固定化脂肪酶催化合成單硬脂酸甘油酯的研究

洪 鄭 史立文 鐘 凱 裴壯壯 方靈丹 洪玉倩 黃 晴

（贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州，311300）

單硬脂酸甘油酯（glycerol monostearate，MG）是一種重要的多元醇型非離子表面活性劑，分子式為C21H42O4，熔點為68～70℃，相對密度0.96 g/cm3，可燃，無味，無毒害作用，受熱會熔化成淺黃色透明液體。其具有α和β兩種異構(gòu)體，兩種異構(gòu)體都具有良好的乳化性能，但α-異構(gòu)體的乳化性能更優(yōu)，兩種異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)式見圖1。β-單甘酯不穩(wěn)定，在受熱或紫外線條件下會轉(zhuǎn)化成α-單甘酯[1-2]。

圖1 單甘酯的結(jié)構(gòu)

單硬脂酸甘油酯最早是由Berthdot于1853年在實驗室將脂肪酸與甘油直接酯化合成。1929年在美國最先實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，1943年人們發(fā)現(xiàn)用分子蒸餾法提純可得到高純度(90%以上)的單甘酯，1950年開始用該法進(jìn)行高純度單甘酯的生產(chǎn)[1]。單硬脂酸甘油酯具有乳化、柔軟、抗霧、抗靜電、潤滑等特性，是優(yōu)良的食品級乳化劑和添加劑，已成為食品、日用化工及醫(yī)藥工業(yè)上不可缺少的乳化劑品種之一。隨著我國食品和日化工業(yè)的飛速發(fā)展，單甘酯的需求量也越來越大[2]。

傳統(tǒng)合成單甘酯的方法主要是化學(xué)法,化學(xué)法通過加入無機(jī)催化劑可以快速地制備單甘酯。但從目前的研究和應(yīng)用現(xiàn)狀來看,化學(xué)法合成單甘酯仍存在以下問題：反應(yīng)條件劇烈,需要200～250 ℃的高溫。高溫環(huán)境不僅增加了能耗，還會導(dǎo)致單甘酯的熱分解和副產(chǎn)物二甘酯(DAG)、三甘酯(TAG)含量的增多,制備的單甘酯色澤深、氣味重[3-6]。酶催化法從合成工藝上徹底顛覆了傳統(tǒng)化學(xué)法依賴的高溫條件,反應(yīng)溫度一般不超過80 ℃,可有效地降低能耗,減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生,提高單甘酯的收率和質(zhì)量[7-15]。酶催化法合成單甘酯主要有酯化法、甘油解法、水解法和酯交換法,其中酯化法和甘油解法是主要的合成方法[9-15]。本文采用甘油解法，主要研究了以氫化油和甘油為原料，以固定化脂肪酶為催化劑在無溶劑體系中合成單硬脂酸甘油酯時，底物摩爾比、脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間對粗酯中單甘酯含量的影響。

油脂甘油醇解法的反應(yīng)原理見圖2。

圖2 油脂甘油醇解法的反應(yīng)原理

1 實驗儀器與材料

1.1 試驗材料

氫化油：熔點60 ℃。杭州油脂化工有限公司。

甘油：水分0.5%，含量99%。杭州油脂化工有限公司。

Lipozyme TL IM、Lipozyme R M、Lipozyme 435、Lipozyme NS400168：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

碘化鉀、高碘酸、高氯酸、冰乙酸、硫代硫酸鈉、淀粉均為分析純：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

AR1502CN型電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司；ST3100 PH計：奧豪斯儀器（常州）有限公司。

