Hippo信號通路中Phospho-MOB1和TEAD4蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

蘇 毓，童喬瑩，陳青立，夏嘉男，龔忠誠

（1新疆醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/附屬口腔醫(yī)院頜面腫瘤外科,烏魯木齊 830054）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC)在我國是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率仍呈現(xiàn)出上升趨勢，且發(fā)病年齡越來越趨于年輕化[1],然而隨著口腔鱗狀細(xì)胞癌的診治技術(shù)的進(jìn)步，其發(fā)病率和死亡率仍居高不下。Hippo信號通路是一條高度保守的首次在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的信號通路，具有調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡，控制組織器官大小和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的功能[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號通異常與食管鱗狀細(xì)胞癌[3]、乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、肺癌[6]、肝細(xì)胞癌[8]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)被認(rèn)為是細(xì)胞調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)YAP在多種腫瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)和核累積趨勢，對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為具有重要意義[9]。

Hippo信號通路中核心蛋白Mst1,Lats1/2和YAP與OSCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及OSCC患者預(yù)后具有明顯相關(guān)性[10]。然而關(guān)于Hippo信號通路在OSCC中機(jī)制的研究尚不清晰,本研究探討Hippo信號通路中YAP上游的蛋白Phospho-MOB1和下游的TEAD4蛋白在OSCC中表達(dá)及其臨床相關(guān)性，以期為臨床中OSCC的診斷、治療提供新的思路與靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面腫瘤外科2005年12月－2016年9月經(jīng)病理科確診的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，85例OSCC病例(實(shí)驗組)和14例癌旁正常組織病例(對照組)完整的臨床資料，收集OSCC患者的臨床資料樣本時剔除臨床隨訪資料不全者。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會的審核，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 隨訪通過電話的形式進(jìn)行隨訪，隨訪至患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)為止，對于無復(fù)發(fā)病例隨訪截止至2017年10月30日；本研究無失訪患者，有效隨訪率為100%。復(fù)發(fā)定義為出現(xiàn)腫物，經(jīng)過臨床及影像學(xué)檢查，并最終病理確診的患者為復(fù)發(fā)患者。

1.3 主要試劑及設(shè)備兔抗人Phospho-MOB1單克隆抗體(Cell Signaling，#8699,1:100)；兔抗人TEAD4多克隆抗體（Abcam,#97460,1:300）；免疫組化SP法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzine，DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色采用免疫組化染色方法檢測Phospho-MOB1及TEAD4的表達(dá)。切片經(jīng)脫蠟、水化、3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、蒸餾水及磷酸鹽緩沖液浸泡，枸櫞酸微波加熱修復(fù)抗原。分別滴加一抗4℃15 h(Phospho-MOB1 1:100；TEAD4 1:300)。二抗37℃孵育30 min、DAB染色。常規(guī)蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹脂封片后鏡下觀察。磷酸化MOB1以肺鱗狀細(xì)胞癌為陽性對照，TEAD4以卵巢癌為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。免疫組化染色結(jié)果判斷：Phospho-MOB1、TEAD4均以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，只有胞質(zhì)陽性視為非特異染色。每張切片選擇5個典型的高倍視野(×400)，計數(shù)至少500個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞核百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分類。用染色強(qiáng)度聯(lián)合陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分：染色強(qiáng)度分4個等級：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比為5個等級：陽性細(xì)胞<10%為0分(陰性)，10%~25%為1分，26%~50%為2分，51%~75%為3分，＞76%；兩者之和為最后分：0分為陰性，1~2分為（+），3~4分為（++），＞4分為（+++），1~4分為低表達(dá)，＞4分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果行統(tǒng)計學(xué)處理，非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。OSCC患者生存分析使用Kaplan-Meier法，采用Cox進(jìn)行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Phospho-MOB1和TEAD4蛋白在OSSC及癌旁正常組織中的表達(dá)情況Phospho-MOB1表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，呈淡黃色顆粒,癌組織與癌旁正常組織中均有散在分布(圖1)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.151）。TEAD4蛋白表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色或棕褐色顆粒，以癌巢周邊表達(dá)強(qiáng)烈，小部分OSCC組織與癌旁正常組織中未見黃染或呈淡黃色（圖2）；TEAD4蛋白在OSCC與癌旁正常組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02），相較于癌旁正常組織，TEAD4蛋白在OSCC組織細(xì)胞核中明顯高表達(dá)（表1）。

