八倍體小偃麥與普通小麥雜交后代中小麥染色體相互易位類型的鑒定

李軍帥，黃美瑕，宋 敏，付體華

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130)

小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕Z食作物之一，同時(shí)也是我國(guó)第三大糧食作物，其生產(chǎn)的安全性對(duì)保障中國(guó)糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定具有重要的意義[1]。在長(zhǎng)期的小麥育種中，由于注重骨干或核心高產(chǎn)品種資源之間的雜交，當(dāng)今廣泛種植的小麥栽培品種遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，遺傳多樣性逐漸降低，因此，開發(fā)新的小麥遺傳資源對(duì)解決小麥育種當(dāng)前問題以及對(duì)小麥種質(zhì)資源的創(chuàng)新至關(guān)重要[2-3]。

染色體在生物進(jìn)化進(jìn)程中會(huì)發(fā)生變異，其中易位是其重要變異方式之一。染色體易位可以在物種內(nèi)自然產(chǎn)生，也可以人工誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括利用物理化學(xué)誘導(dǎo)劑、遠(yuǎn)緣雜交等染色體工程技術(shù)。染色體易位不僅使遺傳連鎖群發(fā)生改變，而且影響基因的表達(dá)，生物性狀也隨之變化。染色體易位也是物種進(jìn)化進(jìn)程中新基因組產(chǎn)生的重要驅(qū)動(dòng)力量，新物種的形成往往伴隨著染色體易位的發(fā)生[4-5]。另外染色體易位可使物種在特定環(huán)境中具備更好的適應(yīng)性，如小麥中4A、5A與7B染色體之間的環(huán)狀易位，4AL-5AL易位早在二倍體水平上就已經(jīng)發(fā)生，之后在四倍體小麥中進(jìn)一步與7B染色體發(fā)生易位，形成4AL-5AL-7BS易位，前人根據(jù)該易位，提出了有關(guān)染色體倒位與易位的起源進(jìn)化假說[6-12]。因此，發(fā)現(xiàn)更多染色體水平的易位，不僅可以驗(yàn)證相關(guān)易位理論，還會(huì)豐富小麥的遺傳變異[13-14]。

Huang等[15]對(duì)我國(guó)373個(gè)栽培小麥品種進(jìn)行了熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)分析，發(fā)現(xiàn)49個(gè)品種中含有小麥相互易位染色體；Badaeva等[16]從世界不同區(qū)域的406種多倍體小麥中檢測(cè)出大量的不同染色體易位類型，且歐洲小麥中廣泛存在5B與7B染色體的易位。研究表明，染色體易位提高了小麥的黃銹病抗性以及對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)性[17-18]；除此之外，多個(gè)帶有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的小麥品種(如薩達(dá)姆27、揚(yáng)麥3號(hào)、豐抗13、Eshimashinrik、川麥62等)都被鑒定出小麥染色體發(fā)生了相互易位[19-23]。這些結(jié)果表明，染色體易位在現(xiàn)代小麥品種中分布十分普遍，在生產(chǎn)實(shí)踐上發(fā)揮了重要作用。

自20世紀(jì)以來，育種學(xué)家們進(jìn)行了大量有關(guān)小麥與其近緣物種遠(yuǎn)緣雜交的研究，極大地豐富了小麥的遺傳資源庫(kù)。遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的雜種后代中，也會(huì)出現(xiàn)多種小麥染色體之間的易位變異[24]。然而，大多數(shù)研究者主要關(guān)注于小麥與外源染色體之間所產(chǎn)生的變異及其對(duì)小麥性狀的影響，而對(duì)小麥染色體之間易位的相關(guān)研究報(bào)道還比較少，因此，其遺傳育種價(jià)值未得到有效利用。本課題組前期在利用八倍體小偃麥品系12-1179與普通小麥川麥107雜交轉(zhuǎn)移偃麥草優(yōu)異基因的過程中，獲得了一些性狀發(fā)生明顯變異的小麥染色體之間易位的材料。本研究利用非變性FISH(ND-FISH)技術(shù)對(duì)4個(gè)小麥染色體相互易位品系(TC、19Y-145、19Y-185、19Y-200)進(jìn)行分析鑒定，以期為創(chuàng)新小麥優(yōu)異種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所鑒定的4個(gè)小麥品系(TC、19Y-145、19Y-185、19Y-200)皆為八倍體小偃麥品系12-1179與普通小麥品種川麥107雜交后再與川麥107回交，然后至少連續(xù)自交10次以上的穩(wěn)定品系，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。由于品系TC對(duì)條銹病表現(xiàn)為免疫，并且大穗多花、籽粒飽滿、千粒重較高，因此重點(diǎn)對(duì)其農(nóng)藝性狀與其親本川麥107進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)與高感條銹病小麥品系SY95-71雜交得到F1代，F(xiàn)1代自交得到F2代，對(duì)其條銹病抗性進(jìn)行遺傳分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ND-FISH分析