2 試驗方法

2.1 脂肪酶催化合成單硬脂酸甘油酯合成方法

按計算的量稱取甘油和氫化油于250 ml的三口燒瓶中，緩慢升溫，待物料溶解完全后開啟攪拌，攪拌速度為200 r/min，當(dāng)溫度穩(wěn)定在設(shè)計值時，加入一定量的脂肪酶，保溫反應(yīng)。保溫反應(yīng)達(dá)到4 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h時，取樣，樣品65 ℃恒溫沉降當(dāng)溶液分層完全（2～3 h）分離出上層液為粗酯。測定粗酯中單甘酯含量和甘油含量。

2.2 單硬脂酸甘油酯分析方法

產(chǎn)品的單甘酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)和甘油含量用高碘酸法測定[16]。參考標(biāo)準(zhǔn)為GB 15612-1995 食品添加劑蒸餾單硬脂酸甘油酯。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素影響試驗

3.1.1 脂肪酶種類對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

稱取100 g氫化油和30 g甘油于250 ml的三口燒瓶中，緩慢升溫，待物料溶解完全后開啟攪拌，攪拌速度為200 r/min，當(dāng)溫度穩(wěn)定在65 ℃時，加入脂肪酶3 g，保溫反應(yīng)。保溫反應(yīng)達(dá)到4 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h時，取樣，樣品65℃恒溫沉降，當(dāng)溶液分層完全（2～3 h）分離出上層液為粗酯。測定粗酯中單酯含量和甘油含量。結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，通過沉降，粗酯中游離甘油含量在3.7%～3.9%之間，含量相對穩(wěn)定，說明通過測定粗酯中單酯含量來對比反應(yīng)轉(zhuǎn)化速度、轉(zhuǎn)化率，判斷反應(yīng)條件對氫化油甘油解反應(yīng)的影響是可行的。

從圖3中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行單酯含量逐步提高，其中脂肪酶Lipozyme 435單酯含量上升最快，達(dá)到平衡時產(chǎn)物單甘酯含量最大；Lipozyme RM、Lipozyme NS400168性能相當(dāng)，單酯含量上升速度和平衡時單甘酯含量數(shù)值相近；Lipozyme TL IM單酯含量上升速度最慢，同時達(dá)到平衡時產(chǎn)物單甘酯得率最低。

圖3 粗酯中游離甘油含量和脂肪酶種類對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

結(jié)論：這4種脂肪酶中采用脂肪酶Lipozyme 435為催化劑，粗酯中單甘酯含量最高。

3.1.2 底物摩爾比對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

按氫化油和甘油不同摩爾比投料，反應(yīng)后測定粗酯中單酯含量。結(jié)果見圖4。

圖4 底物摩爾比對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

從圖4中可以看出，隨著底物甘油與氫化油的摩爾比加大，反應(yīng)時單酯含量的增加速度和平衡時單酯的平衡含量都是先增大后減小，增加速度最大的摩爾比為10∶1，平衡含量摩爾比5∶1、8∶1相當(dāng)；通過分析可能原因是甘油在氫化油中溶解度不高，大量過量時溶于氫化油中的甘油量沒有增加，反應(yīng)平衡點沒有發(fā)生偏移，所以生產(chǎn)的單酯含量相當(dāng)；繼續(xù)加大甘油量相當(dāng)于稀釋了脂肪酶的量，所以單酯生成速度開始下降。

結(jié)論：從原料成本和平衡時單酯含量考慮底物甘油與氫化油的摩爾比選擇5∶1最為合適。

3.1.3 脂肪酶添加量對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

按氫化油和甘油摩爾比為1∶5投料，按比例（氫化油質(zhì)量的百分比）加入脂肪酶（Lipozyme 435），反應(yīng)后測定粗酯中單酯含量。結(jié)果見圖5。

