基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的膿毒癥休克轉(zhuǎn)錄因子挖掘及驗(yàn)證

林 爽，白永江，馬駿麒

（新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院急診科,烏魯木齊 830000）

膿毒癥(sepsis)是指因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，膿毒癥休克作為膿毒癥的一種，存在循環(huán)、代謝功能異常［1］。膿毒癥早期過度激活的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成一系列嚴(yán)重?fù)p傷甚至導(dǎo)致器官功能衰竭發(fā)生膿毒癥休克，是感染引起宿主機(jī)體免疫失調(diào)的表現(xiàn)之一，是膿毒癥患者早期死亡的重要原因［2］。近年來，國內(nèi)外關(guān)于膿毒癥的基礎(chǔ)與臨床研究較多，但完全闡明膿毒癥休克的具體發(fā)病機(jī)理的研究較少。既往基因組及轉(zhuǎn)錄組的研究中，關(guān)注膿毒癥患者與健康人的差異研究較多[3]，而關(guān)于膿毒癥休克的作用機(jī)制相關(guān)研究尚不充分。有研究表明，對(duì)膿毒癥患者實(shí)施早期預(yù)警，識(shí)別危險(xiǎn)因素，可更快、更準(zhǔn)確地進(jìn)行規(guī)范化治療，有助于膿毒癥的診斷、治療及預(yù)后[4]。因此，本研究著力于闡明膿毒癥患者發(fā)展為膿毒癥休克的分子機(jī)制，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選差異基因，進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）及基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫富集分析，檢測(cè)與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路，對(duì)基因表達(dá)層面上的差異進(jìn)行分析，進(jìn)一步說明信號(hào)通路參與識(shí)別及應(yīng)答膿毒癥患者發(fā)展為膿毒癥休克的作用機(jī)制,為進(jìn)一步防治膿毒癥休克提供早期診斷治療策略。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組選擇2019年6月-2021年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院急診科住院診斷為膿毒癥患者70例作為研究對(duì)象，根據(jù)隨訪患者病情及預(yù)后，分為膿毒癥休克組、膿毒癥非休克組，每組35例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)：膿毒癥與膿毒性休克治療國際指南（2016版）》[5]中膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)序貫器官衰竭評(píng)分（SOFA）較基線上升≥2分。膿毒癥休克的診斷在膿毒癥的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)持續(xù)性低血壓，在充分容量復(fù)蘇后仍需血管活性藥以維持，且平均動(dòng)脈壓（MAP）低于65 mmHg、血乳酸濃度＞2 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲或＞85歲，不可逆的臨終狀態(tài)或預(yù)測(cè)24 h內(nèi)死亡者；患有嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，且格拉斯哥昏迷評(píng)分(glasgow coma score,GCS)評(píng)分<5分；患者及家屬不配合治療；腎功能不全者；基礎(chǔ)心臟功能疾病或急性冠脈綜合征、心源性休克者；妊娠期患者。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫審委員會(huì)審批通過（2019XE0149-1），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般情況與感染指標(biāo)分析分析兩組年齡、體重等一般資料的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)血漿白細(xì)胞介素-6（IL-6）、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平等進(jìn)行比較。

1.2.2 差異基因分析采集的新鮮全血置于EDTA抗凝管保存，并進(jìn)行mRNA測(cè)序[6]。總RNA抽提試劑Trizol 6 mL與新鮮血液2 mL（Trizol∶血液=3∶1）,混勻1～2 min，直至絮狀物充分溶解。室溫孵育5 min，至核蛋白體完全分解，編號(hào)、封存，液氮速凍，-80°C凍存，共進(jìn)行20例mRNA測(cè)序。

