不同頂空進(jìn)樣技術(shù)結(jié)合多同位素內(nèi)標(biāo)法對(duì)香氣物質(zhì)定量分析的選擇性差異

馬麗鑫，鄭 旭，黃旭輝，孫浩媛，徐獻(xiàn)兵，董秀萍，秦 磊

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

香氣是評(píng)價(jià)食品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[1]。食品香氣的形成建立在復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)之上[2]，如何獲取準(zhǔn)確的食品香氣信息一直是研究熱點(diǎn)。目前，食品香氣物質(zhì)的定量萃取方式主要分為溶劑萃取和頂空萃取。其中，溶劑萃取方式主要有液液微萃[3]、同時(shí)蒸餾萃取[4]、溶劑輔助蒸餾萃取[5]等。雖然溶劑萃取能夠獲得更多的揮發(fā)性化合物，但是易產(chǎn)生溶劑效應(yīng)引入新的雜質(zhì)。同時(shí)，溶劑萃取通常需要對(duì)食品結(jié)構(gòu)破壞，而這些物理化學(xué)破壞同樣會(huì)導(dǎo)致香氣分析與食品原有狀態(tài)的香氣發(fā)生偏差[6]。頂空萃取方式雖然局限于萃取頭或者收集方式的能力導(dǎo)致獲得的香氣物質(zhì)信息相對(duì)液體萃取方式較少，但其萃取過(guò)程中無(wú)需對(duì)食品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，更好地體現(xiàn)了食品正常狀態(tài)下散發(fā)出的香氣信息。頂空進(jìn)樣技術(shù)在不同產(chǎn)地紅茶香氣品質(zhì)對(duì)比[7]、不同品種芒果香氣差異比較[8]以及食用菌體不同部位揮發(fā)性成分分析[9]等方面均有應(yīng)用。因此，分析不同頂空萃取方式的差異，綜合不同頂空進(jìn)樣方式對(duì)香氣物質(zhì)定性定量的能力，對(duì)食品中香氣物質(zhì)的分析具有重要意義。

頂空進(jìn)樣方式主要分為靜態(tài)頂空萃取和動(dòng)態(tài)頂空萃取。靜態(tài)頂空是分析半揮發(fā)性和揮發(fā)性樣品常見(jiàn)的一種進(jìn)樣方式，是將樣品置于密閉容器中，經(jīng)過(guò)一定溫度和時(shí)間后達(dá)到氣液平衡，取氣相部分進(jìn)樣，又稱一次氣相進(jìn)樣，主要包括直接靜態(tài)頂空進(jìn)樣和頂空固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）。動(dòng)態(tài)頂空為經(jīng)過(guò)連續(xù)氣相萃取或多次萃取將樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)全部萃取出來(lái)，通過(guò)吸附裝置濃縮樣品后進(jìn)樣解吸，主要包括吹掃捕集（purge and trap，P&T）和微阱捕集（in-tube extraction，ITEX）。

靜態(tài)頂空采樣主要受容器溫度和平衡時(shí)間等因素的影響，樣品制備簡(jiǎn)便，采集組分無(wú)干擾，但由于不同的香氣組分揮發(fā)性不同，其存在于容器頂空中的含量會(huì)不同，且該方法必須進(jìn)行大體積的氣體進(jìn)樣，會(huì)影響色譜的分離效果，僅適合高度揮發(fā)性或高含量組分的檢測(cè)。程凡等[10]用靜態(tài)頂空的方法測(cè)定酒醅中乙醇含量，蘆麗等[11]測(cè)定保健酒中的高級(jí)醇類和酯類，發(fā)現(xiàn)靜態(tài)頂空進(jìn)樣適用于醇類及酯類等。SPME方法克服了傳統(tǒng)萃取技術(shù)進(jìn)樣量大的缺點(diǎn)，集采樣、萃取、進(jìn)樣、濃縮于一體，大大加快了分析檢測(cè)的效率，但卻過(guò)于依賴吸附涂層，不同萃取涂層所能萃取的物質(zhì)不同，且效果差異較大[12]。

