基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接技術(shù)探討肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎潛在分子機(jī)制

朱毅，譙明，張海波，謝偉娜，楊建華

（新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木 830054；2藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

肺炎支原體為誘發(fā)兒童呼吸道疾病的一種常見(jiàn)病原體，會(huì)引起上呼吸道感染、支氣管炎、非典型肺炎等諸多病變，在學(xué)齡前、學(xué)齡兒童中肺炎支原體感染以肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaePneu?monia，MPP）最為常見(jiàn)[1]。MPP疾病前期為外邪入侵，導(dǎo)致痰熱內(nèi)蘊(yùn)，氣道阻滯而致肺氣郁閉，肺絡(luò)不暢而出現(xiàn)咳嗽癥狀，疾病后期多為氣陰兩虛證[2]。中醫(yī)辨證理論認(rèn)為MPP多屬溫邪上受，以肺為先，同時(shí)肺是多氣多血臟器，外邪入侵后易引起氣滯血瘀，目前對(duì)MPP的治療以清熱解毒、活血化瘀、化痰止咳為主[3]。肺炎合劑是新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院在治療小兒肺炎經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上研制開(kāi)發(fā)的院內(nèi)制劑，臨床用于治療小兒支原體肺炎，具有清熱解毒、潤(rùn)肺止咳之功效[4]。肺炎合劑是由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草、黃芩、金銀花、板藍(lán)根和蘆根8味中藥配伍而成的中藥復(fù)方制劑，成分十分復(fù)雜，其治療MPP的作用機(jī)制尚未明確。中藥是基于中醫(yī)整體觀念、辨證論治理論，以藥物“四氣”、“五味”特性進(jìn)行加減化裁的治療疾病的手段?，F(xiàn)代學(xué)者對(duì)中藥的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究，但限于“時(shí)代”和“科學(xué)技術(shù)水平”，多數(shù)研究都只集中在單一藥物、單一單基因和單一作用機(jī)制方面，這與中醫(yī)“整體觀念”理論完全不符。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的誕生打破了單一藥物、單一靶點(diǎn)、單一通路研究的瓶頸，集整體、動(dòng)態(tài)、分析于一體，提供了多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的研究思路，為中藥復(fù)方制劑潛在機(jī)制研究提供了新的研究模式[5]。本研究在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索肺炎合劑的化合物和靶標(biāo)蛋白，構(gòu)建和分析靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，確定網(wǎng)絡(luò)中的核心靶標(biāo)，并對(duì)其進(jìn)行功能富集，以期在分子層面上探索肺炎合劑治療MPP的可能機(jī)制，流程見(jiàn)圖1。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎作用機(jī)制流程圖

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)[6]（TCMSP，http://tcmsp.com/tcmsp.php）檢索肺炎合劑中麻黃（Ephedra Herba，EH）、苦杏仁（Arme?niacae Semen Amarum，ASA）、甘草（Glycyrrhizae Ra?dix et Rhizoma，GRR）、黃芩（Scutellariae Radix，SR）、金銀花（Lonicerae Japonicae Flos，LJF）、板藍(lán)根（Isati?dis Radix，IR）和蘆根（Phragmitis Rhizoma，PR）7味藥材的化學(xué)成分；TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中未檢索到石膏（Gyp?sum Fibrosum，GF），使 用TCMID數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）查詢(xún)。參考文獻(xiàn)[7-9]的方法，設(shè)置化合物口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18為篩選條件，獲取肺炎合劑活性成分。

1.2 活性成分作用靶點(diǎn)的獲取BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）設(shè)置參數(shù)為：Score cutoff≥20且P<0.05，選取符合參數(shù)要求的靶點(diǎn)；在Swiss Target Prediction平臺(tái)（http://www.swisstar?getprediction.ch/）上選取預(yù)測(cè)結(jié)果中參數(shù)Probability≥0.7的靶點(diǎn)，將兩個(gè)平臺(tái)檢索到的活性成分靶點(diǎn)合并，刪去重復(fù)靶點(diǎn)，將最終的靶點(diǎn)蛋白信息經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)10]（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到活性成分對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因號(hào)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ctd?base.org/）和MalaCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.malacards.org/）檢索肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaePneumonia，MPP）疾病的靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)合并后刪去重復(fù)項(xiàng)，采用韋恩平臺(tái)將藥物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING[11]數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，設(shè)置蛋白互作綜合得分（interaction score）≥0.4作為篩選條件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理和分析，篩選出排名前10的核心靶點(diǎn)。

