脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)靶向大鼠缺血心肌及減少缺血再灌注損傷的研究*

王秋玲 沈罟 丁芷萱 王俊珊 汪芳 諸葛縈

心肌缺血再灌注損傷(myocardium ischemiareperfusion injury，MI-RI)是指心肌組織經(jīng)過急性缺血事件后，當(dāng)迅速恢復(fù)血流灌注時(shí)，缺血組織不僅沒有得到改善或恢復(fù)，反而引起心肌細(xì)胞凋亡、心肌結(jié)構(gòu)功能損傷加劇的現(xiàn)象[1]。MI-RI通常引起心律失常及心功能持續(xù)惡化，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及氧自由基爆發(fā)、細(xì)胞凋亡、鈣超載及代謝障礙等。目前治療心肌梗死無法有效避免MIRI，這嚴(yán)重制約了冠心病的治療效果。

脂質(zhì)體可天然存在，也可人工合成[2]，類似于生物細(xì)胞膜，是由親水頭部和親脂尾部構(gòu)成的脂質(zhì)雙分子層，該結(jié)構(gòu)可將藥物包載其中。脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)(liposome drug delivery system，LDDS)是指脂質(zhì)體包載藥物并使藥物選擇性地濃集于靶向部位的給藥系統(tǒng)[3]，這種天然的炎癥靶向效應(yīng)使藥物更多地聚焦病變部位，從而增強(qiáng)藥物在局部組織的療效，同時(shí)延長了藥物血漿半衰期、減少藥物有效劑量和藥物不良反應(yīng)。為此，本研究分別制備IR-775 熒光脂質(zhì)體、胺碘酮脂質(zhì)體和丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)脂質(zhì)體等藥物，并在缺血-再灌注(I-R)損傷模型中考察其靶向性及治療優(yōu)勢。進(jìn)而探討治療MI-RI的一種新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，鼠齡8～9周，體重(260±20)g(購自上海市崇明區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、鹽酸胺碘酮(上海泰坦化學(xué)有限公司)、丙酮酸乙酯(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、IR-775熒光染料(上海泰坦化學(xué)有限公司)、GAPDH 鼠單克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)、Bax鼠單克隆抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司)、Bcl-2鼠單克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)、Caspase-3鼠單克隆抗體(上海朗頓生物科技有限公司)、ECL 發(fā)光試劑盒(GE 公司)、BCA 蛋白定量試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)。小動(dòng)物呼吸機(jī)(型號ALC-V8，上海奧爾科特生物科技有限公司)、Western 顯影儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂質(zhì)體藥物制備及考察 采用薄膜分散-超聲-膜擠出法制備載藥脂質(zhì)體，使用Box-Behnken設(shè)計(jì)法，以磷脂與膽固醇質(zhì)量比、磷脂與藥物質(zhì)量比以及超聲時(shí)間為優(yōu)化設(shè)計(jì)的三個(gè)因素，以包封率為響應(yīng)值，優(yōu)化脂質(zhì)體的處方和制備工藝，得到最優(yōu)載藥脂質(zhì)體處方，使用馬爾文粒度儀考察脂質(zhì)體粒徑、zeta電位及粒度分布，并測量脂質(zhì)體的包封率[4]。

