柬埔寨與緬甸DENV-1型患者臨床特征比較

黃 瑛，劉 冰，張燕玲，李 楊，羅 云，武 彥

(1.昆明市第三人民醫(yī)院 感染性疾病科，云南 昆明 650041; 2.大理大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000)

0 引 言

登革熱(Dengue Fever,DF)是登革病毒(Dengue Virus,DENV)引起的急性蟲(chóng)媒傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2].DF臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，可分為登革熱、登革出血熱及登革休克綜合癥[3].DENV有四種血清型，即DENV1-DENV4，它們的氨基酸序列具有很高的相似度(70%～80%)[4].東南亞是DF流行較早且疫情比較嚴(yán)重的地區(qū)，東南亞的雨林被認(rèn)為是DENV的起源地之一[5-6]，DENV-1型在東南亞地區(qū)流行較為廣泛[7].近年來(lái)云南省DF疫情逐漸由原來(lái)的輸入性為主轉(zhuǎn)變成本地流行為主，昆明市作為中國(guó)與南亞與東南亞地區(qū)連接的橋頭堡地區(qū)，自2005年報(bào)告了首例輸入性登革熱病例以來(lái)，昆明市報(bào)告的輸入性登革熱病例呈逐年增加的趨勢(shì)[8-10].

本研究選擇昆明市 2015 ～ 2019 年輸入病例最多的柬埔寨與緬甸的DF病例，分析對(duì)比兩組臨床特征、分子生物學(xué)流行特征，為登革熱臨床診療及防控提供理論依據(jù).

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015～2019 年間來(lái)自柬埔寨和緬甸確診為DENV-1型感染的病例，診斷符合國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)印發(fā)的《登革熱診斷》(WS216-2018)[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn).共102 例，柬埔寨52例，男39例，女13 例，平均年齡(33.33±8.81)歲；緬甸50例，男44例，女6例，平均年齡為(34.80±12.14)歲，兩組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性.

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):選擇來(lái)自柬埔寨及緬甸的DENV核酸檢測(cè)為DENV-1的病例.

排除標(biāo)準(zhǔn):剔除伴有其他感染性疾病、其他原因所致肝損傷、心臟基礎(chǔ)疾患、血液系統(tǒng)疾病等病例，以及住院時(shí)間低于一周的病例.

1.3 研究?jī)?nèi)容

一般情況：年齡、性別等.臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛、眼眶痛、皮膚瘙癢、出血(牙齦出血、鼻出血、皮下出血、消化道出血、血尿、血痰)、皮疹、皮膚瘀斑瘀點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)(白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板等)，肝功能(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移- ALT、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶-AST、r-谷氨酰氨基轉(zhuǎn)肽酶GGT)、心肌酶(乳酸脫氫酶-LDH、肌酸激酶-CK)等；登革病毒基因序列分析.將柬埔寨病例與緬甸病例的以上資料進(jìn)行對(duì)比分析.

1.4 研究方法

1.4.1 登革病毒核酸檢測(cè)及分型

使用Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取試劑盒(蘇州天隆生物科技有限公司)提取患者血清中的病毒RNA,使用TaKaRa Prime ScriptTM RT-PCR reagentKit 試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行cDNA的合成反應(yīng).參考1992年Robert等[11]設(shè)計(jì)的D1(TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG),D2(TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG)通用型引物進(jìn)行登革病毒核酸檢測(cè)，根據(jù)試劑和說(shuō)明進(jìn)行經(jīng)第一輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，觀(guān)察有無(wú)目的條帶，如電泳條帶分子量大小與目的條帶分子量大小一致，則判定為登革病毒感染，否則為陰性，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.將第一輪陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行型別特異性檢測(cè)，引物參考《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS216—2018)[3].反應(yīng)條件可根據(jù)使用的試劑說(shuō)明進(jìn)行調(diào)整.針對(duì)特異性引物探針定量結(jié)果陽(yáng)性樣本，柬埔寨及緬甸兩個(gè)地區(qū)各隨機(jī)選擇20例樣本使用對(duì)應(yīng)基因型的半巢式PCR引物進(jìn)行半巢式PCR的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，觀(guān)察有無(wú)目的條帶，有目的條帶的陽(yáng)性樣本進(jìn)行Sanger測(cè)序.

