DFO對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

馬 寧，陳宇，黃一丹，楊龍，吳建江

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，烏魯木齊 830054）

糖尿病作為一組由多病因引起的代謝疾病，發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到11.6%[1]。糖尿病患者在病程中易合并心血管疾病，這種風(fēng)險(xiǎn)每10年增加1.38倍[2]。患有糖尿病和缺血性心臟病的病人一旦需要接受手術(shù)治療，相比無合并癥的病人發(fā)生缺血性心肌損傷的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[2]。目前尚無能夠有效減輕糖尿病患者圍手術(shù)期間發(fā)生缺血性心肌損傷的臨床干預(yù)措施。圍術(shù)期心肌缺血/再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury,IR/I）對(duì)于罹患糖尿病的病人來說后果是非常嚴(yán)重的。有研究顯示，非糖尿病狀態(tài)下，七氟醚后處理（Sevoflurane postconditionning,SPostC）可以通過促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）入核表達(dá)，調(diào)控線粒體呼吸功能，減輕大鼠缺血性心肌損傷[3]。但在糖尿病狀況下七氟醚后處理保護(hù)作用減退[4]，具體機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究認(rèn)為，受損的HIF-1α在糖尿病狀態(tài)下無法調(diào)控線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶可能是導(dǎo)致七氟醚后處理作用失敗的重要原因。本研究旨在觀察去鐵胺（DFO）處理后如何改善糖尿病大鼠線粒體呼吸功能，恢復(fù)七氟醚對(duì)心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 心臟離體灌注模型SPF級(jí)雄性非胰島素依賴非肥胖自發(fā)Ⅱ型糖尿?。℅K）大鼠80只，體重300~350 g，14~16周齡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010。建立Langendorff模型[5]：戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取出心臟，絲線綁于Langendorff灌注架上，逆行灌注（K-H液，37℃平衡95%O2-5%CO2），連接Powerlab多道生理記錄儀。上述步驟2 min內(nèi)完成。納入標(biāo)準(zhǔn)：離體心臟平衡（37℃K-H液）20 min后，心率（HR）＞250次/min、左室舒張壓（LVDP）＞80 mmHg、室性早搏<2次/min。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組80個(gè)離體灌注心臟按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組（n=16）：對(duì)照組（C組）、缺血再灌注組（I/R組）、七氟醚后處理組（SPostC組）、去鐵胺+七氟醚后處理組（DFO+SPostC）、去鐵胺+七氟醚后處理+HIF-1α抑制劑二甲氧基雌二醇（2ME2）組（DFO+SPostC+2ME2）。C組持續(xù)灌注K-H液180 min；I/R組平衡20 min，缺血40 min，再灌注120 min；SPostC組在缺血末灌注2.4%七氟醚（批號(hào)：67081，Maruishi Pharmaceuti?cal公司，日本）飽和的K-H液15 min后，續(xù)灌正常KH液105 min；DFO+SPostC組：在缺血前24 h腹腔給予200 mg/kg DFO，其余同SPostC組；2ME2組復(fù)灌含2ME2（批號(hào)：S1233，Selleck公司，美國）+2.4%七氟醚飽和的K-H液15 min后，續(xù)灌正常K-H液105 min。

1.3 線粒體（State3）、呼吸控制率RCR測定參照文獻(xiàn)[6-7]方法，采用漢莎氧電極（Hansatech Ltd公司，英國），按照Bradford蛋白濃度定量試劑盒（碧云天），測定線粒體3態(tài)、4態(tài)呼吸，記錄耗氧曲線變化情況，RCR=State3/State4。

1.4 線粒體呼吸酶活性測定采用Clark-氧電極，參照文獻(xiàn)[8]方法，分別測定煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NADHO）、細(xì)胞色素c氧化酶（CcO）、琥珀酸氧化酶（SUCO）等5~10 min反應(yīng)曲線，測定線粒體呼吸酶活性。

1.5 心肌超微結(jié)構(gòu)觀察再灌注結(jié)束各組隨機(jī)取1 mm×1 mm×1 mm左室心肌，按流程脫水包埋染色后經(jīng)H-600型透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)（×10 000，Hitachi公司，日本）。