在室溫條件下稱取一定量的胺碘酮或者EP藥物以及適量的膽固醇和蛋黃卵磷脂置于100 ml的圓底燒瓶中，加入20 ml氯仿攪拌均勻，使藥物完全溶解，將燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在60℃水浴條件下減壓旋蒸，以徹底揮發(fā)有機(jī)溶劑，當(dāng)看到瓶底形成半透明膜或者白色蜂巢狀膜時(shí)，加入7 ml生理鹽水，充分搖晃震蕩直至薄膜水化，探針超聲一定時(shí)間后，過0.45μm 聚碳酸酯膜3次，即可得到脂質(zhì)體藥物的混懸液。將制備好的胺碘酮脂質(zhì)體及EP脂質(zhì)體放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模與分組 雄性SD 大鼠術(shù)前禁食禁飲8 h。用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。在喉鏡直視下插管，氣管與小動(dòng)物呼吸機(jī)相連進(jìn)行機(jī)械通氣。具體參數(shù)：呼吸頻率80次/分，潮氣量為每100 g體重2 ml，呼吸比1∶2，吸入氣中氧濃度99%。I-R 組制備：在第四肋間打開大鼠胸腔，暴露左胸腔，尾靜脈注射300 u/kg普通肝素，10 min后在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處下方約2 mm處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，建立缺血模型，缺血30 min后打開動(dòng)脈夾恢復(fù)LAD血流。術(shù)后立即尾靜脈注射0.2 ml相關(guān)藥物或溶液。假手術(shù)組制備：大鼠開胸，暴露LAD 不予夾閉，其余操作同前。大鼠建立MI-RI模型時(shí)，在四肢皮下各置入一電極，連接心電圖機(jī)，觀察建模、用藥前后心電圖變化。

1.2.3 大鼠心肌I-R 模型IR-775熒光成像實(shí)驗(yàn)IR-775氯化物屬七甲吲哚類近紅外染料，屬親脂性陽離子化合物。其熒光最大激發(fā)及發(fā)射波長在795～815 nm 之間，作為IR 系列近紅外染料的一種，廣泛運(yùn)用于活體動(dòng)物或細(xì)胞的熒光成像。IR-775 脂質(zhì)體制備操作如下：在50 m L 圓底燒瓶中，加入精密稱得的處方量蛋黃卵磷脂、IR-775 和膽固醇，再加入適量氯仿，于超聲輔助下充分溶解。在40℃、40 rpm 下，減壓蒸發(fā)除去氯仿，得到透明均勻的脂質(zhì)體膜。加入適量生理鹽水劇烈振搖至薄膜完全脫落溶解，并及時(shí)封口。將燒瓶置于水浴中，充分水化，得到白色乳狀脂質(zhì)體混懸液。然后，超聲波細(xì)胞破碎儀探頭超聲處理脂質(zhì)體(10 min，工作1 s，間隔1 s)。最后分別經(jīng)過直徑為0.45μm 和0.22μm 聚碳酸酯膜依次擠壓后形成IR-775脂質(zhì)體。

取16只SD 大鼠隨機(jī)分成4組(每組4只)：①假手術(shù)＋I(xiàn)R-775 脂質(zhì)體組；②I-R＋I(xiàn)R-775 脂質(zhì)體組；③I-R＋I(xiàn)R-775溶液組；④I-R＋生理鹽水組。48 h后處死大鼠，取整個(gè)心臟置于IVIS Lumina III活體成像系統(tǒng)箱(激發(fā)波長770 nm，發(fā)射波長830 nm)內(nèi)，考察各組大鼠體內(nèi)熒光信號強(qiáng)度。

1.2.4 評估脂質(zhì)體藥物對大鼠術(shù)后心律失常事件的影響 取24 只SD 大鼠，分4 組處理(每組6只)：①I-R＋空白脂質(zhì)體組；②I-R 組；③I-R＋胺碘酮脂質(zhì)體組；④I-R＋胺碘酮溶液組。其中胺碘酮藥物濃度為2.5 mg/kg。

連續(xù)跟蹤記錄每只大鼠的心電圖，再結(jié)合MIRI 30 min 后的心電圖，使用Cutis and walker(1988)心律失常評分法評估每組大鼠的心律失常事件：房性心律失?；驘o心律失?！?分；單個(gè)室性早搏(簡稱室早)—1分；頻發(fā)室早—2分；單次室性心動(dòng)過速(簡稱室速)時(shí)長＜60 s—3分；一陣室速總時(shí)長＞60 s或累計(jì)多陣室速總時(shí)長＜60 s—4分；多陣室速總時(shí)長＞60 s—5分；心室顫動(dòng)(簡稱室顫)—6分；室顫時(shí)長＞5 min或術(shù)中死亡—7分。

