鎖陽醇提物和水提物對小鼠免疫功能的影響

李 敏，熱西代姆·阿卜力孜，楊建華，胡君萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830054)

鎖陽（Cynomorium songaricumRupr.）為被子植物門雙子葉植物綱薔薇亞綱鎖陽科植物鎖陽的干燥肉質(zhì)莖，別名地毛球、銹鐵棒、鎖嚴(yán)子等，主要分布于我國甘肅、新疆、青海等地[1-2]。鎖陽性甘、溫，具有益腎壯陽、通精血、利肝臟、通便、緩解衰老等作用，主要含有多糖、苷類、黃酮類、甾體類、有機(jī)酸類、三萜類、鞣質(zhì)類、氨基酸類和礦物質(zhì)元素等[3]，具有抗應(yīng)激作用、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗氧化作用、抑制血小板聚集、類糖皮質(zhì)激素樣作用、防癌、抗病毒和填髓生血等作用[4-5]。研究表明，鎖陽免疫調(diào)節(jié)作用研究受到越來越多的關(guān)注，鎖陽提取物、制劑、化合物群等對小鼠免疫系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用[6-10]，說明鎖陽中的化學(xué)成分單獨(dú)或聯(lián)合發(fā)揮了增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。本研究采用正常生理和環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠為模型，以胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)、血清溶血素水平、血清細(xì)胞因子含量為指標(biāo)，探究鎖陽水提物和醇提物對不同免疫狀態(tài)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器UVmini-1240型紫外-可見分光光度計(jì)（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KDC-160HR型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Ther?mo scientific公司)。

1.2 試劑環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)04131209）；鹽酸左旋咪唑片（桂林南藥股份有限公司，批號(hào)161105）；印度墨汁（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號(hào)20180718）；小鼠白介素2（Inter?leukin，IL-2）、干擾素γ（Interferon，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20180315、20180828、20180519）。綿羊紅細(xì)胞（SRBC）的制備：綿羊頸靜脈取血，置于有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維，放入4℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)使用。豚鼠血清的制備：豚鼠心臟取血，全血于4℃放置15 min，3 000 r/min離心10 min，制得血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥材鎖陽藥材2018年2月購于新疆百草堂醫(yī)藥連鎖經(jīng)銷有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室叢媛媛教授鑒定為鎖陽科鎖陽屬植物鎖陽（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉質(zhì)莖。

1.4 動(dòng)物昆明小鼠450只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量為（20±2）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(新)2016-0002，動(dòng)物合格證號(hào)：65000700000700。室溫18℃~22℃，相對濕度40 %～60 %，晝夜光照節(jié)律12 h︰12 h，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 方法

1.5.1 鎖陽醇提物和水提物的制備取鎖陽藥材1 kg，加10倍量75 %乙醇溶液，70℃加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮，干燥，得鎖陽醇提物（得率17.02 %）。殘?jiān)?0倍量沸水回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮，干燥，得鎖陽水提物（得率31.91%）。使用時(shí)研細(xì)以生理鹽水配制成相應(yīng)濃度。

1.5.2 動(dòng)物分組與造模450只小鼠隨機(jī)分為15組，每組30只，即空白組（生理鹽水），模型組（CTX+生理鹽水），陽性組（CTX+左旋咪唑30 mg/kg體質(zhì)量），正常生理醇提物高、中、低劑量組（26、13、6.5 mg/kg體質(zhì)量），正常生理水提物高、中、低劑量組（48、24、12 mg/kg體質(zhì)量），CTX+醇提物高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg體質(zhì)量），CTX+水提物高、中、低劑量組（72、36、18 mg/kg體質(zhì)量）。第1~3天，模型組、陽性組和免疫抑制各組按80 mg/kg體質(zhì)量的劑量ip給予CTX建立免疫抑制模型，之后每周強(qiáng)化1次。各組小鼠均在每天上午10︰00~11︰00按照劑量ig給予相應(yīng)溶液，每天1次，連續(xù)30 d。