1.6 Western blot法檢測HIF-1α表達(dá)取液氮中左室心肌組織，提組織蛋白、裂解、電泳、轉(zhuǎn)膜后分別加入一抗即鼠抗HIF-1α單克隆抗體和山羊抗GAP?DH多克隆抗體，在4℃條件下孵育過夜，用TBST液洗3次，每次10 min，加入二抗抗鼠IgG-HRP和抗山羊IgG-HRP室溫孵育1 h（抗體均購自Sigma公司，美國）。應(yīng)用Quantity One系統(tǒng)在ECL-plus試劑盒顯色后行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS25.0軟件分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用one-way ANOVA，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體呼吸功能比較與C組相比，I/R組、SPostC組、DFO+SPostC組、DFO+SPostC+2ME2組State3、RCR降 低（P<0.05）；與I/R組 比 較，DFO+SPostC組State3、RCR增高（P<0.05），但SPostC組、DFO+SPostC+2ME2組 與I/R組 的State3和RCR差 異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 心肌細(xì)胞線粒體State3和RCR活性的比較（n=8，nmol/min-1·mg-1·pro-1，±s）

表1 心肌細(xì)胞線粒體State3和RCR活性的比較（n=8，nmol/min-1·mg-1·pro-1，±s）

注：與C組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與DFO+SPostC組比較，cP<0.05。

組別C組I/R組SPostC組DFO+SPostC組DFO+SPostC+2ME2組再灌注期末State3 115.33±5.19 70.96±2.87a 69.85±3.54a 89.33±6.22ab 64.91±4.17ac RCR 2.1±0.21 1.25±0.05a 1.28±0.03a 1.82±0.10ab 1.19±0.07ac

2.2 5組線粒體呼吸酶活性比較與C組比較，I/R組、SPostC組、DFO+SPostC、DFO+SPostC+2ME2組CcO、NADHO和SUCO活性降低（P<0.05）；與I/R組比較，DFO+SPostC組CcO、NADHO及SUCO活性升高（P<0.05），但SPostC組、DFO+SPostC+2ME2組與I/R組CcO、NADHO和SUCO活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與DFO+SPostC組比較，DFO+SPostC+2ME2組CcO、NADHO和SUCO活性降低（P<0.05），見表2。

表2 心肌細(xì)胞線粒體NADHO、CcO和SUCO活性的比較（n=8，nmol/min-1·mg-1·pro-1，±s）

表2 心肌細(xì)胞線粒體NADHO、CcO和SUCO活性的比較（n=8，nmol/min-1·mg-1·pro-1，±s）

注：與C組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與DFO+SPostC組比較，cP<0.05。

組別C組I/R組SPostC組DFO+SPostC組DFO+SPostC+2ME2組再灌注期末NADHO 231.61±6.16 161.40±4.25a 159.95±3.18a 184.62±4.31ab 157.29±5.57ac CcO 71.67±5.05 46.64±4.20a 48.97±3.41a 61.03±2.31ab 44.12±3.10ac SUCO 77.16±6.14 44.97±4.64a 45.96±4.16a 63.45±3.29ab 42.32±4.00ac

2.3 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)C組心肌結(jié)構(gòu)未見明顯損傷，線粒體排列整齊。I/R組、SPostC組、DFO+SPostC+2ME2組心肌結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，肌絲溶解；線粒體腫脹且數(shù)量少。DFO+SPostC組線粒體形態(tài)完整，嵴膜清晰可見，未見溶解破裂。見圖1。

圖1 電鏡下各組心肌超微結(jié)構(gòu)（×10 000）

2.4 5組HIF-1α蛋白表達(dá)比較DFO+SPostC組HIF-1α表達(dá)顯著提高，與I/R組、SPostC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 各組HIF-1α蛋白表達(dá)Western blot條帶圖

表3 各組HIF-1α蛋白表達(dá)（n=8，±s）

表3 各組HIF-1α蛋白表達(dá)（n=8，±s）

注：與I/R組相比，*P＜0.05；與DFO+SPostC組相比，#P＜0.05。

組別C組I/R組SPostC組DFO+SPostC組DFO+SPostC+2ME2組HIF-1α 0.152±0.005 0.365±0.012 0.342±0.032 0.985±0.021*0.302±0.010#

3 討論

本研究選擇Langendoff離體灌注模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖尿病大鼠心肌在I/RI后心肌肌絲溶解，結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，線粒體數(shù)量減少且腫脹，提示心肌I/RI模型制備成功。此外，SPostC組各指標(biāo)與I/R組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明在糖尿病狀態(tài)下后處理無法有效減輕心肌缺血的傷害，這與GAO等[4]利用胰島素治療無法逆轉(zhuǎn)SPostC保護(hù)作用的研究結(jié)論一致。