圖5 脂肪酶添加量對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

從圖5中可以看出，單甘酯生成速度和最終含量，隨著脂肪酶添加量的加大，先增大后降低。反應(yīng)中隨著脂肪酶添加量的加大反應(yīng)體系黏度不斷增大，當(dāng)添加量為15%時已經(jīng)成半流體狀態(tài)攪拌時，反應(yīng)體系流動緩慢；添加量為20%時已經(jīng)成漿糊狀，攪拌時反應(yīng)體系基本不再流動，所以導(dǎo)致單甘酯生成速度和最終含量。脂肪酶添加量5%和10%最終含量相近，可能原因是脂肪酶添加量5%已經(jīng)能保證反應(yīng)能達(dá)到平衡點，繼續(xù)添加脂肪酶也不會生成更多的單甘酯。

結(jié)論：單甘酯含量隨著脂肪酶添加量的加大，先增大后降低，最佳添加量為5%。

3.1.4 反應(yīng)溫度對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

按不同反應(yīng)溫度控制反應(yīng)，反應(yīng)后測定粗酯中單酯含量。結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)溫度對氫化油甘油解反應(yīng)的影響

實驗采用的原料氫化油熔點為60℃，生成的單硬脂酸甘油酯熔點為68℃，脂肪酶（Lipozyme 435）最佳催化活性的溫度為60～70℃，所以選取對比的反應(yīng)溫度為60～75℃。低于60℃原料氫化油不熔化反應(yīng)體系為固-液兩相反應(yīng)，對反應(yīng)攪拌會產(chǎn)生很大的阻力，也不利于反應(yīng)進(jìn)行。

從圖6中可以看出，單甘酯4 h時的單甘酯含量隨著反應(yīng)溫度的升高先變大后減小，說明升高溫度可以提高反應(yīng)的初始反應(yīng)速度，但超過酶適合溫度，反應(yīng)速度開始降低；同時從圖6中可以看出單甘酯的最終平衡含量隨反應(yīng)溫度的升高而降低。通過對比發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度65℃時，粗酯中單酯含量最高。

結(jié)論：脂肪酶（Lipozyme 435）催化合成單甘酯，最佳反應(yīng)溫度為65℃。

3.2 正交考察

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，建立以底物摩爾比、脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時長為考察因素，單甘酯含量為考察指標(biāo)的四因素、三水平正交實驗表，見表1,并對正交實驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交實驗直觀分析表

由表2中正交實驗直觀分析表中極差Rj可以看出，影響因素的從主到次的順序為C、D、A、B。表明受反應(yīng)影響最大的因素為C反應(yīng)溫度，次要影響因素為D反應(yīng)時間，接著是A底物摩爾比，B脂肪酶量對反應(yīng)影響最小。最優(yōu)組合為A3B2C2D3,即投料時氫化油和甘油底物摩爾比為1∶6，脂肪酶添加量為5%，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時長為32 h。

由圖7效應(yīng)曲線圖可以看出單酯含量隨底物摩爾比、反應(yīng)時長的增大而增大，其中底物摩爾比開始增大明顯，后期效果減弱。同時單酯含量隨脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度先增大后減小。結(jié)果與單因素實驗結(jié)論相符合。

圖7 效應(yīng)曲線圖

3.3 實驗的重復(fù)性試驗

試驗選擇了最佳合成方案，即底物甘油與氫化油的摩爾比選擇5∶1，脂肪酶選擇Lipozyme 435，添加量為5%，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時長選擇為32 h；實驗結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性實驗數(shù)據(jù)表

從6次試驗的結(jié)果看，算術(shù)平均值為43.27，偏差最大的為實驗2，42.66，偏差值為0.61，偏差百分比為1.41%，重復(fù)性達(dá)98.59%。實驗重復(fù)性高。

4 結(jié)論

以脂肪酶催化氫化油和甘油合成單硬脂酸甘油酯反應(yīng)，單甘酯含量隨底物摩爾比增大先增大后減小，反應(yīng)時低溫能使平衡時單酯含量加大，但低溫時反應(yīng)速度慢，提高溫度、增加脂肪酶能使反應(yīng)速度加快。過量的脂肪酶又會使反應(yīng)體系黏度加大阻礙反應(yīng)進(jìn)行。