染色體制片按照Han等[26]的方法進(jìn)行。ND-FISH分析所采用的寡核苷酸探針包括能夠區(qū)分小麥染色體的Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1[27]、區(qū)分小麥B和D染色體組的Oligo-B和Oligo-D[28]以及著絲粒特異探針Oligo-CCS1[27]。其中Oligo-pSc119.2-1、Oligo-D、Oligo-CCS1三種寡核苷酸探針以6-FAM-5-dUTP(綠色)進(jìn)行標(biāo)記，Oligo-pTa535-1、Oligo-B以Tamra-5-dUTP(紅色)進(jìn)行標(biāo)記，探針由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。雜交程序參照Fu等[29]的方法。在每管探針粉末中用 1×TE緩沖液(pH=7.0)溶解為100倍的探針母液，用2×SSC和1×TE緩沖液進(jìn)一步再稀釋10倍成為探針工作液。每張載玻片上滴加10 μL探針工作液，置于37 ℃恒溫水浴鍋中雜交2 h，雜交完后用2×SSC溶液清洗，晾干后向每張載玻片上滴加10 μL DAPI復(fù)染液，黑暗環(huán)境下放置10 min后，用熒光顯微鏡Nikon ECLIPSE 80i進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.2 農(nóng)藝性狀及抗病性調(diào)查

將供試材料種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)。品系TC與親本川麥107各種植4行，2個(gè)重復(fù)，成熟后各行隨機(jī)取10株對(duì)其有效分蘗、小穗數(shù)、穗長(zhǎng)、千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。品系TC與高感條銹病品系SY95-71雜交F1和F2代在田間分別種植1行和8行，每行15株左右，以SY95-71作為對(duì)照，于分蘗期接種含有CYR31、CYR32、CYR33、CYR34、水源11等條銹菌混合菌種，待對(duì)照葉片全部感染后對(duì)F1和F2代進(jìn)行觀察并記載反應(yīng)型(infection type,IT)，按0、0；、1、2、3、4六級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載，其中，0、0；、1、2為抗病型，3和4為感病型[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)小麥品系的親本核型

八倍體小偃麥品系12-1179是以中國(guó)春為母本，與中間偃麥草雜交得到F1代雜種，再與小麥栽培品種綿陽26回交得到F2代雜種，從F2代雜種連續(xù)自交過程中篩選結(jié)實(shí)性好的植株，繁殖至少8代而形成，楊 園等[30]對(duì)其染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，其染色體構(gòu)成為2n=56，含有 12條中間偃麥草染色體和44條小麥染色體，其中5D染色體為4條，沒有發(fā)現(xiàn)小麥之間易位的染色體。本研究采用混合寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對(duì)親本川麥107進(jìn)行ND-FISH分析，對(duì)照Tang等[27]的小麥標(biāo)準(zhǔn)ND-FISH核型，也未發(fā)現(xiàn)其存在小麥之間易位的染色體(圖1)，表明所鑒定材料發(fā)生的易 位均在八倍體小偃麥與普通小麥雜交過程中 產(chǎn)生。

綠色和紅色分別表示Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1探針信號(hào)。Green and red indicate the signals of Oligo-pSc119.2-1 and Oligo-pTa535-1,respectively.圖1 川麥107的ND-FISH雜交結(jié)果Fig.1 ND-FISH hybridization result of Chuanmai 107