1.2.5 評估脂質(zhì)體藥物對大鼠術(shù)后細(xì)胞凋亡的影響 取24 只SD 大鼠，分4 組處理(每組6只)：①I-R＋空白脂質(zhì)體組；②假手術(shù)＋EP 脂質(zhì)體組；③I-R＋EP 脂質(zhì)體組；④I-R＋EP 溶液組；其中EP為50 mg/kg。

48 h后處死大鼠，沿LAD 走向取其供血的左室前壁心肌，剪碎制成心肌組織冷勻漿，置于放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液中充分研磨，離心，取上清液，用BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)蛋白樣本取20 u 上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂牛奶封閉約90 min后，分別加入一抗(抗GAPDH 抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2 抗體、抗Caspase-3 抗體)4℃孵育過夜，其中抗GAPDH 抗體作為內(nèi)部參照；用Tris緩沖鹽水和TBST 洗膜后，加入二抗，室溫孵育1 h 后再洗膜，最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯示膜上的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS23.0 軟件對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體藥物的表征

所制備的脂質(zhì)體藥物粒徑均勻(見表1)，制備后24天內(nèi)藥物滲漏不高于18%，穩(wěn)定性良好。

表1 胺碘酮脂質(zhì)體與EP脂質(zhì)體的粒徑、zeta電位及粒度分布

2.2 各組熒光信號強(qiáng)度表現(xiàn)

I-R＋I(xiàn)R-775脂質(zhì)體組熒光強(qiáng)度最高，I-R＋生理鹽水組(無熒光信號)，I-R＋I(xiàn)R-775 溶液組和假手術(shù)＋I(xiàn)R-775組介于上述二者之間(圖1A、1B)。

圖1 大鼠心肌I-R 模型IR-775熒光成像圖(A)及對應(yīng)實(shí)物圖(B)

2.3 大鼠心律失常事件及評分

夾閉LAD 30 min后打開動(dòng)脈夾，相比于正常心電圖，I-R 后心電圖觀察到T 波高聳、缺血性ST段弓背向上抬高，再灌注后可見室速(見圖2)。

圖2 MI-IR 手術(shù)前后大鼠心電圖的演變

I-R＋空白脂質(zhì)體組、I-R 組、I-R＋胺碘酮脂質(zhì)體組、I-R＋胺碘酮溶液組的心律失常評分分別為4.0±0.82、4.5±0.96、1.5±0.96、3.0±0.82。與其他三組相比，I-R＋胺碘酮脂質(zhì)體組心律失常評分明顯降低(P＜0.01)，且低于胺碘酮溶液組(P＜0.05)。

2.4 各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

與其他三組相比，I-R＋空白脂質(zhì)體組的Bax、caspase-3表達(dá)水平最高(P＜0.05)，假手術(shù)＋EP脂質(zhì)體組和I-R＋EP脂質(zhì)體組明顯低于I-R＋空白脂質(zhì)體組和I-R＋EP溶液組；而Bcl-2蛋白正好相反，假手術(shù)＋EP脂質(zhì)體組和I-R＋EP脂質(zhì)體組表達(dá)水平明顯高于I-R＋空白脂質(zhì)體組和I-R＋EP溶液組(P＜0.05)(見圖3，表2)。與I-R＋空白脂質(zhì)體組相比，I-R＋EP 脂質(zhì)體組的Bax/Bcl-2 比值明顯下降。