動(dòng)態(tài)頂空是提取揮發(fā)性香氣物質(zhì)常用的方法之一，具有方法簡(jiǎn)便、快捷、無(wú)需溶劑的特點(diǎn)，而且提取的香氣成分逼真，最接近人體嗅覺(jué)所能感覺(jué)到的氣味。P&T有富集效率高、受基體干擾小、容易實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但是此系統(tǒng)在提取低揮發(fā)性組分時(shí)效率較低[13]。利用P&T方法對(duì)香瓜和西瓜中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共檢測(cè)到61種揮發(fā)性物質(zhì)[14]。ITEX系統(tǒng)樣品量較少，且不易受污染、操作簡(jiǎn)單、靈活，是一種用于自動(dòng)進(jìn)樣器的全自動(dòng)微萃取技術(shù)[15]。采用ITEX-氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)研究了啤酒麥汁主發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成，由此通過(guò)高級(jí)醇、酯類、有機(jī)酸和醛類建立了不同產(chǎn)品等級(jí)的劃分方法[16]。然而，由于不同頂空萃取方法的特點(diǎn)及萃取效率不同，通過(guò)單一頂空萃取方式獲得的食品香氣信息并不全面。從珊等[17]比較了不同富集方法對(duì)植物油風(fēng)味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)單一的富集方法對(duì)風(fēng)味物質(zhì)提取不全。目前單一的萃取技術(shù)均存在一定局限性，對(duì)比不同頂空萃取方式的差異，將不同頂空萃取方式進(jìn)行融合，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可以更加完整地獲取食品中的香氣物質(zhì)信息。

本研究擬以不同基質(zhì)體系下57種極性、沸點(diǎn)、保留指數(shù)（retention index，RI）跨度大的食品中常見(jiàn)的不同類型香氣物質(zhì)作為研究對(duì)象，對(duì)比頂空SPME、ITEX、P&T、靜態(tài)頂空4種頂空進(jìn)樣方式的萃取效率和能力，為GC-MS檢測(cè)食品中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的方法開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2-甲基-1-丁醇（純度98%）、二甲基二硫醚（純度98%）、丁酸乙酯（純度99.5%）、正丁酸（純度99.5%）、乙酸丁酯（純度99.7%）、糠醛（純度99.5%）、2-甲基丁酸（純度98%）、異戊酸（純度99.5%）、正己醇（純度99.5%）、苯乙烯（純度98%）、3-(甲硫基)丙醛（純度98%）、γ-丁內(nèi)酯（純度98%）、2,5-二甲基吡嗪（純度98%）、己酸甲酯（純度99.5%）、苯甲醛（純度99.5%）、二甲基三硫（純度98%）、3-巰基-3-甲基-1-丁醇（純度98%）、苯酚（純度99.5%）、苯甲腈（純度99.5%）、甲基庚烯酮（純度98%）、月桂烯（純度90%）、己酸乙酯（純度99%）、雙戊烯（純度95%）、苯甲醇（純度99.9%）、苯乙醛（純度95%）、2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮（純度97%）、(E)-2-辛烯醛（純度95%）、苯乙酮（純度98%）、正辛醇（純度99.5%）、正庚酸（純度98%）、苯甲酸甲酯（純度98%）、壬醛（純度96%）、2-苯乙醇（純度99.5%）、1,2,4,5-四甲苯（純度99.8%）、乙酸糠硫醇酯（純度99%）、乙酸芐酯（純度99.7%）、L-薄荷醇（純度99.5%）、4’-甲基苯乙酮（純度98%）、苯甲醛二甲基縮醛（純度98%）、L-香芹醇（純度97%）、香茅醇（純度99%）、苯并噻唑（純度96%）、香葉醇（純度99%）、檸檬醛（純度97%）、麝香草酚（純度99.9%）、鄰氨基苯甲酸甲酯（純度99%）、椰子醛（純度98%）、香草醛（純度99%）、1,3-二甲基萘（純度95%）、異丁香酚（純度97%）、4-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯基)-3-丁烯-2-酮（純度97%）、香草酸甲酯（純度99%）、月桂酸（純度99.5%）、十七烷（純度99.5%）、十八烷（純度99.5%）、(＋)-諾卡酮（純度97%）、十八醇（純度99.5%）標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技有限公司；氘代壬烷（DLM-2438-1，純度98%）、氘代十二烷（DLM-338-1，純度98%）、氘代十三烷（DLM-1354-0.1，純度98%）、氘代十六烷（DLM-203-0.1，純度98%）、氘代十九烷（DLM-1346-0.1，純度98%） 美國(guó)CIL公司；乙酸乙酯（色譜級(jí)）美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B/7010B GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Atomx全自動(dòng)吹掃捕集濃縮儀 美國(guó)Tekmar公司；三位一體自動(dòng)進(jìn)樣器（SPME、靜態(tài)頂空、ITEX） 瑞士CTC Analytics公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、PDMS/DVB萃取頭、聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）萃取頭、CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 香氣物質(zhì)的提取