2.2 4個(gè)小麥品系的核型

2.2.1 品系TC的核型

隨機(jī)選取10粒TC的種子，待發(fā)根后進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和ND-FISH分析，結(jié)果表明，其染色體數(shù)目為2n=42。利用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對(duì)染色體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TC在7B和3D染色體之間發(fā)生了相互易位(圖2A)，易位染色體在短臂之間和長(zhǎng)臂之間相互結(jié)合。采用混合探針Oligo-B和Oligo-D也證實(shí)了這種結(jié)果(圖2B)。進(jìn)一步用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系TC的著絲粒位置，并與混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)易位染色體斷裂點(diǎn)在著絲粒區(qū)域(圖2C和2D)，說明小麥品系TC具有一對(duì)3DS·7BS和一對(duì)3DL·7BL相互易位純合染色體。

A：以O(shè)ligo-pSc119.2-1(綠色)和Oligo-pTa535-1(紅色)作探針；B和D：以混合的Oligo-B(紅色)和Oligo-D(綠色)作探針，圖B和圖D分別表示不同的細(xì)胞；C：以O(shè)ligo-CCS1(綠色)作探針。圖4和圖5同。白色箭頭指示3DL·7BL易位染色體，紅色箭頭指示 3DS·7BS易位染色體。A:Oligo-pSc119.2-1(green) and Oligo-pTa535-1(red) were used as ND-FISH probes；B and D:Mixed Oligo-B(red) and Oligo-D(green) were used as ND-FISH probes,figure B and figure D indicate the different cells；C:Oligo-CCS1(green) was used as the ND-FISH probe.The same in figure 4 and figure 5.White and red arrows indicate 3DL·7BL and 3DS·7BS translocation chromosomes, respectively.圖2 品系TC的ND-FISH分析Fig.2 ND-FISH analysis of line TC

2.2.2 品系19Y-145的核型

隨機(jī)選取10粒19Y-145的種子，待發(fā)根后進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和ND-FISH分析，結(jié)果表明，19Y-145的染色體數(shù)目為2n=42條。用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對(duì)染色體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)19Y-145在2D與3B染色體之間發(fā)生了相互易位(圖3A)，易位染色體在短臂之間和長(zhǎng)臂之間相互結(jié)合。采用混合寡核苷酸探針Oligo-B和Oligo-D也證實(shí)這種結(jié)果(圖3B)。進(jìn)一步用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系19Y-145的著絲粒位置(圖3C)，并與混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)易位斷裂點(diǎn)也處于著絲粒區(qū)域，說明品系19Y-145具有一對(duì)2DS·3BS和一對(duì)2DL·3BL相互易位染 色體。

A：以O(shè)ligo-pSc119.2-1(綠色)和Oligo-pTa535-1(紅色)作探針；B：以混合Oligo-B(紅色)和Oligo-D(綠色)作探針；C：以O(shè)ligo-CCS1(綠色)作探針。白色和紅色箭頭分別指示2DL·3BL和 2DS·3BS易位染色體。A:Oligo-pSc119.2-1(green) and Oligo-pTa535-1(red) were used as ND-FISH probes. B:Mixed Oligo-B(red) and Oligo-D(green) were used as ND-FISH probes. C:Oligo-CCS1(green) was used as the ND-FISH probe. White and red arrows indicate 2DL·3BL and 2DS·3BS translocation chromosomes,respectively.圖3 品系19Y-145的ND-FISH分析Fig.3 ND-FISH analysis of line 19Y-145

2.2.3 品系19Y-185的核型

隨機(jī)選取10粒19Y-185的種子，待發(fā)根后進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和ND-FISH分析，結(jié)果表明，該品系的染色體數(shù)目為2n=42。使用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對(duì)染色體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)19Y-185在7B與4D 染色體之間發(fā)生了相互易位，易位染色體在短臂之間和長(zhǎng)臂之間相互結(jié)合(圖4A)。利用混合寡核苷酸探針Oligo-B和Oligo-D也證明了這種結(jié)果(圖4B)。進(jìn)一步用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系19Y-185的著絲粒位置，并與混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)19Y-185易位染色體的斷裂點(diǎn)位于7B染色體的長(zhǎng)臂和4D染色體的短臂上(圖4C和4D)，具有一對(duì)4DS-7BS·7BL和一對(duì)4DL·4DS-7BL相互易位染色體，但具體斷裂點(diǎn)還需采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步確定。

