血液中5 種蘑菇毒素的UPLC-HRMS 分析

劉文喬，施妍，向平，于峰，謝冰，董玫，哈婧，馬春玲，文迪

1.河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院 河北省法醫(yī)學重點實驗室 河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心 河北醫(yī)科大學法醫(yī)鑒定中心，河北 石家莊 050017；2.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；3.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海200063

毒蘑菇是指含有不同類型毒素的大型真菌[1]。全世界毒蘑菇種類約有100 余種，其中30 余種含有致死性毒素[2-3]。由于很多有毒蘑菇與食用蘑菇外觀上難以區(qū)分，因而很容易混淆造成嚴重的食物中毒[4]。在世界范圍內，每年有數(shù)百例蘑菇中毒致死案件[5-6]。根據(jù)國家突發(fā)公共衛(wèi)生事件管理信息系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，蘑菇中毒是我國食物中毒死亡的主要原因[7]。目前已經(jīng)確定的蘑菇毒素種類主要包括環(huán)型多肽、毒蠅堿、色胺類化合物、異惡唑衍生物、鹿花菌素、鬼傘素及奧來毒素7 類[8]。由于蘑菇毒素的種類不同，而且這些毒素的化學結構也不同，因此在血液樣品中建立一種快速、準確的蘑菇毒素分析方法對于蘑菇中毒事件的法醫(yī)學鑒定和臨床早期診斷至關重要。目前已有測定生物樣本中蘑菇毒素的方法，如毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）[9]、氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[10]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[11-14]、高效液相色譜-質譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[4，15-19]、高效液相色譜-高分辨質譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，HPLC-HRMS）[20-22]。本 研究擬建立同時測定血液樣品中α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、蠅蕈醇、毒蠅堿和賽洛新5 種蘑菇毒素的超高壓液相色譜-高分辨質譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，UPLC-HRMS）分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

UltiMateTM3000 高效液相色譜儀串聯(lián)Q ExactiveTMFocus 質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ACQUITY Premier CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm;美國Waters 公司）；Acquity Premier CSHTMC18 VanGuardTM保護柱（5 mm × 2.1 mm，1.7 μm；美國Waters 公司）；MicroCL 21R 高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；LSETM旋渦振蕩器（美國CORNING 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q IQ 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；Cleanert PAX（50 mg PAX）、Cleanert MAS-QuEcHERS 系列Cleanert?C18凈化管［25 mg C18，25 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（primary-secondary amine，PSA），150 mg MgSO4；天津博納艾杰爾科技有限公司］。

α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、蠅蕈醇、毒蠅堿和賽洛新標準品溶液（美國Sigma 公司）；抗壞血酸（美國Sigma 公司）；甲醇、乙腈（色譜級，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸（色譜級，北京DiKMA 公司）；實驗用水均由Milli-Q IQ 超純水系統(tǒng)制備。

1.2 標準溶液的配制

分別將α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和賽洛新用甲醇配制成0.1 mg/mL 的單個分析物儲備溶液，蠅蕈醇和毒蠅堿用純水配制成0.1 mg/mL 的單個分析物儲備溶液。精密移取各標準品儲備溶液適量，用甲醇-水溶液（V甲醇∶V水=1∶1）配制成各分析物質量濃度為10 μg/mL 的混合標準溶液。所有儲備溶液和工作溶液均避光儲存于-20 ℃冰箱內。

1.3 樣品前處理

取血液樣品200 μL，加入5 μL 0.1 mol/L 的抗壞血酸，再加入800 μL 乙腈-水溶液（V乙腈∶V水=3∶1），充分混勻并渦旋30 s，超聲混勻10 min 后，在4 ℃下以離心半徑8.5 cm，12 000 r/min，離心5 min，將上清液移取至Cleanert PAX 中，渦旋振蕩30 s 后置于高速離心機以離心半徑10 cm，12 000 r/min，再次離心5 min，取上清液用純水稀釋1 倍經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾，供UPLCHRMS 分析。