1.6指標(biāo)的測定

1.6.1 免疫器官指數(shù)測定各組小鼠（n=10）于末次給藥24 h后，稱量體質(zhì)量，摘眼球取血，頸椎脫臼處死之后摘取脾臟和胸腺，稱重，記錄。按以下公式計(jì)算：胸腺指數(shù)=胸腺重量（mg）/體質(zhì)量（g）；脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.6.2 廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)測定采用碳粒廓清法測定小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能[11]。各組小鼠（n=10）于末次給藥24h后，稱量體重，每鼠尾靜脈注射用生理鹽水稀釋5倍的印度墨汁，注入墨汁后開始計(jì)時(shí)，分別于2 min和10 min時(shí)從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，立即加到裝有2 mL 0.1% Na2CO3溶液的EP管中，吹打均勻。用分光光度計(jì)在600 nm波長處測定吸光度，以0.1 % Na2CO3溶液作為空白對照。將小鼠頸椎脫臼處死之后摘取脾臟和肝臟，稱重，記錄。按以下公式計(jì)算：K=（1gA2-lgA10）/（t10-t2）,α=K1/3×體質(zhì)量/（脾重+肝重）,注：t2為第1次采血時(shí)間2 min；t10為第2次采血時(shí)間10 min；A2為t2采血的吸光度，A10為t10采血的吸光度。

1.6.3 血清溶血素水平測定 各組小鼠（n=10）第24d給藥后，每日每鼠腹腔注射5%綿羊紅細(xì)胞0.2 mL進(jìn)行致敏，并繼續(xù)給藥。致敏后6 d，眼球取血，分離血清，取生理鹽水稀釋100~200倍的血清樣品1 mL和10% SRBC 0.5 mL至試管內(nèi)，再加入10 %豚鼠血清l mL，空白對照管以生理鹽水代替血清，同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血管，37℃水浴30 min，冰浴終止反應(yīng)，離心取上清，于540 nm處測吸光度，按照以下公式計(jì)算：HC50=（A樣品/A50）×稀釋倍數(shù)，注：A50為半數(shù)溶血管吸光度。

1.6.4 血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α含量測定各組小鼠摘眼球取血，血液凝固后，4℃下3 000 r/min，離心10 min，吸出上層血清，分裝凍存。參照ELISA試劑盒說明操作測定小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異比較采用Student Newman Keuls（SNK）檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠免疫器官的影響與空白組相比，正常生理水提物各劑量組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），造模成功。與模型組相比，CTX+醇提物各劑量組和CTX+水提物各劑量組小鼠胸腺指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CTX+醇提物中、高劑量組、CTX+水提物各劑量組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽性組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 鎖陽醇提物和水提物對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n=10，±s）

表1 鎖陽醇提物和水提物對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

組別空白組模型組陽性組正常生理醇提物高劑量組正常生理醇提物中劑量組正常生理醇提物低劑量組正常生理水提物高劑量組正常生理水提物中劑量組正常生理水提物低劑量組CTX+醇提物高劑量組CTX+醇提物中劑量組CTX+醇提物低劑量組CTX+水提物高劑量組CTX+水提物中劑量組CTX+水提物低劑量組劑量/（g/kg體質(zhì)量）0.26 0.13 0.065 0.48 0.24 0.12 0.4 0.2 0.1 0.72 0.36 0.18胸腺指數(shù)/（mg/g）2.32±0.62 1.03±0.58*3.46±0.33△2.57±0.09 2.52±0.11 2.39±0.24 2.83±0.54 2.71±0.45 2.58±0.29 1.58±0.23△1.43±0.52△1.21±0.18△2.99±0.04△2.48±0.15△2.11±0.24△脾臟指數(shù)/（mg/g）5.29±0.32 2.13±0.08*7.87±0.56△5.56±0.13 5.55±0.28 5.39±0.45 7.48±0.68*6.66±0.12*6.49±0.61*3.56±0.68△2.98±0.14△2.37±0.44 5.75±0.24△5.01±0.13△4.19±0.31△