1.3.1.1 頂空SPME

取不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)溶液990 μL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，并加入氘代烷烴（氘代壬烷、氘代十二烷、氘代十三烷、氘代十六烷、氘代十九烷）混標(biāo)（100 μg/mL，10 μL）。其中標(biāo)準(zhǔn)品由水或自制食品基質(zhì)溶液稀釋而成。樣品萃取前50 ℃預(yù)熱40 min。選用不同SPME進(jìn)樣針對(duì)樣品進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為30 min。萃取后的進(jìn)樣針于進(jìn)樣口260 ℃解吸附5 min進(jìn)樣。SPME萃取頭分別為50/30 μm PDMS/DVB、PA、DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS。

1.3.1.2 ITEX

取不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)溶液990 μL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，并加入氘代烷烴混標(biāo)（100 μg/mL，10 μL）。其中標(biāo)準(zhǔn)品由水或自制食品基質(zhì)溶液稀釋而成。樣品萃取前50 ℃預(yù)熱40 min。選用ITEX（Tenax TA 80/100）對(duì)樣品進(jìn)行萃取，萃取針往返抽吸進(jìn)樣瓶頂空氣體30 次，每次樣品體積1 mL，萃取體積0.5 mL，抽吸流速0.5 mL/s。萃取后的樣品于200 ℃進(jìn)樣，進(jìn)樣速率為0.1 mL/s。

1.3.1.3 P&T

使用聚四氟乙烯襯墊螺旋蓋的40 mL吹掃瓶，取不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)溶液19.95 mL于P&T進(jìn)樣瓶中，并加入氘代烷烴混標(biāo)（100 μg/mL，10 μL）。其中標(biāo)準(zhǔn)品由水或自制食品基質(zhì)溶液稀釋而成。P&T萃取（Trap #9捕集阱）過(guò)程中采用液體萃取模式，樣品進(jìn)樣量為4 mL。吹掃時(shí)間40 min，吹掃溫度40 ℃，吹掃流量10 mL/min。解吸溫度250 ℃，解吸時(shí)間2 min。

1.3.1.4 靜態(tài)頂空

取不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)溶液990 μL于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，并加入氘代烷烴混標(biāo)（100 μg/mL，10 μL）。其中標(biāo)準(zhǔn)品由水或自制食品基質(zhì)溶液稀釋而成。樣品置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，50 ℃孵育40 min。樣品體積為1 mL，進(jìn)樣速率為0.5 mL/s。

1.3.2 香氣物質(zhì)的定量分析

1.3.2.1 GC-MS檢測(cè)

采用毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）進(jìn)行分離。進(jìn)樣口溫度為260 ℃，采用不分流模式。載氣為氦氣，載氣流速為l mL/min。柱溫箱初始溫度為45 ℃，維持3 min，以5 ℃/min升溫至280 ℃，并維持10 min。電子電離源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV。Scan掃描模式下，質(zhì)量掃描范圍m/z40～400。

1.3.2.2 定量方法

采用多同位素內(nèi)標(biāo)校正結(jié)合外標(biāo)法對(duì)不同化合物的含量進(jìn)行定量分析。其中，同位素內(nèi)標(biāo)選用較為穩(wěn)定的氘代烷烴（氘代壬烷、氘代十二烷、氘代十三烷、氘代十六烷、氘代十九烷）。定量方法采用單離子檢測(cè)掃描模式，選擇特征離子以及特征定量離子進(jìn)行分析。取蝦夷扇貝的閉殼肌與0.9%的生理鹽水按1∶2（g/mL）進(jìn)行混合制得簡(jiǎn)易的食品基質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用MassHunter系列分析軟件對(duì)采集的結(jié)果進(jìn)行分析。利用Office 2016、Origin 2020、TBTools[18]、SPSS 22、SIMCA 14.1、Metaboanalyst 4[19]、XLSTAT等對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣物質(zhì)的選擇