1.4 UPLC-HRMS 檢測

ACQUITY Premier CSH C18色譜柱：柱溫40 ℃，流速200 μL/min，進樣量5 μL。流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）。梯度洗脫程序：0～3 min 2%B，3～5 min（2%～50%）B，5～10 min（50%～70%）B，10～12 min（70%～95%）B，12～12.01 min（95%～2%）B，12.01～15 min 2%B。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。

以電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）在FullMS-ddMS2正離子掃描模式下掃描；一級質譜質量掃描范圍為m/z100～1 000，分辨率為70 000；二級分辨率為15000；碰撞能量（collision energy，NCE）為30eV；噴霧電壓3.2 kV，輔助加熱器溫度為300 ℃，毛細管溫度為320 ℃；鞘氣30 L/min，輔助氣15 L/min。所有質量數(shù)的提取均基于5×10-6的質量窗口。每天使用正離子模式校準溶液對Q ExactiveTMFocus 質譜儀進行外部質量校準。數(shù)據(jù)的采集和處理使用Xcalibur 4.0軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

質譜參數(shù)結合蠕動針泵進行輸注，通過全掃描和子掃描在正離子和負離子模式下對每種分析物進行優(yōu)化。所有分析物均在正離子掃描模式下信號響應最強，除毒蠅堿的分子離子為[M]+，其他分析物的分子離子均為[M+H]+，同時也確定了母離子和子離子的精確質量數(shù)（表1）。

表1 5 種蘑菇毒素的UPLC-HRMS 參數(shù)Tab.1 UPLC-HRMS parameters of 5 mushroom toxins

1.5 方法學驗證

檢出限、定量限和線性：取空白全血添加混合標準溶液，分別配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500 和1 000 ng/mL 的加標血液樣品。按1.3節(jié)和1.4 節(jié)方法進行前處理和分析。根據(jù)各種分析物的保留時間和碎片離子定性，以色譜峰面積進行定量，以信噪比（signal-noise，S/N）≥3 時對應的質量濃度作為檢出限，以信噪比S/N≥10 時對應的質量濃度作為定量限。以各被測物濃度為橫坐標（x），以被測物峰面積為縱坐標（y），繪制線性關系曲線。

精密度和準確度：取空白血液樣品，準確添加不同濃度的混合標準溶液，按各分析物的線性范圍配制成低、中、高3個質量濃度水平的標準添加樣品，分別為20、50、500 ng/mL（α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽），0.5、1、5 ng/mL（毒蠅堿、賽洛新），50、100、500 ng/mL（蠅蕈醇）。按1.3 節(jié)和1.4 節(jié)方法進行前處理和分析，每個質量濃度在1 d 內不同時間檢測6 次，連續(xù)測定3 d，得到日內、日間精密度（以相對標準偏差表示）以及準確度。

回收率和基質效應：在空白血液樣本中加入混合標準溶液，得到低、中、高3 個濃度的樣品，按1.3 節(jié)和1.4 節(jié)方法進行前處理和分析得到添加血液中各分析物的峰面積為A。同時取空白血樣，直接按1.3 節(jié)方法進行處理，然后向獲得的提取劑中加入相應濃度的對照品，按1.4 節(jié)的方法進行分析得到各分析物的峰面積為B。提取回收率=（A/B）×100%，并計算回收率的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。用流動相配制低、中、高混合標準溶液，直接按1.4 節(jié)方法進行分析得到各分析物的峰面積為C?；|效應=（B/C）×100%。

1.6 動物實驗

C57BL/6N 雄性小鼠9 只，體質量（25±2）g，隨機分為3 組，每組3 只。分別按照1/2 的LD50劑量灌胃給藥α-鵝膏毒肽（LD50=0.6 mg/kg）[20]、毒蠅堿（本研究預實驗得到LD50=10 mg/kg）和賽洛新（本研究預實驗得到LD50=4 mg/kg），并于中毒后1 h 內采取血液和尿液樣本，按照1.3 節(jié)方法進行樣本前處理，運用所建方法進行分析。本實驗嚴格按照河北醫(yī)科大學動物倫理學委員會的相關規(guī)定執(zhí)行操作。