1.2.3 差異表達(dá)基因GO及KEGG富集分析[7]采用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)測(cè)序所獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，獲得高質(zhì)量的過濾后片段（clean reads）并進(jìn)行分析。采用PE150測(cè)序策略，樣本測(cè)序量為6 G對(duì)轉(zhuǎn)錄組RNA-seq進(jìn)行基因表達(dá)量測(cè)定。對(duì)樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行高通量測(cè)序，將測(cè)序片段（reads）與參考序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算基因表達(dá)量測(cè)定轉(zhuǎn)錄所得的mRNA水平。差異表達(dá)基因(DEGs，differentially ex?pressed genes)的篩選條件：差異倍數(shù)log2(FoldChange)＞1為上調(diào)表達(dá)；log2(FoldChange)<-1為下調(diào)表達(dá)。對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行多元分析，并采用火山圖進(jìn)行可視化展示。GO是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，包括生物過程BP（biological process）、細(xì)胞組成CC（cellular component）及 分 子 功 能MF（molecular function）3個(gè) 部 分。GO功 能 富集以矯正 后的P值（p.adj）<0.05作為顯著性富集。通過KEGG富集分析，檢測(cè)關(guān)鍵信號(hào)通路，篩選出核心基因，并以p.adj<0.05作為顯著性富集的閾值。

1.2.4 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析[7]采用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。針對(duì)數(shù)據(jù)庫中包含的物種，從數(shù)據(jù)庫中提取目標(biāo)基因集(如差異基因列表)的互作關(guān)系進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；利用比對(duì)上的該參考物種蛋白質(zhì)互作關(guān)系構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖。互作網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)(node)的大小與此節(jié)點(diǎn)的度(degree)成正比，即與此節(jié)點(diǎn)相連的邊越多，度越大，則節(jié)點(diǎn)也越大，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中可能處于較核心位置。節(jié)點(diǎn)的顏色與此節(jié)點(diǎn)的聚集系數(shù)(clustering coefficient)相關(guān)，顏色梯度由綠到紅對(duì)應(yīng)聚集系數(shù)的值由低到高；聚集系數(shù)值越高，此節(jié)點(diǎn)的鄰接點(diǎn)之間的連通性越好。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）分析排名前十位的差異基因，對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路中的核心基因進(jìn)行擴(kuò)大樣本量qPCR驗(yàn)證。匹配正常人20例，膿毒癥非休克組患者20例，膿毒癥休克組患者20例，擴(kuò)增條件：95℃10 min預(yù)變性，95℃10 s變性,58℃30 s退火,72℃10 s延伸,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。定量表達(dá)結(jié)果根據(jù)每次反應(yīng)內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所需循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT）數(shù)值，根據(jù)2-ΔΔCt法，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)及合成，見表1。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料與感染指標(biāo)結(jié)果比較兩組研究對(duì)象基本情況無明顯差異，具有可比性（P＞0.05），見表2。兩組血漿IL-6、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表2 兩組一般資料比較（±s）

表2 兩組一般資料比較（±s）

指標(biāo)年齡/歲體重/kg n 35 35膿毒癥休克組67.06±8.94 66.77±8.65膿毒癥非休克組66.94±8.81 66.71±8.58 t值0.054 0.028 P值0.95 0.97

表3 兩組IL-6、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平的比較（±s）

表3 兩組IL-6、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平的比較（±s）

組別膿毒癥休克組膿毒癥非休克組t值P n 35 35 IL-6/（pg/mL）65.94±15.45 23.86±6.38 14.89<0.05降鈣素原/（ng/mL）32.94±9.58 9.57±4.81 12.89<0.05 C反應(yīng)蛋白/（mg/L）47.46±7.98 18.94±3.90 18.98<0.05

2.2 差異基因分析火山圖結(jié)果顯示，上、下調(diào)基因分布基本均勻，見圖1。差異基因篩選共獲得28 543個(gè)差異基因，其中下調(diào)基因1 126個(gè)，STAT1為前十名的差異基因；上調(diào)基因1 053個(gè)，MYD88、JUN2均為前十名的差異基因，見圖2。

圖1 差異基因火山圖

圖2 差異表達(dá)基因聚類熱圖

2.3 差異表達(dá)基因GO及KEGG分析結(jié)果比較GO富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)差異基因功能集中于生物過程(biological process)，包括中性粒細(xì)胞脫顆粒、中性粒細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答、免疫檢測(cè)過程的調(diào)控等，下調(diào)差異基因功能集中于細(xì)胞組成（cellular component）包括溶酶體顆粒釋放、細(xì)胞膜水解酶活性改變等，而分子功能(molecular function)主要調(diào)控腫瘤壞死因子受體超家族s補(bǔ)體結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合、RNA聚合酶原裂解酶活性改變、UDP糖基轉(zhuǎn)移酶活性改變等，見圖3。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體信號(hào)通路(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NOD)，Toll樣受體信號(hào)通路(toll like receptors,TLRs)，視黃酸誘導(dǎo)基因1樣受體信號(hào)通路(retinoicacidinduciblegene-1，RIG-1)等均與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。結(jié)合差異基因分析，STAT1、MYD88、JUN2基因均屬于TLRs通路相關(guān)基因，TLRs通路為富含前十位差異基因最多的信號(hào)通路，見圖4。