物質(zhì)的揮發(fā)性與分子之間的相互作用力以及自身的分子質(zhì)量大小等性質(zhì)相關(guān)。食品基質(zhì)中的香氣物質(zhì)主要可分為醛類、酮類、醇類、酯類、醚類、芳香族類以及碳?xì)浠衔?。不同類型的化合物性質(zhì)差異較大。對(duì)于大部分食品的香氣，成分涵蓋廣而復(fù)雜，從而導(dǎo)致了香氣物質(zhì)難以萃取完全，定性定量誤差較大等。因此，本研究選取57種來(lái)源于不同食品的揮發(fā)性物質(zhì)，進(jìn)行不同萃取方式定性定量分析差異的比較。特征香氣化合物種類包含烴類、酯類、醛類、醇類、酮類、酸類等主要類型化合物。其保留指數(shù)（retention index，RI）分布在700～2 000之間，涵蓋較廣，能夠一定程度上反映出食品中不同類型的特征香氣化合物色譜分離情況。同時(shí)，所選化合物的lgP值也均勻分布，分布范圍在－0.6～9.3之間，能夠體現(xiàn)出不同極性化合物的定量情況，從而進(jìn)一步分析不同萃取方法萃取效率間的差異。對(duì)所選取的化合物進(jìn)行色譜分離與質(zhì)譜檢測(cè)，各香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品性質(zhì)如表1所示。

表1 不同揮發(fā)性香氣物質(zhì)的性質(zhì)Table 1 Properties of 57 volatile aroma compounds tested in this study

續(xù)表1

2.2 不同頂空進(jìn)樣方法的差異分析

以GC-MS信號(hào)峰信噪比大于3作為可定性的衡量指標(biāo)，通過(guò)對(duì)比相同濃度下不同頂空萃取方式，對(duì)重組香氣物質(zhì)混合樣品萃取后質(zhì)譜檢測(cè)所能鑒別出的化合物數(shù)量及相對(duì)強(qiáng)度判斷其萃取能力。為了進(jìn)一步分析不同萃取方式萃取能力及與萃取物質(zhì)之間的相關(guān)性，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如圖1所示。有20種揮發(fā)性風(fēng)味化合物是所有方法均可測(cè)得的，不同萃取方法富集到的揮發(fā)性風(fēng)味化合物存在明顯差異，這是由于富集材料的差異導(dǎo)致對(duì)不同分子質(zhì)量、極性的揮發(fā)性化合物的吸附能力不同。雖然所選的4種不同類型SPME萃取頭的萃取能力在本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有明顯差異，但由圖1B可以一定程度上判斷出PDMS/DVB萃取頭萃取效果最好，其在57種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中可萃取到45種化合物，對(duì)醇類、酯類物質(zhì)富集效果較好。ITEX動(dòng)態(tài)頂空受溶劑影響較小，對(duì)RI較低的揮發(fā)性化合物的萃取能力較好，對(duì)芳香類化合物富集效果較理想。P&T對(duì)中高沸點(diǎn)的揮發(fā)性化合物富集效果較差，保留時(shí)間在16 min后的化合物只富集到1,3-二甲基萘和乙位紫羅蘭酮。除此之外，靜態(tài)頂空和P&T均不適合酸類物質(zhì)的萃取。

圖1 不同萃取方法萃取能力對(duì)比Fig.1 Comparison of extraction efficiencies of different extraction methods