1.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)獲得的潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，利用Cytoscape 3.8.0軟件（http://www.cytoscape.org/）進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 生物過(guò)程分析和代謝通路分析將篩選得到的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，identifier設(shè)置為offi?cial gene symbol，list type設(shè)置為gene list，物種設(shè)置為人類(lèi)，進(jìn)行基因本體（GO，http://www.geneontology.org）富集分析[12]和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG，http://www.kegg.jp/pathway.html）代謝通路分析[13]（P<0.01）。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證利用AutoDock vina軟件對(duì)肺炎合劑核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)（pdb格式），將受體蛋白（pdb格式）導(dǎo)入Pymol 2.3.4軟件，去除水分子和其原配體，再將其導(dǎo)入AutoDock Tools軟件，加極性氫，保存為pdbqt格式，受體蛋白的對(duì)接口袋根據(jù)其原配體的位置確定。將核心成分的mol2文件導(dǎo)入ChemBioOffice軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到配體結(jié)構(gòu)的最優(yōu)構(gòu)象，保存為mol2文件。采用AutoDock Vina軟件將核心成分與核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，設(shè)置能量范圍為10，精度為20，迭代次數(shù)為100。通常認(rèn)為結(jié)合能小于-5 kJ/mol時(shí)[14]，配體與受體可以較好結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 肺炎合劑活性成分的篩選通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索肺炎合劑各味藥的化合物成分得到結(jié)果：麻黃363個(gè)、苦杏仁113個(gè)、甘草280個(gè)、黃芩143個(gè)、金銀花236個(gè)、板藍(lán)根169個(gè)、蘆根31個(gè)；根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，排除相同名稱(chēng)共計(jì)得到110個(gè)活性成分，其中來(lái)源于麻黃6個(gè)、苦杏仁3個(gè)、甘草73個(gè)、黃芩14個(gè)、金銀花5個(gè)、板藍(lán)根7個(gè)、蘆根1個(gè)；利用TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)檢索石膏活性成分1個(gè)。肺炎合劑中活性成分基本信息見(jiàn)表1。

表1 肺炎合劑中活性成分的基本信息

2.2 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過(guò)BATMAN-TCM和Swis?sTargetPrediction平臺(tái)檢索得到活性成分靶點(diǎn)110個(gè)；GeneCards、CTD和MalaCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到與肺炎支原體肺炎相關(guān)靶點(diǎn)336個(gè)；通過(guò)Venn平臺(tái)將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到42個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎靶點(diǎn)韋恩圖

續(xù)表

續(xù)表

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)路中共有42個(gè)節(jié)點(diǎn)（靶點(diǎn)蛋白），351條邊（蛋白相互作用），平均節(jié)點(diǎn)為16.7。度值表示連接到1個(gè)節(jié)點(diǎn)的線條數(shù)，用來(lái)評(píng)估網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性；節(jié)點(diǎn)顏色越深，表明度值越大。將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過(guò)CytoHubba插件以度（degree）為條件進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出排名前10的核心靶點(diǎn)，分別為IL6（degree=33）、MAPK8（de?gree=31）、VEGFA（degree=31）、CASP3（degree=30）、MYC（degree=29）、EGFR（degree=28）、CCND1（degree=27）、ESR1（degree=26）、CASP8（degree=23）和RELA（degree=23），見(jiàn)圖3、4。

圖3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，在交互網(wǎng)絡(luò)中，槲皮素（degree=77）、山柰酚（degree=34）和木犀草素（degree=28）等化合物具有較多的作用靶點(diǎn)，提示在肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見(jiàn)圖5。