1.4.2 基因測(cè)序

目前Sanger測(cè)序是作為基因測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究用特異性引物擴(kuò)增陽(yáng)性樣本的E區(qū)的部分片段，將PCR產(chǎn)物直接送至昆明碩擎生物有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.4.3 序列分析

Sanger測(cè)序結(jié)果最初使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的基本局部比對(duì)搜索工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行驗(yàn)證.從GenBank中檢索DENV-1型E基因序列.用 Mega5.0 鄰接法進(jìn)行登革病毒基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析.本研究中從GenBank下載了來(lái)自于不同國(guó)家和地區(qū)、不同年代的28株DENV-1型登革病毒E基因序列進(jìn)行測(cè)序，分別為(KC182108，老撾,2010),(KC182110,老撾,2010)，(JQ993198,泰國(guó),2007)，(AY732482,泰國(guó))，(DQ836632，中國(guó)寧波，2004)，(FJ196855,中國(guó)廣州,2006)，(JN415527,泰國(guó),2008)，(GQ868637,柬埔寨,2000)，(AY726553,緬甸)，(DQ265118,緬甸)，(AY618211,緬甸,2001),(DQ264978,緬甸)，(KC172835,老撾,2008)，(GQ328923,馬來(lái)西亞，2004)，(GQ398255,新家坡,2008)，(FJ882569,越南,2004)，(DQ193572,中國(guó)福建，2005)，(AF350498,GZ/80),(AY726555,緬甸，1998)，(AF180817,美國(guó)，1999),(AF425629,泰國(guó)，1963)，(EF457905,馬來(lái)西亞，1972)，(AF425617,哥倫比亞，1996)，(FJ850071,巴西北部，2000)，(EU179861,文萊，2006)，(AB195673,日本，2003)，(AB189121,印度尼西亞，1998)，(FJ687476,韓國(guó)，2007).

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組間典型臨床表現(xiàn)比較

兩組患者均有發(fā)熱，兩組在頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢、出血的例數(shù)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1.

表1 兩組典型臨床表現(xiàn)比較[n(%)]

2.2 兩組間典型癥狀持續(xù)時(shí)間比較

柬埔寨與緬甸兩組患者在發(fā)病至就診間隔時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在住院天數(shù)、體溫峰值、發(fā)熱、頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢的成效時(shí)間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表2.

表2 兩組典型癥狀持續(xù)時(shí)間比較

2.3 柬埔寨組與緬甸組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

兩組中出現(xiàn)白細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、GGT升高、凝血酶原時(shí)間(PT)延長(zhǎng)、活化部分凝血酶原時(shí)間(ATPP)延長(zhǎng)的例數(shù)對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者在血小板減少、AST升高、ALT升高、LDH升高、CK升高的例數(shù)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)表3.

表3 兩組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較[n(%)]

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

特異性分型熒光定量PCR結(jié)果顯示，102陽(yáng)性樣本均屬于血清型1型，其余血清型均未檢出.隨機(jī)挑選的40例樣本使用血清型1型巢式PCR引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到條帶清晰、大小與目的條帶一致的血清型1型樣本共33例，其中緬甸輸入有14例，柬埔寨輸入19例，經(jīng)Sanger測(cè)序，測(cè)序峰圖單一、完整.后進(jìn)行482bp的同源關(guān)系進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示19例柬埔寨輸入性樣本集中成簇，bootstrap值為99%，為登革血清型1型；另外14例緬甸輸入性樣本以2株及12株分為兩簇，同樣顯示為登革血清型1型.雖然兩組血清型別及基因型別均為Ⅰ型，但分屬于不同簇，由圖1可知，19例柬埔寨分離株與柬埔寨分離株(GQ868637,2000)位于同一分支下，親緣關(guān)系較近；2例緬甸分離株單獨(dú)成簇，與泰國(guó)分離株(AY732482),泰國(guó)分離株(JQ993198,2007)親緣關(guān)系較近，位于同一分支上；12株單獨(dú)成簇的緬甸株與馬來(lái)西亞分離株(GQ328932,2004),新家坡分離株(GQ398255,2008)位于同一進(jìn)化分支上，親緣關(guān)系較近.