結(jié)合圖1A與表2可知，P&T有11種風(fēng)味化合物無(wú)法萃取獲得，分別為4’-甲基苯乙酮、L-香芹醇、香茅醇、苯并噻唑、香葉醇、檸檬醛、麝香草酚、鄰氨基苯甲酸甲酯、十七烷、十八烷、(＋)-諾卡酮，大部分屬于高沸點(diǎn)，高RI的化合物。靜態(tài)頂空SPME和動(dòng)態(tài)頂空ITEX之間的萃取能力差異性相對(duì)較小，而與動(dòng)態(tài)頂空P&T之間差異性較大，2種頂空方式之間也差異顯著，產(chǎn)生這種差異性可能與萃取材料的不同有關(guān)，可見(jiàn)相比較萃取形式，萃取頭的涂層材料對(duì)揮發(fā)性化合物的萃取能力影響更大。ITEX檢出的化合物中有2種SPME無(wú)法萃取得到，分別為二甲基二硫醚和2,5-二甲基吡嗪；而僅SPME方法能檢出ITEX無(wú)法檢出的化合物，分別為乙酸丁酯、異戊酸、正己醇、苯甲醇、2-苯乙醇等。說(shuō)明在香氣物質(zhì)分析時(shí)，可以將SPME與ITEX結(jié)合使用，從而獲得更全面的香氣化合物信息[22]。

對(duì)比溶劑萃取和頂空萃取之間的揮發(fā)性化合物差異，可以發(fā)現(xiàn)10種化合物在所有頂空萃取方法中均無(wú)法檢出（2-甲基-1-丁醇、二甲基二硫醚、正丁酸、2-甲基丁酸、γ-丁內(nèi)酯、3-巰基-3-甲基-1-丁醇、苯酚、2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2H)-呋喃酮、苯甲醛二甲基縮醛、十八醇）。說(shuō)明這些揮發(fā)性化合物在進(jìn)行指紋圖譜分析時(shí)，需結(jié)合其他頂空或溶劑萃取方式進(jìn)行檢測(cè)。有文獻(xiàn)報(bào)道[23]，液液萃取和固相微萃取分離得到香氣物質(zhì)的種類和相對(duì)含量有一定的差異，對(duì)某些特征風(fēng)味成分的分離效果也存在差異，液液萃取能較好提取出酸類，SPME能較好地提取出酯類和醇類。樊艷[24]采用SPME方法對(duì)不同腐乳中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取，利用GC-MS的方法對(duì)其中的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性分析，共鑒定出74種風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類和酯類為主要的風(fēng)味物質(zhì)，表明SPME對(duì)酯類、醇類更為敏感，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

2.3 頂空進(jìn)樣方法對(duì)香氣物質(zhì)定量的影響

所選同位素內(nèi)標(biāo)涵蓋了不同分子質(zhì)量和RI的烷烴，對(duì)比不同萃取方式對(duì)不同同位素內(nèi)標(biāo)的萃取效果可以發(fā)現(xiàn)，SPME萃取頭PDMS/DVB更適合萃取中高RI的物質(zhì)，而靜態(tài)頂空則適合中低RI的物質(zhì)。從圖1B可以看出，不同萃取方法下同位素內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值有明顯的差別。SPME萃取頭DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS與ITEX方法均對(duì)中等RI的化合物萃取效果較好。SPME萃取頭PA對(duì)氘代十六烷的萃取峰值明顯高于其他4種氘代烷烴，萃取效果較好，而對(duì)于氘代壬烷的萃取較差，ITEX方法中氘代壬烷的峰值高于其他幾種萃取方法。由于PA涂層的極性性質(zhì)差異，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該類型SPME萃取頭更適合萃取中高質(zhì)量數(shù)的極性半揮發(fā)性化合物，而ITEX相較于該類型SPME方法更適合萃取中低質(zhì)量數(shù)化合物。因此，在萃取過(guò)程中針對(duì)不同萃取方式的特性進(jìn)行結(jié)合，能夠有效互補(bǔ)各萃取方式的不足，從而獲得更全面的揮發(fā)性化合物信息。

SPME-PDMS/DVB、SPME-PA、靜態(tài)頂空和P&T對(duì)氘代壬烷萃取效果較差，因此氘代壬烷不適合作為SPME-PDMS/DVB、SPME-PA、靜態(tài)頂空和P&T萃取物低保留時(shí)間區(qū)域的定量?jī)?nèi)標(biāo)。在對(duì)比的幾種萃取方式中，SPME-PDMS/DVB萃取頭對(duì)于氘代十二烷、氘代十三烷、氘代十六烷、氘代十九烷內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值最高。對(duì)于氘代壬烷，ITEX的萃取效果最好。根據(jù)圖1B中P&T方法得到的5種氘代烷烴峰高顯著低于其他萃取方式，其余萃取方法均能富集到全部5種同位素內(nèi)標(biāo)，結(jié)合表2可以看出P&T萃取RI較大的化合物存在不足。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[25]，多種同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)用于通過(guò)補(bǔ)償可能影響頂空平衡和化合物可提取性的基質(zhì)效應(yīng)改善分析物的定量，基于SPME-GC-MS的優(yōu)化同位素稀釋分析方法可以快速鑒定和量化液體煙中的揮發(fā)性化合物。Antignac等[26]研究表明用一般的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為32.6%，選用同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%。通過(guò)多同位素內(nèi)標(biāo)，可以一定程度補(bǔ)償可能影響頂空平衡和化合物可提取性的基質(zhì)效應(yīng)改善分析物的定量[27]。