2 結果與討論

2.1 樣本前處理方法的優(yōu)化

蠅蕈醇、毒蠅堿和賽洛新是低分子極性化合物，而α-鵝膏毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽是高分子環(huán)肽化合物，其種類和化學性質差異較大。已報道[16-17，20]的生物體液中蘑菇毒素的樣本前處理方法多為固相萃取法。雖然固相萃取是一種眾所周知的有效純化復雜基質的技術，但大多數(shù)可用的固相萃取方法都需要復雜的處理條件、蒸發(fā)和富集步驟，同時該方法較難滿足同時提取多種類型蘑菇毒素的需求。因此，本研究選擇了溶劑提取和凈化管凈化基質進行樣本前處理，該方法具有操作步驟簡便、快速等特點。

由于賽洛新非常不穩(wěn)定，在光和空氣中會快速地分解[14]，故本研究通過加入抗壞血酸來保證賽洛新在樣本前處理過程中的穩(wěn)定性[17]。然后根據(jù)5 種蘑菇毒素的物理溶解性質，對幾種提取溶劑或由甲醇、乙腈和水組成的混合溶劑進行了測試。這些極性溶劑的選擇考慮了分析物的極性和親水性。選擇了不同比例的水和有機溶劑的混合溶液作為提取溶劑，考察了甲醇-水溶液（V甲醇∶V水=3∶1）、甲醇-水溶液（V甲醇∶V水=2∶1）、乙腈-水溶液（V乙腈∶V水=3∶1）、乙腈-水溶液（V乙腈∶V水=2∶1）對5 種蘑菇毒素回收率的影響，結果表明，以乙腈-水溶液（V乙腈∶V水=3∶1）作為提取溶劑時回收率最高（圖1），并且以此溶劑提取時蛋白沉淀效果最好。

圖1 不同提取溶劑對5 種蘑菇毒素回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the recovery of 5 mushroom toxins

溶劑提取法在充分提取各蘑菇毒素的同時，不可避免地會將內源性物質一并提取，可能產(chǎn)生一定的基質效應。本研究考察了Cleanert PAX 和Cleanert MAS-QuEcHERS 系列Cleanert?C18 凈化 管2 種凈 化管作為實驗考察對象（表2），經(jīng)Cleanert MAS-QuEcHERS系列Cleanert?C18 凈化管和Cleanert PAX 凈化管凈化后的賽洛新基質效應均降低，然而這兩種凈化劑都無法消除內源性物質對蠅蕈醇信號的抑制作用。Cleanert PAX 對5 種目標化合物的回收率均較好，Cleanert MAS-QuEcHERS 系列Cleanert?C18 凈化管降低了蠅蕈醇的回收率，可能是其在吸附基質的同時也吸附了一些目標化合物，因此對于5 種蘑菇毒素同時提取時，選用Cleanert PAX 較好。另外，直接稀釋凈化液進行進樣，避免了溶劑蒸發(fā)再復溶的耗時步驟。

表2 不同凈化劑對5 種蘑菇毒素回收率和基質效應的影響Tab.2 Effects of different purifiers on the recovery and matrix effect of 5 mushroom toxins（%）

