿鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）等應(yīng)用于鑒定USCD 的價(jià)值已被許多研究關(guān)注[34-35]。缺血修飾白蛋白（ischemia modified albumin，IMA）、脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP）和窖蛋白在SCD法醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值已有學(xué)者進(jìn)行了詳細(xì)論述[36-37]。此外，核孔蛋白107（nucleoporin 107）在不影響心肌細(xì)胞SCN5A基因表達(dá)及其mRNA 穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，通過(guò)促進(jìn)核質(zhì)轉(zhuǎn)移增加SCN5A的表達(dá)，在缺血缺氧致心肌損傷中通過(guò)增加NaV1.5 表達(dá)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[38]。

2.1 氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的異常

SCD 相關(guān)的臨床研究結(jié)果為法醫(yī)病理學(xué)分子解剖提供了可靠的依據(jù)和思路。機(jī)體氧化應(yīng)激失衡被認(rèn)為是導(dǎo)致自主神經(jīng)功能紊亂的機(jī)制之一，對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛患者進(jìn)行的臨床研究發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸血清水平升高、相關(guān)抗氧化物（白蛋白和膽紅素）的血清水平降低與低心率變異性（heart rate variability，HRV）有關(guān)，而低HRV 往往提示心搏節(jié)律異常、心血管抗壓能力差和心血管疾病死亡率高[39]。各類研究結(jié)果提示[40-41]：機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)可通過(guò)改變自主神經(jīng)功能來(lái)影響心肌節(jié)律，其相關(guān)標(biāo)志物對(duì)SCD 的作用值得深入探討。另有臨床研究[42]印證了血清白蛋白對(duì)SCD 的作用，校正其他SCD 的危險(xiǎn)因素后，患有低蛋白血癥的急性心肌梗死者發(fā)生院內(nèi)SCD 的風(fēng)險(xiǎn)是白蛋白水平正?；颊叩?.688 倍，并認(rèn)為血清白蛋白水平與機(jī)體炎癥負(fù)擔(dān)、冠狀動(dòng)脈病變程度等相關(guān)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）可抑制線粒體活性氧自由基的產(chǎn)生，同時(shí)降低NaV1.5 乙?；暗鞍准っ窩（protein kinase C，PKC）介導(dǎo)的磷酸化水平，共同效應(yīng)表現(xiàn)為增加細(xì)胞鈉離子電流，同時(shí)揭示了NAD+合成的前體物質(zhì)具有預(yù)防缺血性心律失常的潛在作用[43]?，F(xiàn)階段尚缺乏證實(shí)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白可應(yīng)用于SCD 法醫(yī)學(xué)鑒定的充分依據(jù)。

2.2 免疫相關(guān)蛋白的異常

關(guān)于人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者高發(fā)SCD 的現(xiàn)象，研究者發(fā)現(xiàn)，HIV 的感染狀態(tài)及部分治療藥物會(huì)大大增加患者發(fā)生心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，且實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α 和白介素-1β 的濃度升高會(huì)影響心肌細(xì)胞的離子流，從而導(dǎo)致心律失常[44]。同時(shí)，自身抗體也被認(rèn)為在USCD 中扮演著重要的角色：由于人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）與心肌細(xì)胞膜上腎上腺激素β 受體和乙酰膽堿M 受體存在共同的抗原表位，導(dǎo)致HPV 疫苗接種后會(huì)出現(xiàn)對(duì)心臟的副作用[45]。免疫相關(guān)蛋白在USCD 中的作用及應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。

基于蛋白含量的檢測(cè)方法可以綜合基因表達(dá)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，直接從目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)水平去解讀生物學(xué)現(xiàn)象。但機(jī)體代償時(shí)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)存在延后性，因此蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的方法難以對(duì)急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。但死后自身分解也經(jīng)常干擾結(jié)果的判讀。因此，上述原因令USCD 的蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果往往需結(jié)合其他檢測(cè)方式所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析。

3 USCD 相關(guān)的RNA 異常

盡管圍繞致病基因及其表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)用于死因篩查的研究已相繼展開(kāi)，但由于多方面原因仍有相當(dāng)比例的案件無(wú)法解釋，促使研究者們開(kāi)始考慮USCD 中RNA 的作用?；蛲蛔儥z測(cè)陰性的USCD 可能是目標(biāo)功能基因并未突變，而基因表達(dá)過(guò)程出現(xiàn)異常（圖1）。

圖1 USCD 致病過(guò)程相關(guān)分子標(biāo)志物及其功能異常Fig.1 Biomarkers related to the pathogenesis of USCD and their functional abnormalities

3.1 編碼RNA 的異常

信使RNA（mRNA）作為DNA 與蛋白質(zhì)之間的重要中介，在USCD 發(fā)生中所扮演的角色不可忽視。2016 年，有學(xué)者[46]發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化致SCD 的案例中連接蛋白43（connexin 43，Cx43）和閉鎖小帶蛋白1 的mRNA 水平降低。依據(jù)先前對(duì)死后組織mRNA 完整性和穩(wěn)定性的研究結(jié)果，GONZáLEZHERRERA 等[35]選取缺血性心肌損傷和心肌修復(fù)相關(guān)的5 個(gè)基因，通過(guò)分析提出了mRNA 表達(dá)譜可鑒別心肌缺血情況：以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 mRNA 升高為主多提示心肌缺血的急性期，并可見(jiàn)于全身性缺氧狀況的致死案例，而以肌球蛋白輕鏈3、基質(zhì)金屬蛋白酶9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 三者mRNA 升高為主則提示心肌缺血處于修復(fù)期，而該假設(shè)在具備AMI 病理表現(xiàn)的SCD 案例得到了印證。

