NMR技術應用于手性識別實驗教學的設計

田小艷， 羅 琳， 蔣京辰， 李梅珊

（1.廣西師范大學化學與藥學學院，省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室/廣西民族藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西桂林541004；2.欽州市生態(tài)環(huán)境局欽州市固體廢物管理中心，廣西欽州535000）

0 引 言

在化學相關專業(yè)中最為重要的一個教學部分就是實驗教學，但是目前的化學實驗教學方式已經不能滿足當代社會對創(chuàng)新型人才的需求。因此，需要強化創(chuàng)新型教學實驗設計的力度，培養(yǎng)學生獨立設計并完成創(chuàng)造性實驗，提高學生自主創(chuàng)新能力，為將來的科研和生產實踐奠定基礎［1-3］?；谔嵘龑W生創(chuàng)新實踐能力這一培養(yǎng)目標，充分利用本?，F(xiàn)有教學儀器資源，將羧酸類手性溶劑化試劑（Chiral Solvating Agents，CSAs）的制備及其通過核磁共振（NMR）法對R/S-萘乙胺進行手性識別等研究內容設計成創(chuàng)新性綜合實驗，教授學生相關理論知識、實驗技巧及如何運用理論知識解決實際問題，培養(yǎng)學生實驗設計和創(chuàng)新思維能力，也使學生充分了解本學科當前研究現(xiàn)狀和從事化學行業(yè)所需具備的專業(yè)技能，能夠調動他們對本專業(yè)知識學習的興趣。

目前，臨床上使用的藥物約有1/3是手性藥物。但是，由于手性化合物的絕對立體結構在決定它們的特殊重要化學、物理、生物、藥學的性質上起了最關鍵作用，所以這些化合物中往往只有其中一種構型的光學異構體具有藥理活性，而另一種光學異構體則可能不具有任何藥理活性甚至會對人體有毒副作用。因此手性化合物的識別在新藥研發(fā)和活性藥物篩選中至關重要。近年來，手性化合物的分析方法常用的有高效液相色譜法和NMR法等，其中NMR法具有快速、方便、樣品用量少且可回收等優(yōu)點而備受關注［4-5］。而手性溶劑化試劑分析法是NMR技術研究手性化合物的主要方法之一。手性溶劑化試劑主要是能與兩個對映異構體通過非共價鍵、范德華力和氫鍵等形成非對映絡合物，從而使對映體的NMR信號的化學位移有所偏差以達到手性識別的目的［6-8］。目前已有許多優(yōu)秀的手性識別試劑被發(fā)現(xiàn)或合成，但是目前商品化的手性溶劑化試劑的價格都非常昂貴，如常用的（S）-MPA和18-C-6-TCA25試劑僅25 mg就需要上百美元。因此，這些價格昂貴的識別試劑顯然不適合用于常規(guī)本科實驗教學。經了解發(fā)現(xiàn)松香［9］是一種重要的且廉價易得的可再生資源，而酒石酸［10］是一種常見于酒類和其他葡萄類產物中的物質，都極易大量獲取且價格便宜，較適合用于大規(guī)模的本科實驗教學。

1 實驗設計思路

酒石酸和從松香中提取得到含有3個手性碳原子的脫氫松香酸由于結構中都含有可以與胺類發(fā)生良好反應的羧基基團，可作為識別胺類的手性溶劑化試劑。但是酒石酸的識別效果并不明顯，因此需要在酒石酸結構上增加苯環(huán)結構以增大手性識別試劑的磁各向異

性，使手性化合物的NMR信號裂分效果更加明顯?；谝陨峡紤]，本實驗首先從松香中提取純凈的脫氫松香酸、通過有機合成方法對酒石酸進行結構改造制備L-二苯甲酰酒石酸，然后以這兩種羧酸作為手性溶劑化試劑，對R/S-萘乙胺通過1H NMR譜圖進行手性識別研究。理論上，該主體與客體有兩種結合方式：一種是主體的羧基通過氫鍵與客體的氨基結合；另一種是由于主體和客體都有苯環(huán)存在，因此可以通過π-π堆積和磁各向異性作用形成穩(wěn)定的絡合物結構。當主客體體系中主體與客體形成穩(wěn)定的絡合物后，此時R/S-萘乙胺被施加一個不對稱的環(huán)境，使其處于非對映異構關系下產生化學位移不等價，進而使得R/S-萘乙胺1H NMR譜圖上的次甲基和甲基基團的氫信號出現(xiàn)裂分，通過分析這些信號的變化情況及R-萘乙胺手性質子的化學位移δR和S-萘乙胺手性質子的化學位移δS之間的差異，計算化學位移差值ΔΔδ（ΔΔδ=