2.2 對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠吞噬功能的影響與空白組相比，正常生理水提物各劑量組小鼠廓清指數(shù)明顯升高作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組相比，模型組小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），造模成功。與模型組相比，CTX+醇提物高劑量組、CTX+水提物中、高劑量組小鼠廓清指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CTX+醇提物高劑量組、CTX+水提物各劑量組小鼠吞噬指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽性組小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 鎖陽醇提物和水提物對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠吞噬功能的影響（n=10，±s）

表2 鎖陽醇提物和水提物對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠吞噬功能的影響（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

組別空白組模型組陽性組正常生理醇提物高劑量組正常生理醇提物中劑量組正常生理醇提物低劑量組正常生理水提物高劑量組正常生理水提物中劑量組正常生理水提物低劑量組CTX+醇提物高劑量組CTX+醇提物中劑量組CTX+醇提物低劑量組CTX+水提物高劑量組CTX+水提物中劑量組CTX+水提物低劑量組劑量/（g/kg體質(zhì)量）0.26 0.13 0.065 0.48 0.24 0.12 0.4 0.2 0.1 0.72 0.36 0.18廓清指數(shù)K 0.057±0.009 0.036±0.001*0.050±0.004△0.042±0.005 0.039±0.004 0.037±0.008 0.089±0.003*0.069±0.005*0.062±0.010*0.049±0.003△0.044±0.007 0.040±0.005 0.067±0.006△0.057±0.004△0.045±0.009吞噬指數(shù)α 7.63±0.85 5.12±0.57*6.78±0.23△5.58±0.12 5.43±0.45 5.29±0.09 7.99±0.21 7.72±0.43 7.68±0.29 6.12±0.29△5.52±0.58 5.34±0.61 7.89±0.45△7.54±0.31△6.36±0.15△

2.3對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影響與空白組相比，正常生理水提物中、高劑量組小鼠HC50明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組相比，模型組小鼠HC50明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），造模成功。與模型組相比，陽性組、CTX+醇提物中、高劑量組、CTX+水提物各劑量組小鼠HC50明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 鎖陽醇提物和水提物對正常生理和免疫抑制小鼠HC50的影響（n=10，±s）

表3 鎖陽醇提物和水提物對正常生理和免疫抑制小鼠HC50的影響（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

組別空白組模型組陽性組正常生理醇提物高劑量組正常生理醇提物中劑量組正常生理醇提物低劑量組正常生理水提物高劑量組正常生理水提物中劑量組正常生理水提物低劑量組CTX+醇提物高劑量組CTX+醇提物中劑量組CTX+醇提物低劑量組CTX+水提物高劑量組CTX+水提物中劑量組CTX+水提物低劑量組劑量/（g/kg體質(zhì)量）——0.26 0.13 0.065 0.48 0.24 0.12 0.4 0.2 0.1 0.72 0.36 0.18 HC50 215.14±25.3 136.48±19.9*201.58±34.62△238.94±32.19 219.46±15.22 213.72±56.95 285.33±46.58*268.29±16.14*222.45±40.15 185.32±46.58△163.21±12.36△148.59±34.18 202.34±62.41△189.26±54.11△162.59±30.77△

2.4 對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響與空白組相比，正常生理醇提物高劑量組、水提物各劑量組小鼠血清IL-2含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；正常生理水提物高劑量組小鼠血清IFN-γ含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；正常生理醇提物中、高劑量組、水提物各劑量組小鼠血清TNF-α明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組相比，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），造模成功。與模型組相比，CTX+醇提物高劑量組、CTX+水提物中、高劑量組小鼠血清IL-2含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CTX+水提物中、高劑量組小鼠血清IFN-γ含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CTX+醇提物中、高劑量組、CTX+水提物各劑量組小鼠血清TNF-α含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽性組小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

表4 鎖陽醇提物和水提物對正常生理和免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ和TNF-α的影響（n=10，±s）

表4 鎖陽醇提物和水提物對正常生理和免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ和TNF-α的影響（n=10，±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