表2 各組細(xì)胞凋亡蛋白的相對表達(dá)量的比較

圖3 Western Blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

MI-RI是目前急性心肌梗死患者行血運(yùn)重建術(shù)中難以避免的一項(xiàng)難題，探索治療MI-RI的新方法是本研究的主要內(nèi)容。LDDS具有諸多優(yōu)點(diǎn)，可大大改善藥物的體內(nèi)分布和藥代動(dòng)力學(xué)特征，不僅使藥物具有緩釋效果，并且得益于LDDS天然的炎癥靶向效應(yīng)，使藥物更多地靶向至病變部位：脂質(zhì)體藥物進(jìn)入體內(nèi)后被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，特別是吞噬細(xì)胞，當(dāng)出現(xiàn)MI-RI時(shí)，病變組織釋放大量炎癥因子，動(dòng)員和引導(dǎo)包括吞噬細(xì)胞在內(nèi)的大量炎癥細(xì)胞浸潤[6]，從而將所攜帶的藥物傳遞給病變組織，使藥物在病變部位聚集，降低藥物副作用的同時(shí)，顯著提高藥物療效[7]。此外，MI-RI中血管的通透性增加，誘導(dǎo)納米藥物的長滯留效應(yīng)[8]，增強(qiáng)了脂質(zhì)體藥物在MI-RI的靶向效應(yīng)。本研究重點(diǎn)考察了LDDS在大鼠MI-RI組織中的靶向效應(yīng)和獨(dú)特作用。

在本項(xiàng)研究中，筆者通過結(jié)扎SD 大鼠冠狀動(dòng)脈LAD 的方法，制備了SD 大鼠的MI-RI模型，其繼發(fā)室速的現(xiàn)象與I-R 損傷密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道的氧自由基堆積[9]和細(xì)胞內(nèi)鈣超載[10]等機(jī)制下所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)一致。在該動(dòng)物模型上，本研究首先驗(yàn)證了IR-775熒光脂質(zhì)體在心肌缺血區(qū)域的炎癥靶向效應(yīng)，結(jié)果證實(shí)，與游離IR-775、假手術(shù)組對比，IR-775脂質(zhì)體明顯增強(qiáng)了I-R 心肌組織中的熒光信號，這說明在MI-RI區(qū)域，脂質(zhì)體藥物確實(shí)能發(fā)揮炎癥靶向作用。

此后，筆者通過胺碘酮脂質(zhì)體和EP脂質(zhì)體，考察了LDDS靶向效應(yīng)的治療優(yōu)勢。胺碘酮是經(jīng)典的抗心律失常藥物，可用于致命性心律失常的緊急治療。本研究證實(shí)，與游離藥物相比，胺碘酮脂質(zhì)體顯著改善了MI-RI心律失常事件評分。

另一方面，EP具有清除氧自由基，減少促炎因子的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用[5，11]，因此，本研究也通過EP脂質(zhì)體評估了靶向效應(yīng)對MI-RI區(qū)域凋亡蛋白的影響。

Bcl-2家族蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一[12－13]，尤其Bax與Bcl-2的比值與細(xì)胞凋亡水平密切相關(guān)：當(dāng)Bax/Bcl-2 比值增高時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反之，則抑制細(xì)胞凋亡[14]。而Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，Caspase-3激活和超表達(dá)均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。因此，Bax、Bcl-2、Caspase-3，及Bax/Bcl-2 比值都可以作為評價(jià)細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，EP脂質(zhì)體均顯著降低了MI-RI中Bax蛋白、Caspase-3 表達(dá)水平，而Bcl-2 表達(dá)水平明顯增高，Bax/Bcl-2 比值顯著下降；與游離藥物相比，LDDS增強(qiáng)了對上述凋亡蛋白表達(dá)的影響。因此，LDDS增強(qiáng)了EP在MI-RI中對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，減輕了I-R 損傷。

通過該項(xiàng)研究，證實(shí)LDDS可在MI-RI中發(fā)揮炎癥靶向效應(yīng)，并借助于該效應(yīng)，可使相關(guān)藥物進(jìn)一步改善MI-RI對心臟的不利影響，增強(qiáng)治療效果，或許是一種治療MI-RI的新策略。