圖3 GO富集分析結(jié)果

圖4 KEGG富集分析結(jié)果

2.4 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作分析TLRs信號(hào)通路中對(duì)疾病發(fā)生起上調(diào)作用的基因?yàn)镸APK3、MYD88、TOL?LIP、MAP2K3、RELA、JUN2、FADD；下調(diào)作用的基因?yàn)镃XCL10、CXCL9、CXCL11、IRF7、MAPK12、STAT1，見圖5。

圖5 TLR通路蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.5實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）檢測(cè)結(jié)果TLRs信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的MYD88、JUN2、CXCL10、STAT1基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，MYD88、JUN2基因在膿毒癥休克組中的相對(duì)表達(dá)量高于膿毒癥非休克組，CXCL10、STAT1在膿毒癥休克組中的相對(duì)表達(dá)量低于膿毒癥非休克組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖6。

圖6 PCR驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

膿毒癥是由嚴(yán)重的感染引起的全身性炎反應(yīng)，而膿毒癥休克為其較嚴(yán)重的情況，其死亡率較高。目前有證據(jù)表明[8-9],膿毒癥休克的急診優(yōu)化治療,可以提高治療質(zhì)量,由此改善此類患者的預(yù)后，本研究關(guān)注膿毒癥休克的早期診斷，通過轉(zhuǎn)錄組高通量篩選技術(shù)分析膿毒癥非休克患者及膿毒癥休克患者差異基因，對(duì)差異基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫富集分析出影響膿毒癥休克發(fā)病的信號(hào)通路，NODlike通路，TLRs信號(hào)通路、RIG-1樣受體信號(hào)通路等與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。經(jīng)差異基因分析顯示，排名前十名的差異基因STAT1，MYD88、JUN2均屬于TLRs通路。TLRs受體家族的成員可以識(shí)別傳統(tǒng)的微生物菌株結(jié)構(gòu)，參與先天免疫與后天免疫，在宿主防御中起著關(guān)鍵作用。經(jīng)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，篩選TLRs通路中可能影響膿毒癥休克發(fā)病的關(guān)鍵基因，TLRs通路中對(duì)疾病發(fā)生起上調(diào)作用的基因?yàn)镸APK3，MYD88，TOLLIP，MAP2K3，RELA，JUN2，F(xiàn)ADD，下 調(diào) 作 用 的 基 因 為CXCL10，CXCL9，CX?CL11，IRF7，MAPK12，STAT1。

研究表明[10-13]，MYD88基因編碼是一種在先天性與適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起中心作用的細(xì)胞溶質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在白細(xì)胞介素-1、TLRs信號(hào)通路中起著重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，調(diào)節(jié)諸多促炎癥基因的激活；JUN2基因編碼與病毒蛋白高度相似的蛋白質(zhì)；CXCL10基因編碼CXC亞家族的趨化因子可以刺激單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞遷移以及調(diào)節(jié)黏附分子的表達(dá)，起到抑制炎癥的作用；STAT1基因編碼的蛋白質(zhì)可被多種配體激活，包括α干擾素、γ干擾素和白細(xì)胞介素6，在對(duì)病毒、真菌及分枝桿菌病原體的免疫應(yīng)答中起重要作用。根據(jù)差異基因分析及蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果選取TLRs信號(hào)通路中MYD88,JUN2，CXCL10，STAT1基因進(jìn)行擴(kuò)大樣本量qPCR驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析一致。

綜上所述，本研究得到與導(dǎo)致膿毒癥易于發(fā)展為膿毒癥休克的機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步的預(yù)防與制定治療策略提供可能的研究方向。