線粒體以ATP的形式產(chǎn)生能量，是細(xì)胞中具有核心地位的“發(fā)動(dòng)機(jī)”。除此之外，線粒體也是能量代謝中心與細(xì)胞內(nèi)各種生存信號(hào)的靶效應(yīng)器。心肌能量代謝紊亂是導(dǎo)致糖尿病心肌對(duì)抗I/RI能力下降和易損性增加的關(guān)鍵，而功能完整的線粒體是確保心肌動(dòng)力充足的根源。本研究通過測定State3和RCR反應(yīng)細(xì)胞的能量產(chǎn)生，測定線粒體3態(tài)、4態(tài)呼吸，以判斷線粒體呼吸功能。

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）對(duì)心血管系統(tǒng)的正常重構(gòu)發(fā)揮重要作用，YEO等[5]及Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，I/RI時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致ATP合成減少，會(huì)進(jìn)一步使得缺血性心肌損傷程度惡化，但GAO等[4]研究證實(shí)，心肌組織缺氧時(shí)HIF-1α顯著上調(diào)，能通過減少線粒體來源的氧自由基（ROS）生成且維持CcO活性，從而避免心肌線粒體損傷。因此HIF-1α可能是緩解心肌缺血缺氧致線粒體損傷的內(nèi)源性調(diào)控靶點(diǎn)。新近研究發(fā)現(xiàn)，非糖尿病狀態(tài)下SPostC可以上調(diào)HIF-1α表達(dá)，改善線粒體呼吸功能及呼吸酶活性，減輕缺血性心肌損傷[3]，但這種優(yōu)勢(shì)無法在糖尿病狀態(tài)下體現(xiàn)[4]，具體原因尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠SPostC組與I/R組相比，線粒體呼吸功能及呼吸酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且心肌超微結(jié)構(gòu)受損程度相似，這與GAO[4]實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。本研究結(jié)果顯示，DFO+SPostC組反映線粒體呼吸功能的各指標(biāo)較SPostC組與I/R組明顯改善，在一定情況下DFO干預(yù)是恢復(fù)糖尿病狀態(tài)下SPostC心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵。

DFO已被廣泛用作鐵超載狀態(tài)的螯合療法，在血漿組織中快速被酶代謝。DFO是一種高選擇性的鐵螯合劑，糖尿病患者全身或者局部應(yīng)用DFO都能穩(wěn)定并激活HIF-1α，從而促進(jìn)糖尿病患者傷口的愈合[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，I/R組HIF-1α表達(dá)并沒有增加，這與Wu等[11]的研究結(jié)論一致，說明在糖尿病狀態(tài)下HIF-1α無法正常入核表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)給予DFO后發(fā)現(xiàn)，DFO+SPostC組的HIF-1α蛋白表達(dá)明顯升高，并且State3、RCR及NADHO等酶活性明顯優(yōu)于I/R組、SPostC組，同時(shí)心肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。這表明HIF-1α可能是介導(dǎo)SPostC減輕糖尿病心肌缺血性損傷的關(guān)鍵靶標(biāo)，DFO作為HIF-1α的激動(dòng)劑，能夠激活糖尿病狀態(tài)下受損的HIF-1α，在此基礎(chǔ)上結(jié)合SPostC能夠進(jìn)一步促進(jìn)HIF-1α入核表達(dá)，從而改進(jìn)線粒體呼吸功能及呼吸酶活性，最終減輕糖尿病大鼠缺血性心肌損傷。

本研究在給予DFO處理后，發(fā)現(xiàn)DFO+SPostC組3態(tài)呼吸、RCR及NADHO等酶活性較I/R組明顯改善，但是給予HIF-1α抑制劑后發(fā)現(xiàn)，DFO+SPostC+2ME2組3態(tài)呼吸、RCR及NADHO等酶活性明顯降低，且伴隨心肌結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損、肌絲溶解、線粒體明顯腫脹。提示在糖尿病狀態(tài)下，DFO對(duì)線粒體呼吸功能產(chǎn)生影響的關(guān)鍵在于穩(wěn)定HIF-1α的功能，而給予SPostC進(jìn)一步促進(jìn)HIF-1α入核表達(dá)，調(diào)節(jié)線粒體呼吸功能及呼吸鏈酶活性，維持缺血再灌注期的心肌能量供應(yīng)以減輕缺血性心肌損傷。

綜上所述，DFO能夠恢復(fù)糖尿病狀態(tài)下SPostC的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控HIF-1α、進(jìn)一步改善線粒體呼吸鏈能量生成，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。