圖5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO和KEGG富集分析在GO富集分析中，生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分分別選取富集的前20個(gè)條目繪制柱狀圖，見(jiàn)圖6。生物過(guò)程涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控，藥物反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等方面；分子功能主要涉及蛋白結(jié)合，酶結(jié)合，相同蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面；細(xì)胞組成涉及細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞液，細(xì)胞核，核質(zhì)和細(xì)胞膜等方面。KEGG通路分析中，按P值進(jìn)行排序，選取前20條代謝通路繪制氣泡圖，見(jiàn)圖7。肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的信號(hào)通路主要包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路，重組人白介素-17信號(hào)通路，細(xì)胞凋亡，糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路，乙型肝炎，卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染等。

圖4 核心靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 肺炎合劑潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

圖7 肺炎合劑潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素3個(gè)核心成分與IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、MYC、EGFR、CCND1、ESR1、CASP8、RELA 10個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果的Vina分值（即結(jié)合能）均小于-5 kJ/mol，其中核心成分與RELA蛋白的相互作用最佳，Vina分值均小于-8 kJ/mol，說(shuō)明核心成分與核心蛋白靶點(diǎn)均能較好結(jié)合，見(jiàn)表2。核心成分槲皮素、山柰酚、木犀草素與RELA蛋白的分子對(duì)接圖見(jiàn)圖8。

圖8 蛋白分子對(duì)接構(gòu)象圖

表2 核心成分與核心靶蛋白的對(duì)接結(jié)果

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建藥物、靶點(diǎn)、通路、疾病之間的多重網(wǎng)絡(luò)，深度解析肺炎合劑治療肺炎支原體肺炎的多成分-多靶點(diǎn)-多通路作用機(jī)制。在肺炎合劑治療MPP核心網(wǎng)絡(luò)中，篩選出3個(gè)核心潛在活性成分及10個(gè)潛在活性靶點(diǎn)。經(jīng)分子對(duì)接驗(yàn)證，槲皮素、山柰酚、木犀草素3個(gè)核心成分與IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、MYC、EGFR、CCND1、ESR1、CASP8、RELA核心蛋白靶點(diǎn)顯示出較強(qiáng)的結(jié)合能力，體現(xiàn)了肺炎合劑多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用的特點(diǎn)。研究表明，槲皮素可激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，通過(guò)降低炎癥因子IL-6、IL-1β等的分泌，對(duì)支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)有一定的保護(hù)作用[15]。山柰酚可以通過(guò)拮抗NF-κB和STAT3信號(hào)通路的激活，減弱IL-6水平，在體內(nèi)炎性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[16]。木犀草素具有較強(qiáng)的消炎、抗病毒、抗菌等作用[17]。由上可知，肺炎合劑中篩選出的活性化合物主要有抗炎、抗病毒等作用，可能在MPP引發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮一定的干預(yù)作用。PPI網(wǎng)絡(luò)中，IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、MYC等為肺炎合劑治療MPP的核心靶點(diǎn)，主要涉及炎癥反應(yīng)、病毒感染、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等方面。

KEGG通路分析顯示，前20條代謝通路中有7條通路與病毒感染相關(guān)，包括卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染、沙門(mén)氏菌感染、乙型肝炎、麻疹、幽門(mén)螺桿菌感染，表明肺炎合劑在抗病毒中起重要作用。另外，基因數(shù)目在IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥AGERAGE信號(hào)通路、凋亡等通路上富集較多。IL-17可激活MAPKs和NF-κB下游信號(hào)通路，從而使趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)增加，在炎癥調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[18]。TNF信號(hào)通路可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎癥和免疫[19]。AGEs通過(guò)與其受體結(jié)合，激活MAPK和NFκB信號(hào)通路，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)慢性細(xì)胞活化和組織損傷[20]。

綜上所述，肺炎合劑發(fā)揮治療MPP的作用是多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用，體現(xiàn)了中醫(yī)整體性的特點(diǎn)。本研究為肺炎合劑發(fā)揮治療MPP作用提供依據(jù)，同時(shí)也為其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究和臨床應(yīng)用提供參考。