對(duì)不同頂空萃取方法富集得到的香氣化合物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，通過(guò)梯度稀釋法得到不同頂空萃取方法下不同化合物的檢出限和定量限，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯鯯PME萃取頭PDMS/DVB、DVB/CAR/PDMS以及ITEX富集痕量揮發(fā)性風(fēng)味化合物效果較為理想，SPME對(duì)于醇類、酯類化合物更敏感（定量限均為20 ng/mL）。PDMS/DVB和DVB/CAR/PDMS萃取頭對(duì)痕量檢測(cè)醇類、酯類和烴類揮發(fā)性化合物效果較好。而ITEX更適合富集醛類、烴類揮發(fā)性化合物（醛類定量限為20 ng/mL，烴類定量限為10 ng/mL），檢測(cè)到的化合物最低回收率為84.30%，R2大于0.95。而靜態(tài)頂空與P&T痕量檢測(cè)效果相對(duì)較差，檢測(cè)到的醛類烴類數(shù)量少。對(duì)比不同方法的定量限可以發(fā)現(xiàn)SPME-PDMS/DVB對(duì)所選混合香氣樣品中絕大部分香氣化合物的定量限均較低。但是同樣存在部分化合物無(wú)法檢測(cè)到，以及部分化合物定量限相比其他頂空方法較高，例如苯甲醇、二甲基二硫醚、糠醛、2,5-二甲基吡嗪。

表2 不同頂空萃取方法檢出限和定量限對(duì)比Table 2 Comparison of detection and quantitation limits of different headspace sampling methods

從化合物類型看，由于不同化合物與萃取吸附涂層極性之間的差異導(dǎo)致化合物吸附效率不同，其中芳香族化合物和烴類化合物的檢出限較低，而酸類化合物的檢出限相對(duì)較高，與劉盛田等[28]利用靜態(tài)頂空條件和動(dòng)態(tài)頂空分析水中苯系物的結(jié)果一致。靜態(tài)和動(dòng)態(tài)頂空均能較好地分離與檢測(cè)芳香族化合物，這與秦丹等[29]檢測(cè)青稞酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的結(jié)果一致。

2.4 溶液基質(zhì)成分對(duì)香氣物質(zhì)定量的影響

在揮發(fā)性化合物檢測(cè)過(guò)程中，復(fù)雜的食品基質(zhì)會(huì)影響揮發(fā)性物質(zhì)的萃取，基質(zhì)越復(fù)雜，揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng)就越明顯。雖然在檢測(cè)過(guò)程中可以通過(guò)溶劑進(jìn)行萃取，但在實(shí)際樣品揮發(fā)性物質(zhì)分析過(guò)程中，更多的是要獲取食品原有狀態(tài)下的氣味輪廓。因此保持食品原有狀態(tài)進(jìn)行揮發(fā)性化合物信息獲取更符合實(shí)際情況。

從圖2可以看出，整體而言，頂空方法獲得的食品香氣信息受食品基質(zhì)的影響均較小，但不同頂空方法之間也存在差異。SPME進(jìn)樣方式的DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB萃取頭在基質(zhì)影響下萃取到的揮發(fā)性風(fēng)味化合物個(gè)數(shù)變化小，CAR/PDMS、PA萃取頭與靜態(tài)頂空提取到的揮發(fā)性化合物個(gè)數(shù)變化相對(duì)較大，說(shuō)明受基質(zhì)影響較大。食品的復(fù)雜基質(zhì)會(huì)影響食品中特征香氣物質(zhì)的擴(kuò)散，而對(duì)于頂空萃取而言，其主要是收集食品頂空的香氣物質(zhì)，在溫度、壓力等條件的影響下，香氣物質(zhì)會(huì)達(dá)到一定的氣液平衡，因此相對(duì)溶劑萃取而言，其獲得的氣味輪廓信息變化隨食品基質(zhì)變化較小。