2 實驗材料和儀器

2.1 儀器

BRUKER AVANCE 500 MH超導核磁共振儀（瑞士，布魯克公司）；WRSI-1A數(shù)字熔點儀（上海精密科學儀器公司）；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)多用真空泵；ID-300.ID-300.3多功能電子天平；RE-5.2AA旋轉蒸發(fā)器；D-8401型多功能攪拌器。

2.2 試劑

歧化松香、95%乙醇、乙醇胺、石油醚、稀鹽酸、酒石酸、苯甲酰氯、苯，上述藥品除歧化松香、95%乙醇為工業(yè)等級以外，其余全為分析純。

2.3 實驗對象

以脫氫松香酸和L-二苯甲酰酒石酸兩種手性羧酸作為主體，即為NMR手性溶劑化試劑，分別對客體R/S-仲丁胺萘乙胺進行手性識別，其化學結構式分別為：

3 實驗內容

3.1 主體化合物的制備

（1）脫氫松香酸的純化［11］。將200 g工業(yè)歧化松香加入2 000 mL燒瓶中，加入500 mL 95%乙醇并加熱溶解工業(yè)歧化松香后趁熱抽濾。濾液趁熱加入40 g乙醇胺和500 mL熱水，用100 mL石油醚萃取5次，胺層冷卻后結晶，過濾，沉淀用50%乙醇重結晶得純凈脫氫松香酸鹽，將脫氫松香酸鹽溶解于700 mL 50%熱乙醇中，用稀鹽酸調節(jié)pH=4，冷卻，過濾，并用水洗滌沉淀，真空干燥，得白色晶體即為脫氫松香酸45 g，使用WRSI-1A數(shù)字熔點儀測其熔點為170.1～171.5℃，其反應式為：

（2）L-二苯甲酰酒石酸的合成［12］。向100 mL燒瓶中加入1 g酒石酸和3 g（4 mL）的苯甲酰氯，并置于油浴鍋中，調節(jié)油浴使溫度升至140～150℃，回流并攪拌3 h后，停止加熱，加入3 mL苯于燒瓶中，繼續(xù)回流反應5 min，待反應體系冷卻到室溫后進行減壓抽濾，用苯洗滌濾餅兩次，抽濾并干燥，得白色針狀固體即為L-二苯甲酰酒石酸2.1 g，使用WRSI-1A數(shù)字熔點儀測其熔點為194.7～196.0℃，其反應式為：

3.2 手性識別作用的1H NMR測定

以主體脫氫松香酸和L-二苯甲酰酒石酸為NMR手性溶劑化試劑，采用1H NMR測定法對客體R/S-萘乙胺分別進行手性識別研究。測定方法是固定客體濃度不變，依次加入主體的量進行測定（采取連續(xù)加樣連續(xù)測量的方式）。實驗具體步驟如下：

（1）20℃下，在核磁管中加入R/S-萘乙胺（0.05 mol），加入0.5 mL CDCl3作為溶劑，逐漸加入一定量的脫氫松香酸，每加入一次便進行1H NMR測定，得到一系列脫氫松香酸-R/S-主客體體系的1H NMR譜圖。

（2）20℃下，在核磁管中加入R/S-萘乙胺（0.05 mol），加入0.5 mL CDCl3作為溶劑，逐漸加入一定量的L-二苯甲酰酒石酸，每加入一次便進行1H NMR測定，得到一系列L-二苯甲酰酒石酸-R/S-萘乙胺主客體體系的1H NMR譜圖。

4 結果與分析

4.1 譜圖分析

從圖1所示可見，在脫氫松香酸對R/S-萘乙胺手性識別實驗中，客體R/S-萘乙胺分子中手性質子（CH）的信號隨著主體脫氫松香酸的增加逐漸向低場方向位移，并由原來的四重峰逐漸裂分成六重峰。在主體濃度∶客體濃度=0.7∶1時手性質子就已經開始裂分，但是隨后由于受到水峰的干擾導致裂分效果不明顯；當主體濃度∶客體濃度達到1∶1之后，就趨于穩(wěn)定，且主體濃度∶客體濃度=1∶1時，脫氫松香酸對手性質子的識別效果最好，ΔΔδ達到最大值，為3.35 Hz。R/S-萘乙胺分子中CH3的信號隨著主體脫氫松香酸的增加也逐漸向低場方向移動（見圖2），但主體對其識別效果并不明顯；當主體濃度∶客體濃度=0.7∶1時，CH3的二重峰開始有細小裂分為四重峰現(xiàn)象，此時ΔΔδ為1.2 Hz，但是隨后四重峰就開始回縮?？梢?，脫氫松香酸對R/S-萘乙胺有一定的識別效果，對手性質子（CH）識別效果優(yōu)于CH3的識別效果。