白色和紅色箭頭分別示4DL·4DS-7BL和4DS-7BS·7BL易位染色體。White and red arrows indicate 4DL·4DS-7BL and 4DS-7BS·7BL translocation chromosomes,respectively.圖4 品系19Y-185的ND-FISH分析Fig.4 ND-FISH analysis of line 19Y-145

2.2.4 品系19Y-200的核型

對(duì)19Y-200進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和ND-FISH分析發(fā)現(xiàn)，19Y-200的染色體數(shù)目為2n=42條。用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對(duì)染色體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)19Y-200在3B與3D染色體之間發(fā)生了相互易位(圖5A)。使用混合寡核苷酸探針Oligo-B和Oligo-D也證實(shí)了這種結(jié)果(圖5B)。用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系19Y-200的著絲粒位置，并結(jié)合混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果，發(fā)現(xiàn)19Y-200易位染色體的斷裂點(diǎn)在3B和3D染色體的長(zhǎng)臂上(圖5C和5D)，具有一對(duì)3BS·3BL-3DL和一對(duì)3BL-3DS·3DL相互易位染色體，但具體斷裂點(diǎn)還需通過分子生物學(xué)方法進(jìn)一步確定。

白色和紅色箭頭分別示3DL-3BS·3BL和3DS·3DL-3BL易位染色體。White and red arrows indicate 3DL-3BS·3BL and 3DS·3DL-3BL translocation chromosomes. respectively.圖5 品系19Y-200的ND-FISH分析Fig.5 ND-FISH analysis of line 19Y-200

2.3 品系TC的農(nóng)藝性狀和條銹病抗性

從外觀形態(tài)來看，品系TC與親本川麥107具有明顯差異，TC對(duì)條銹病表現(xiàn)免疫(IT=0)，而川麥107表現(xiàn)為感病(IT=3～4)，同時(shí)TC的每穗小穗數(shù)、穗長(zhǎng)和千粒重顯著或極顯著高于川麥107，因此品系TC具有比川麥107更優(yōu)異的農(nóng)藝性狀(表1和圖6)。

A：植株；B：麥穗；C：籽粒。在每個(gè)小圖中，左為品系TC，右為親本川麥107。A:Plant; B:Spike; C:Grain. In each picture,TC is on the left,and Chuanmai 107 is on the right.圖6 品系TC與親本川麥107的形態(tài)特征Fig.6 Morphology features of line TC and Chuanmai 107

表1 品系TC與CM107的農(nóng)藝性狀比較Table 1 Comparison of agronomic traits between line TC and Chuanmai 107

對(duì)TC與SY95-71雜交后得到的F1代和自交獲得的F2代的條銹病抗性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，在SY95-71重度感染(IT=4)的情況下，雜種F1代和TC均對(duì)條銹病表現(xiàn)為免疫。雜種F2代共有109株，其中抗病株數(shù)為74株，感病株數(shù)為35株，經(jīng)χ2測(cè)驗(yàn)，符合3∶1分離比例，說明品系TC的條銹病抗性是受一對(duì)顯性單基因控制。

3 討 論

染色體易位是物種進(jìn)化過程中基因組形成的重要驅(qū)動(dòng)力，易位后的基因擁有更高的進(jìn)化速度，其不僅改變了基因的連鎖群及其位置(表現(xiàn)出位置效應(yīng)等遺傳現(xiàn)象)，而且基因的重組頻率也發(fā)生改變[31]。楊財(cái)容[32]通過研究不同區(qū)域的六倍體披堿草，發(fā)現(xiàn)高海拔的六倍體披堿草屬物種具有更復(fù)雜的染色體組間易位，推測(cè)可能與其所處環(huán)境有關(guān)，染色體易位使其更能適應(yīng)高海拔環(huán)境。易位也是植物改變?nèi)旧w近著絲粒部分連鎖情況的主要方式，在小麥的進(jìn)化中發(fā)揮了較大作用[33]。