組別空白組模型組陽性組正常生理醇提物高劑量組正常生理醇提物中劑量組正常生理醇提物低劑量組正常生理水提物高劑量組正常生理水提物中劑量組正常生理水提物低劑量組CTX+醇提物高劑量組CTX+醇提物中劑量組CTX+醇提物低劑量組CTX+水提物高劑量組CTX+水提物中劑量組CTX+水提物低劑量組劑量/（g/kg體質(zhì)量）0.26 0.13 0.065 0.48 0.24 0.12 0.4 0.2 0.1 0.72 0.36 0.18 IL-2/（ng/L）106.79±8.78 44.35±9.46*96.41±10.52△136.24±15.49*110.15±13.28 108.22±13.17 158.74±10.55*144.13±12.43*119.11±9.19*59.34±12.19△50.08±9.42 46.72±8.44 100.08±11.42△78.23±8.27△54.73±12.81 IFN-γ/（ng/L）168.77±12.56 85.28±16.89*147.77±18.73△174.39±16.48 169.14±12.73 166.41±22.15 200.12±18.54*172.46±15.42 169.33±17.29 96.16±23.14 92.45±22.51 88.47±20.43 132.69±13.79△116.47±14.82△100.00+14.29 TNF-α/（ng/L）52.52±8.41 22.34±10.12*49.18±8.74△75.34±11.10*70.27±10.52*60.89±9.98 84.27±9.51*78.13±14.29*71.24±10.38*39.99±11.14△32.54±13.17△23.89±17.21 51.37±9.79△44.59±10.64△29.74±16.55△

3 討論

環(huán)磷酰胺是用于惡性腫瘤的抗癌化療藥物，系常用的免疫抑制劑[11-12]。目前，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型已被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用第1~3天腹腔注射80 mg/kg環(huán)磷酰胺后1周強(qiáng)化1次的方法建立免疫抑制小鼠模型[13]。結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺使模型組小鼠的免疫臟器指數(shù)、吞噬功能、血清溶血素水平、血清細(xì)胞因子水平均明顯降低，說明造模成功。

脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)通常用來評價(jià)機(jī)體的整體免疫狀態(tài)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎖陽醇提物對正常生理小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)沒有明顯的影響，鎖陽水提物可明顯提高正常生理小鼠脾臟指數(shù)。鎖陽醇提物和水提物均可明顯提高免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，高劑量鎖陽水提物可以將免疫抑制小鼠胸腺和脾臟恢復(fù)到正常水平。巨噬細(xì)胞的吞噬功能是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對抗原識(shí)別、呈遞和免疫應(yīng)答起著重要作用[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎖陽醇提物對正常生理小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)沒有明顯的影響；鎖陽水提物可明顯提高正常生理小鼠的廓清指數(shù)。鎖陽醇提物和水提物均可明顯提高免疫抑制小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，高劑量鎖陽水提物可將受損的小鼠吞噬功能恢復(fù)到正常水平。血清溶血素是反映機(jī)體體液免疫水平的重要指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎖陽醇提物不能促進(jìn)正常生理小鼠血清溶血素抗體的生成；鎖陽水提物可明顯促進(jìn)正常生理小鼠血清溶血素抗體的生成。鎖陽醇提物和水提物均可明顯促進(jìn)免疫抑制小鼠血清溶血素抗體的生成，高劑量鎖陽水提物對血清溶血素抗體生成的促進(jìn)作用與陽性藥物相當(dāng)。細(xì)胞因子通過影響免疫細(xì)胞增殖、分化和其它功能來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎖陽醇提物可以提高正常生理小鼠和免疫抑制小鼠IL-2和TNF-α分泌水平；鎖陽水提物可以提高正常生理小鼠和免疫抑制小鼠IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌水平。高劑量鎖陽水提物對TNF-α分泌水平的影響與陽性藥物相當(dāng)。

綜上所述，鎖陽醇提物對正常生理小鼠和免疫抑制小鼠有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，但是與醇提物相比，水提物的免疫調(diào)節(jié)作用更好，主要表現(xiàn)在：提高胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，促進(jìn)機(jī)體發(fā)育；增強(qiáng)吞噬功能；促進(jìn)溶血素抗體的生成，增強(qiáng)體液免疫；提高IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫。本研究為今后進(jìn)一步明確鎖陽免疫調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了方向和研究基礎(chǔ)，為鎖陽調(diào)節(jié)免疫功能保健品的開發(fā)和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。