2.2 UHPLC-HRMS 的優(yōu)化

在液相色譜分離方面，對3 種色譜柱進行了考察，包括Hypersil GOLD PFP 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 mm；美國Thermo Fisher Scientific 公司）、Acquity HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 mm；美國Waters公司）和ACQUITY Premier CSH C18色譜柱。在1.4 節(jié)的流動相梯度洗脫程序下，ACQUITY Premier CSH C18色譜柱對5 種蘑菇毒素的保留性和分離度均較高，并且流動相中無需加入離子對試劑，便可以提供尖銳的峰形和更強的MS 響應，有效地改善峰形拖尾的現(xiàn)象，并且提高MS 響應靈敏度。除了固定相外，流動相是色譜分析中獲得良好分離效果的另一個重要參數(shù)，對分析物的電離和質譜儀的靈敏度也有影響。本研究以甲醇或乙腈為有機相，以水為極性相，對不同的流動相進行了實驗研究。與乙腈和水組合相比，甲醇和水使分析物在液相色譜中分離效果更好，質譜中信號強度更高，因此選擇甲醇作為有機相。甲醇與乙腈相比，還具有更低成本和更低毒性的優(yōu)點。采用梯度洗脫的條件，分析時間只需15 min，可為臨床診斷救治提供寶貴的時間。詳見圖2色譜圖所示。

圖2 5 種蘑菇毒素的一級全掃描提取離子色譜圖Fig.2 Full-scan extraction ion chromatogram of 5 mushroom toxins

2.3 方法學驗證

血液中α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、蠅蕈醇、毒蠅堿和賽洛新在相應的線性范圍內線性關系良好，決定系數(shù)（R2）均大于0.99，檢出限為0.2～20 ng/mL，定量限為0.5～50 ng/mL（表3）。與已報道[4，15-16，19]的單一方法比較，發(fā)現(xiàn)本方法α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽略高，毒蠅堿和賽洛新的檢出限和定量限與其他方法相當。

表3 5 種蘑菇毒素的線性范圍、線性方程、檢出限和定量限Tab.3 Linear ranges，linear equations，limits of detection and limits of quantitation of 5 mushroom toxins

本研究中各分析物的日內精密度為0.6%～9.0%，日間精密度為1.7%～6.3%，準確度為90.4%～101.3%，均滿足精密度和準確度的要求。提取回收率為89.6%～101.4%，RSD 為1.1%～6.7%，表明乙腈-水溶液（V乙腈∶V水=3∶1）提取和Cleanert PAX 的前處理方法可達到較好的提取效果。α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、毒蠅堿和賽洛新的基質效應為91.9%～129.8%，而蠅蕈醇的基質效應較強，為42.2%～47.7%，但從回收率和精密度的結果來看，蠅蕈醇雖然有一定的基質效應，但并不影響測定的準確性。詳見表4。

表4 5 種蘑菇毒素的精密度、準確度、回收率和基質效應Tab.4 Precision，accuracy，recovery and matrix effect of 5 mushroom toxins

2.4 動物實驗

對α-鵝膏毒肽、毒蠅堿和賽洛新染毒動物的生物檢材血液和尿液進行分析，定性及定量結果見表5。除α-鵝膏毒肽染毒小鼠血液中未檢出α-鵝膏毒肽成分外，毒蠅堿和賽洛新染毒小鼠血液中均可檢出相應成分。但是，在α-鵝膏毒肽、毒蠅堿和賽洛新染毒動物的尿液中均可檢出相應的毒物成分。因此，在蘑菇毒素中毒的實際案例應用中，應注意留存尿液等生物檢材。

表5 α-鵝膏毒肽、毒蠅堿和賽洛新染毒小鼠生物檢材中毒物的含量Tab.5 The content of α-amanitin，muscarine and psilocin in biological samples of mice

2.5 結論

本研究建立了一種簡便、快速測定血液中5 種蘑菇毒素（α-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、蠅蕈醇、毒蠅堿和賽洛新）的方法。經(jīng)簡單的提取和純化，采用UPLC-HRMS 聯(lián)用技術進行了測定。經(jīng)驗證，結果可靠、重現(xiàn)性好、靈敏度高，可同時對血液中多種類型蘑菇毒素進行快速準確的定性篩查和定量分析，從而為蘑菇中毒事件的鑒定提供依據(jù)。