圖2 基質(zhì)對(duì)不同頂空萃取方法檢出效果的影響Fig.2 Influence of matrix effect on the extraction efficiencies of different extraction methods

通過(guò)偏最小二乘回歸法對(duì)不同頂空萃取方式特征香氣物質(zhì)定量情況及物質(zhì)本身物理化學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系進(jìn)行綜合分析，進(jìn)一步判斷不同頂空萃取方式的特點(diǎn)及所適合萃取的化合物類型。從圖3可以看出，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)靜態(tài)頂空方式的萃取效率影響較大，而動(dòng)態(tài)頂空萃取方式受到影響相對(duì)較小。這可能是由于靜態(tài)頂空萃取主要是依靠頂空瓶中的香氣物質(zhì)脫離基體會(huì)散到頂空瓶上空達(dá)到氣液平衡。而當(dāng)基體從水轉(zhuǎn)化成富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖等食品基質(zhì)時(shí)，香氣物質(zhì)揮散到頂空時(shí)受到的阻礙作用增加，從而受到影響較大。而當(dāng)使用動(dòng)態(tài)頂空萃取時(shí)，由于整個(gè)萃取過(guò)程存在外在氣體吹掃、抽吸等力的作用，會(huì)減少食品基質(zhì)對(duì)香氣物質(zhì)的阻礙作用。對(duì)比化合物性質(zhì)與不同頂空萃取方式之間的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，P&T、ITEX和靜態(tài)頂空方式的定量能力受化合物lgP、RI和分子質(zhì)量的影響較大。P&T、ITEX和靜態(tài)頂空方式可能對(duì)中高極性的化合物的萃取趨勢(shì)更大。除此之外，可以看出頂空萃取方式更傾向于獲取中等RI揮發(fā)性化合物的定量信息。在實(shí)際檢測(cè)分析時(shí)，可以根據(jù)不同萃取方法特性進(jìn)行結(jié)合，獲得更全面的香氣信息。因此，在有食品基質(zhì)下檢測(cè)揮發(fā)性化合物可以優(yōu)先結(jié)合SPMEPDMS/DVB萃取頭和ITEX萃取方法。

圖3 基質(zhì)下不同萃取方法萃取能力與化合物性質(zhì)關(guān)系偏最小二乘回歸分析Fig.3 Partial least squares regression analysis of the relationship between the extraction efficiencies of different extraction methods and the properties of compounds as influence by matrix effect

3 結(jié) 論

不同萃取方式對(duì)食品中香氣物質(zhì)的富集存在明顯差異。香氣物質(zhì)的頂空萃取方式由于吸附涂層的差別，會(huì)導(dǎo)致香氣物質(zhì)的萃取量、萃取效率、萃取穩(wěn)定性等發(fā)生變化。對(duì)于SPME方式而言，PDMS/DVB萃取頭更適合于水基質(zhì)中特征香氣物質(zhì)的富集；ITEX動(dòng)態(tài)頂空方式結(jié)合了吸附填料、動(dòng)態(tài)吹掃和微管濃縮等優(yōu)勢(shì)，定量限為10 ng/mL，不僅能有效減少食品基質(zhì)的影響，同時(shí)也提高了香氣化合物的萃取效率；P&T和靜態(tài)頂空更適合于低沸點(diǎn)化合物的定量。利用多種同位素內(nèi)標(biāo)在GC-MS檢測(cè)中RI的廣度分布結(jié)合不同頂空萃取方式，并通過(guò)不同保留時(shí)間進(jìn)行合適的定量校正內(nèi)標(biāo)篩選，能夠有效提高食品中特征香氣物質(zhì)的定量結(jié)果精度。通過(guò)對(duì)比不同頂空萃取方式的萃取能力，在優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)下將SPME與ITEX結(jié)合能夠有效提高獲得的食品香氣指紋信息的完整性與準(zhǔn)確性。