圖1 2015 ～ 2019 年昆明市輸入型登革熱Ⅰ型病毒E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Evolutionary tree of E genome of type I dengue enterovirus in Kunming City from 2015 to 2019

3 討 論

2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)將DF列為全球十大健康威脅之一.目前，已經(jīng)有100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道過(guò)DF[12].DENV血清型分為四型，研究認(rèn)為，不同地區(qū)的 DENV-1存在一定差異并具明顯地域特征，DENV-1可分為5個(gè)基因型，其中G-I為主要基因型，亦屬東南亞DENV-1的優(yōu)勢(shì)基因型[7, 13-14].分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DENV各型別的基因多樣性在增加，導(dǎo)致產(chǎn)生不同毒力的病毒株，將會(huì)使得人類(lèi)面臨更多類(lèi)型病毒株的危害[15].云南省邊境與東南亞多個(gè)國(guó)家毗鄰且邊境線(xiàn)較長(zhǎng)，使得云南省輸入性病例的發(fā)生、傳播概率大為增加,在一定程度上增加了云南防治登革熱的壓力.研究表明[16]，云南邊境地區(qū)DENV1-DENV4均有出現(xiàn).2015年臨滄市[17]、2017年西雙版納[18]、2013年瑞麗市均出現(xiàn)DENV-1流行，且與泰國(guó)、緬甸流行株親緣關(guān)系最近，而與印度和美洲地區(qū)流行株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)[19]，顯示出云南省流行的DENV型別與鄰近的泰國(guó)、緬甸、柬埔寨、老撾等東南亞國(guó)家流行的DENV型別密切相關(guān)[16, 20].

DF典型的臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢、出血為主[3].本次研究中，柬埔寨與緬甸輸入性病例與云南本土病例的主要臨床表現(xiàn)基本一致[17-18, 21-22]，均出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、乏力、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹等癥狀.研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)熱仍為所有病例的首發(fā)癥狀，體溫峰值緬甸組(39.17±0.54) ℃高于柬埔寨組(38.94±0.59) ℃(P<0.05)；柬埔寨組出現(xiàn)頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢的例數(shù)較緬甸組多見(jiàn)(P<0.05)，且癥狀持續(xù)時(shí)間也比緬甸組長(zhǎng)(P<0.05)；緬甸組出現(xiàn)出血的表現(xiàn)較柬埔寨組多見(jiàn)(P<0.05).說(shuō)明緬甸組可能較柬埔寨組毒血癥狀重，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng).而柬埔寨組相對(duì)毒血癥狀輕，但癥狀持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng).研究顯示DENV常會(huì)引起患者血液、肝臟、心臟、呼吸等多系統(tǒng)的損害，導(dǎo)致其恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)短受到影響[9, 23].本研究?jī)山M患者均有多系統(tǒng)多臟器受損表現(xiàn).兩組的外周血像中白細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)減少人數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但血小板減少人數(shù)緬甸組明顯多于柬埔寨組(P<0.05)，與出血情況相符合.兩組肝損傷均主要表現(xiàn)為AST和ALT升高，其中緬甸患者中出現(xiàn)肝損傷的人數(shù)多于柬埔寨組(P<0.05)；心肌損傷以L(fǎng)DH升高、CK升高為主，且緬甸患者出現(xiàn)心肌損傷的人數(shù)高于柬埔寨組(P<0.05).說(shuō)明緬甸組的免疫損傷重于柬埔寨組.DF免疫損傷機(jī)制與癥狀、器官損害具有相關(guān)性[24-25]，可能與DENV突變也有相關(guān)性[26].