圖1 Phospho-Mob1蛋白在OSCC中的表達(dá)

圖2 TEAD4蛋白在OSCC中的表達(dá)

2.2 TEAD4蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征關(guān)系TEAD4的高表達(dá)與患者的飲酒習(xí)慣、結(jié)局、腫瘤的復(fù)發(fā)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；TEAD4的表達(dá)與患者的性別、年齡、族別、吸煙習(xí)慣、腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)累及差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌患者TEAD4表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 TEAD4蛋白表達(dá)情況與OSCC患者生存分析85例患者隨訪至術(shù)后1~130個月，中位隨訪時間為16.5個月。85例患者中18例患者死亡（21.2%），18例出現(xiàn)復(fù)發(fā)（21.2%），復(fù)發(fā)患者中13例患者死亡（72.2%）。TEAD4蛋白的表達(dá)和OSCC患者的帶瘤生存時間、無瘤生存時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖3~4。

圖3 OSCC患者Kaplan-Meier帶瘤生存時間曲線

2.4 TEAD4蛋白的Cox分析腫瘤的分化程度（HR<1；P=0.009）是OSCC患者的預(yù)后獨(dú)立保護(hù)性因素，即腫瘤分化程度越高，患者預(yù)后越好；TEAD4蛋白的高表達(dá)是OSCC患者的預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素（HR＞1；P=0.000029）。見表2。

表2 OSCC患者臨床資料單因素與多因素Cox分析

圖4 OSCC患者Kaplan-Meier無瘤生存時間曲線

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療主要以手術(shù)治療為主，放化療為輔[11]，但依舊面臨術(shù)后局部復(fù)發(fā)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等問題。Hippo信號通路可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增長和凋亡，YAP作為Hippo信號通路中的關(guān)鍵蛋白，直接或間接靶向作用于YAP從而對腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)行調(diào)控，或許對OSCC的診治提供了的新的方向[[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)Phospho-MOB1蛋白在OSCC和癌旁正常組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；可能存在其他調(diào)控途徑，或與其他蛋白共同作用生成磷酸化復(fù)合物后再調(diào)控下游產(chǎn)物，其研究結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。已有研究發(fā)現(xiàn)通過MOB1蛋白的缺失將異常激活YAP蛋白，導(dǎo)致膽管細(xì)胞異常增生，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，是小鼠和人肝癌重要的驅(qū)動因素[13]。

本研究結(jié)果顯示，TEAD4蛋白高表達(dá)與OSCC患者的飲酒習(xí)慣、復(fù)發(fā)及結(jié)局轉(zhuǎn)歸有關(guān)；TEAD4低表達(dá)的患者帶瘤生存時間與無瘤生存時間明顯長于TEAD4蛋白高表達(dá)的患者；TEAD4蛋白的高表達(dá)是OSCC患者的預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素，即TEAD4蛋白表達(dá)水平高，提示患者預(yù)后差。在Hippo信號通路與胃癌[14]、大腸癌[15-16]等的研究中也發(fā)現(xiàn)TEAD4蛋白與患者的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后有關(guān)。但本研究方法較為單一，后續(xù)可改進(jìn)實(shí)驗方法、增加實(shí)驗方法的多樣性，擴(kuò)大樣本含量以補(bǔ)充研究。

綜上，TEAD4蛋白表達(dá)水平與OSCC的發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)，可為OSCC的治療提供TEAD4/YAP軸的潛在選擇,有望作為評估OSCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。