圖1 不同濃度脫氫松香酸對R/S-萘乙胺的1H-NMR識別局部（CH）放大圖譜

圖2 不同濃度脫氫松香酸對R/S-萘乙胺的1H-NMR識別局部（CH3）放大圖譜

在L-二苯甲酰酒石酸對R/S-萘乙胺手性識別實驗中，在主體L-二苯甲酰酒石酸加入后客體R/S-萘乙胺手性質子（CH）信號向高場方向位移，但隨著主體含量的增加信號開始逐漸向低場方向位移（見圖3）。當主體濃度∶客體濃度=0.4∶1時，主體對客體才具有明顯識別效果，客體的手性質子信號由原來的四重峰開始裂分為五重峰；當主體濃度∶客體濃度=0.6∶1時，主體對手性質子識別效果最強，ΔΔδ達到最大值，為7.25 Hz；當主體濃度繼續(xù)增加，手性質子的五重峰就開始回縮。此外，主體濃度∶客體濃度從0.4∶1向1.2∶1變化時，CH裂分峰向低場移動不是很明顯。在R/S-萘乙胺的CH3位置，L-二苯甲酰酒石酸也具有明顯的識別效果（見圖4），主體加入后，客體的CH3信號向高場方向位移。在主體濃度∶客體濃度=0.4∶1時，CH3的質子信號由雙重峰已明顯裂分為四重峰；當主體濃度∶客體濃度=0.8∶1時，ΔΔδ達到最大值，為7.6 Hz，此時CH3的質子信號為三重峰。

圖3 不同濃度L-二苯甲酰酒石酸對R/S-萘乙胺的1H-NMR識別局部（CH）放大圖譜

圖4 不同濃度L-二苯甲酰酒石酸對R/S-萘乙胺的1H-NMR識別局部（CH3）放大圖譜

4.2 曲線分析

將一系列主客體體系的主體摩爾分數(shù)與客體化學位移差值ΔΔδ繪制成曲線。由圖5可見，隨著脫氫松香酸摩爾分數(shù)的增加，R/S-萘乙胺的次甲基質子的ΔΔδ逐漸增加；當脫氫松香酸的摩爾分數(shù)為0.50時，ΔΔδ出現(xiàn)峰值，說明此時脫氫松香酸與R/S-萘乙胺形成的絡合物最穩(wěn)定，主體對客體的識別效果最顯著。同樣地，在L-二苯甲酰酒石酸對R/S-萘乙胺手性識別實驗中，R/S-萘乙胺的甲基質子信號的ΔΔδ值隨著L-二苯甲酰酒石酸摩爾分數(shù)的增加而逐漸增加（見圖6），當L-二苯甲酰酒石酸摩爾分數(shù)為0.44時，ΔΔδ出現(xiàn)峰值。

圖5 R/S-萘乙胺次甲基質子化學位移差值ΔΔδ與脫氫松香酸濃度的變化曲線

圖6 R/S-萘乙胺次甲基質子化學位移差值ΔΔδ與L-二苯甲酰酒石酸濃度的變化曲線

5 結 語

本實驗設計從價格便宜且易得的松香和酒石酸原料中通過一些簡單的有機方法制備NMR手性溶劑化試劑脫氫松香酸和L-二苯甲酰酒石酸，并采用NMR技術研究不同濃度下兩種手性溶劑化試劑對R/S-萘乙胺進行手性識別效果，分析討論兩種羧酸的最優(yōu)識別效果最佳濃度比值。實驗過程中涉及到化合物提純、有機合成和結構表征儀器核磁共振儀的使用等，涵蓋多方面的專業(yè)理論知識和實驗操作方法實驗，具有簡易性、綜合性和創(chuàng)新性的特點，可以培養(yǎng)學生的綜合實踐技能和理論知識運用分析能力。此外，還可以加強大型精密測試儀器的開放和提高大型儀器在本科實驗教學中的使用效益［13-15］。