目前，登革熱在熱帶、亞熱帶地區(qū)流行，東南亞地區(qū)以泰國(guó)、印度尼西亞、緬甸和柬埔寨等國(guó)較為嚴(yán)重[24].本研究對(duì)緬甸和柬埔寨共33例樣本的登革病毒序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)全部為登革血清型1型(兩個(gè)國(guó)家的患者登革病毒進(jìn)化樹(shù)親緣關(guān)系不在同一分支上)，與近年來(lái)東南亞國(guó)家和我國(guó)云南地區(qū)流行的毒株存在高度相似性[25]，提示我國(guó)云南流行病毒株來(lái)源于東南亞地區(qū).此外，有報(bào)道2020年新加坡地區(qū)爆發(fā)了DENV-3型，提示邊境檢驗(yàn)檢疫應(yīng)提高對(duì)四個(gè)血清型的檢測(cè)能力，臨床救治的同時(shí)也應(yīng)做好防蚊、滅蚊隔離預(yù)防工作，減少輸入性傳播及進(jìn)一步本地化.

4 結(jié) 論

云南地處西南邊陲，與緬甸、老撾、越南三個(gè)東南亞國(guó)家相鄰，通過(guò)瀾滄江-湄公河與柬埔寨和泰國(guó)兩國(guó)相連，還與孟加拉國(guó)、馬來(lái)西亞、印度、新加坡鄰近.隨著我國(guó)與這些鄰國(guó)政治、經(jīng)濟(jì)往來(lái)不斷增加，登革熱病例的輸入不斷增加，隨著中國(guó)密集的人口及其巨大的流動(dòng)，使得云南省乃至中國(guó)輸入性登革熱發(fā)病率逐漸上升，進(jìn)一步造成本地化幾率也逐漸上升.2013年至今云南省西雙版納等地區(qū)，2014年至今全國(guó)如廣州等省均出現(xiàn)本地病例的爆發(fā)流行，預(yù)防控制、診療、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)壓力增加.可以得到如下結(jié)論：

1)從同源關(guān)系進(jìn)化樹(shù)分析，在東南亞不同地區(qū)，相同血清型登革病毒多不在同一分支，親緣關(guān)系不近，甚至存在同一地區(qū)也有多種親緣關(guān)系不近的情況，因此出現(xiàn)有差異的臨床表現(xiàn)，治療干預(yù)方法也應(yīng)隨之變化.

2)本研究中來(lái)源于柬埔寨的患者與來(lái)源于緬甸的患者，在臨床表現(xiàn)上存在一定的差異.緬甸組較柬埔寨組毒血癥狀重、器官損害重，而柬埔寨組雖然毒血癥狀輕、器官損害相對(duì)輕，但癥狀持續(xù)時(shí)間長(zhǎng).這些特點(diǎn)提示臨床醫(yī)生，對(duì)毒血癥狀重及組織器官損害重的患者在早期給予強(qiáng)有力干預(yù)，防止向重癥發(fā)展；對(duì)于癥狀相對(duì)輕且病程長(zhǎng)者，做好患者心理疏導(dǎo)，對(duì)癥處理不適癥狀.

3)對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的病例應(yīng)進(jìn)行病原學(xué)、臨床表現(xiàn)的對(duì)比分析、總結(jié)，不斷積累，制定干預(yù)措施，降低機(jī)體受損的程度，減少重癥發(fā)生率，減少死亡率.同時(shí)對(duì)病原學(xué)的監(jiān)測(cè)，也為登革熱的預(yù)防干預(yù)提供依據(jù).