普通小麥作為異源六倍體作物，在長(zhǎng)期進(jìn)化和人工育種進(jìn)程中，染色體之間存在大量的易位變異。其中，5B-7B、3B-3D、4A-6B、2A-3A、2B-3B、3B-7B和2D-7B是常見的染色體易位類型[34]。但是由于受技術(shù)限制，多數(shù)易位的斷裂點(diǎn)還不確定，僅有5B-7B、5B-6B、4B-6B等少數(shù)幾個(gè)易位類型由于有明顯的Giemsa C帶帶紋特征，通過Giemsa C帶技術(shù)可確定是染色體之間的臂間易位[20,35-36]。本研究4個(gè)小麥品系(TC、19Y-145、19Y-185、19Y-200)均是八倍體小偃麥和川麥107通過遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制的染色體易位材料。采用ND-FISH和特定的重復(fù)序列為探針進(jìn)行多重FISH分析，發(fā)現(xiàn)TC和19Y-145分別是7B-3D和3B-2D通過著絲粒斷裂而形成的臂間易位純合品系，品系TC含有一對(duì)3DS·7BS和一對(duì)3DL·7BL相互易位染色體，品系19Y-145含有一對(duì)2DS·3BS和一對(duì)2DL·3BL相互易位染色體；而品系19Y-185中易位染色體的斷裂點(diǎn)在7B染色體的長(zhǎng)臂和4D染色體的短臂上，形成的是一對(duì)4DS-7BS·7BL和一對(duì)4DL·4DS-7BL染色體相互易位的純合體；品系19Y-200中易位染色體的斷裂點(diǎn)位于3B和3D染色體的長(zhǎng)臂上，形成的是一對(duì)3BS·3BL-3DL和一對(duì)3DS·3DL-3BL染色體相互易位的純合體。這4種易位類型除3B-3D染色體易位類型[37]外，其余3種未見前人進(jìn)行過相關(guān)報(bào)道，是新的小麥染色體核型變異類型。

Qi等[38]研究表明，普通小麥染色體的B基因組比A和D基因組更容易進(jìn)行重排。本研究中所鑒定的四種染色體變異均為B和D染色體組之間的易位，而未發(fā)現(xiàn)A基因組的易位。但前人研究認(rèn)為，A和B染色體組之間更易發(fā)生易位[34]，原因可能是本研究鑒定到的4個(gè)小麥品系為八倍體小偃麥和普通小麥雜種后代的高世代材料，而在八倍體小偃麥和普通小麥雜種后代的低世代材料中，由于存在大量單價(jià)染色體的斷裂與融合，既會(huì)產(chǎn)生小麥與中間偃麥草染色體的易位，也會(huì)出現(xiàn)小麥自身不同染色體的易位。Law等[22]報(bào)道，不管是自然雜交品種還是育成品種，小麥自身染色體易位的發(fā)生具有一定地域特性。如5B-7B染色體易位更常見于西方國(guó)家的小麥；埃塞俄比亞四倍體小麥中發(fā)現(xiàn)了新的染色體易位T2A·4B、T1B·6B和T5B·6B[16,39]；兩份中國(guó)云南特有的云南鐵殼麥中發(fā)現(xiàn)了1BS·1BL-2DL和2DS·2DL-1BL染色體易位[40]。本研究中鑒定到的小麥染色體4種易位類型僅發(fā)生B和D基因組染色體之間，推測(cè)可能與四川的環(huán)境、氣候相關(guān)，小麥B-D染色體易位增加了其在當(dāng)?shù)丨h(huán)境中的適應(yīng)性。

本研究的4個(gè)染色體易位材料中，品系TC表現(xiàn)出良好的大穗多花、籽粒飽滿、千粒重高等農(nóng)藝特征，而且對(duì)條銹病表現(xiàn)為高抗。對(duì)其抗病性分析發(fā)現(xiàn)，其受一對(duì)顯性基因控制。因此品系TC可能是一個(gè)優(yōu)良的育種材料。這些良好的農(nóng)藝性狀和高抗條銹病的特性是否涉及染色體易位或連鎖群改變，還需進(jìn)一步研究。