除了mRNA 表達(dá)水平異常外，其加工過(guò)程的異常也與SCD 相關(guān)。YIN 等[47-48]通過(guò)人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，橋粒芯蛋白-2 和Ⅰ型膠原蛋白α2 鏈mRNA 的3’-UT 多態(tài)性可影響其與相應(yīng)miRNA 的結(jié)合，最終影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達(dá)。利用人類胎兒心肌細(xì)胞系R14 的研究發(fā)現(xiàn)，RNA 結(jié)合蛋白HuR 通過(guò)穩(wěn)定心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2C（myocyte enhancer factor-2C，MEF2C）的mRNA增加其表達(dá)，而MEF2C 可促進(jìn)SCN5A 的轉(zhuǎn)錄過(guò)程并對(duì)其進(jìn)行正向調(diào)節(jié)[49]。PARIKH 等[31]則發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞特異性RNA 剪接因子RBM20 的異常會(huì)大大增加SCD 的風(fēng)險(xiǎn)。此外，一項(xiàng)研究對(duì)無(wú)臨床表現(xiàn)的Ⅰ型強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良患者發(fā)生SCD 后進(jìn)行RNA 測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)LDB3基因的mRNA 選擇性剪接發(fā)生異常[50]。

3.2 非編碼RNA 的異常

逐漸深入的分子水平研究也揭示了非編碼RNA協(xié)助診斷SCD 的價(jià)值。微RNA（microRNA，miRNA）通過(guò)與基因mRNA 的3'端或5'端非翻譯區(qū)結(jié)合影響其穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[51]。鑒于SCN5A基因編碼區(qū)的突變僅能解釋15%～30%的Brugada 綜合征[52]，DAIMI 等[52]對(duì)患有Brugada 綜合征的家族SCN5A基因外顯子、內(nèi)含子及5'端和3'端的非翻譯區(qū)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)3'端存在突變且與miRNA 相關(guān)。TAFTI 等[53]對(duì)40 名愛(ài)爾蘭Brugada 綜合征患者進(jìn)行線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）突變分析，確定了4 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變。非編碼RNA，如長(zhǎng)非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA，在冠心病、心律失常、心肌炎、心臟肥大等疾病發(fā)生中起到重要作用，特別是研究SCD 相關(guān)的幾類具有調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA 分子在細(xì)胞增殖分化和相關(guān)病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[54]。

新近的研究已不僅關(guān)注非編碼RNA 與心臟疾病的相關(guān)性，而且通過(guò)驗(yàn)證多層次生物標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，試圖闡明其背后的致病機(jī)制。2018 年的1 項(xiàng)研究[55]通過(guò)建立miRNA 在心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-24 調(diào)節(jié)SCN5A 表達(dá)的作用受SCN5A基因多態(tài)性的影響，且與心力衰竭的死亡率相關(guān)。HUANG 等[56]發(fā)現(xiàn)，LncRNA TTTY15或通過(guò)miR-455-5p 參與介導(dǎo)缺氧對(duì)心肌細(xì)胞的損傷過(guò)程。也有研究[57]發(fā)現(xiàn)，LncRNA MAGI1-IT1 可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-302e 參與心肌肥大過(guò)程，前述的研究結(jié)果將有助于揭示miRNA 應(yīng)用于法醫(yī)分子病理學(xué)鑒定的價(jià)值。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者提出聯(lián)合miRNA 與其相關(guān)基因的表達(dá)作為診斷SCD 的客觀指標(biāo)。李國(guó)良等[58]發(fā)現(xiàn)SCD案例的心肌組織中miR-17 可能通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）與STAT3的表達(dá)參與猝死過(guò)程，與非心臟疾病的樣本相比呈現(xiàn)出miR-17 和HIF-1α 高表達(dá)、STAT3 低表達(dá)，并提出聯(lián)合應(yīng)用幾種標(biāo)志物診斷SCD。另外的研究[59]也發(fā)現(xiàn)miR-21 與RECK、Smad基因存在相關(guān)性，在SCD 心肌組織中呈現(xiàn)miR-21 高表達(dá)、RECK 和Smad7 低表達(dá)的情況。因此，聯(lián)合基因、miRNA 和相關(guān)蛋白表達(dá)情況構(gòu)建表達(dá)譜可為分子解剖應(yīng)用于法醫(yī)病理學(xué)鑒定提供新思路。

4 總結(jié)

由于USCD 在尸體檢驗(yàn)及常規(guī)組織病理學(xué)檢測(cè)缺乏特征性形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，利用分子病理學(xué)方法闡釋USCD 機(jī)制有望取得重要突破，也被視為探究客觀指標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的關(guān)鍵途徑。國(guó)內(nèi)外研究USCD 相關(guān)基因突變及其鑒定應(yīng)用已獲顯著進(jìn)展，但其覆蓋度和可解釋性存在的不足仍使USCD 的法醫(yī)病理學(xué)鑒定實(shí)踐面臨困難，亟待從多方面解析USCD 的復(fù)雜機(jī)制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的死因歸類并建立統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前以編碼離子通道蛋白的基因突變?yōu)橹鞯暮蜻x基因檢測(cè)和分子解剖技術(shù)已初具基礎(chǔ)，深入研究USCD 相關(guān)的RNA 和功能蛋白也有了可觀發(fā)現(xiàn)，借助分子生物學(xué)技術(shù)拓展的分析能力，整合多類型生物標(biāo)志物的分子病理檢測(cè)輔助于法醫(yī)精準(zhǔn)診斷與鑒定的應(yīng)用價(jià)值將逐步體現(xiàn)。