滇龍膽提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞的抗炎作用

李鑫波，劉秀嶶，吳昕怡，田 浩，劉 靜，謝曉麗

(1.昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650221)

0 引 言

炎癥是宿主對(duì)致炎因子刺激產(chǎn)生的一種防御性為主的免疫反應(yīng)，體內(nèi)多種細(xì)胞被招募到免疫微環(huán)境中，產(chǎn)生細(xì)胞因子消除外界因素的入侵，恢復(fù)機(jī)體健康，但持續(xù)存在的炎癥會(huì)對(duì)機(jī)體器官以及全身反應(yīng)產(chǎn)生損害，在很多復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色[1].巨噬細(xì)胞在調(diào)控宿主炎癥反應(yīng)變化的過程中扮演著重要角色.存在于源自病原體、受傷組織或適應(yīng)性免疫的激活效應(yīng)子的不同微環(huán)境中的信號(hào)，會(huì)在分化巨噬細(xì)胞中引發(fā)不同的遺傳程序，從而誘導(dǎo)不同的功能極化狀態(tài).M1和M2是用于定義在體外激活為促炎(當(dāng)與經(jīng)典的IFN-γ和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS))或抗炎(當(dāng)分別使用IL-4或IL-10激活)兩種[2].M1極化的巨噬細(xì)胞對(duì)于在損傷后引發(fā)炎癥反應(yīng)至關(guān)重要，而切換到M2表型似乎對(duì)于消退炎癥和損傷組織的再生至關(guān)重要.正常機(jī)體內(nèi)的巨噬細(xì)胞經(jīng)常維持一種穩(wěn)態(tài)的平衡，然而當(dāng)巨噬細(xì)胞極化失調(diào)則可能導(dǎo)致多種慢性炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展，例如膿毒癥、動(dòng)脈粥狀硬化、哮喘及炎癥性腸病等[3].因此，抑制持續(xù)的M1型巨噬細(xì)胞存在和促進(jìn)M2表型的表達(dá)可能在炎癥相關(guān)疾病中獲益，這也使得對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控有望成為控制和治療這些炎癥性疾病新的靶點(diǎn).

Rel /NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族的成員是炎癥應(yīng)答過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑.在哺乳動(dòng)物中，Rel家族由5個(gè)成員組成，即c-Rel、NF-κB p65(RelA)、RelB、NF-κB1(p50 / p105)和NF-κB2(p52 / p100).Rel二聚體通常通過與IκB蛋白的胞質(zhì)結(jié)合而維持在非活性狀態(tài)[4].細(xì)胞活化導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致IκB的磷酸化和降解，從而使Rel二聚體迅速轉(zhuǎn)移核并結(jié)合DNA.STING 作為一種 I 型干擾素刺激基因,在天然免疫中發(fā)揮著重要作用.STING與活化信號(hào)結(jié)合活化后，進(jìn)而募集并活化 TBK1和 IRF3,最終引起IRF3磷酸化并促進(jìn)一型干擾素的產(chǎn)生[5].研究表明STING激活的下游也觀察到 NF-κB信號(hào)通路的激活[6]， 同時(shí)實(shí)驗(yàn)也表明活化的TBK1與IKKβ相互作用并磷酸化IKKβ，從而激活STING-TBK1介導(dǎo)的NF-κB通路[7].

滇龍膽(Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.)，也稱堅(jiān)龍膽，為龍膽科多年生草本植物，作為云南地區(qū)特有的藥用植物，其保肝、健脾的藥效廣為當(dāng)?shù)厮?沈磊等[8]研究顯示在ConA誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中滇龍膽提取物能夠有效地抑制小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性，且組織病理指數(shù)評(píng)分也顯示其可減輕肝臟損傷.龍膽苦苷 (gentiopicroside，GPS)是滇龍膽主要有效成分.龍膽苦苷是一種裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有包括抗炎在內(nèi)的多種藥理作用.有研究表明可以預(yù)防IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)[9]，在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中發(fā)揮抗炎作用[10]，在肝損傷小鼠模型中龍膽苦苷處理可抑制血清TNF-α細(xì)胞因子分泌、增加肝轉(zhuǎn)氨酶水平從而緩解肝損傷[11].山田等[12]的研究中發(fā)現(xiàn)龍膽根中龍膽苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生沒有任何影響，而是龍膽內(nèi)酯提取成分抑制小鼠巨噬細(xì)胞中的TNF-α，iNOS和Cox-2 mRNA表達(dá)并阻斷NF-κB啟動(dòng)子活性.但王等人[13]發(fā)現(xiàn)龍膽苷在體外通過NF-κB信號(hào)通路阻止LPS /IFN-γ誘導(dǎo)小鼠原代巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、CXCL10、iNOS和CCL5，并在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠模型中抵抗敗血癥的發(fā)生發(fā)展.但是，滇龍膽和龍膽苦苷的潛在抗炎分子機(jī)制尚未得到充分研究.本實(shí)驗(yàn)借助THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞研究滇龍膽粗提物及其主要成分龍膽苦苷單體的抗炎作用.研究發(fā)現(xiàn)滇龍膽和龍膽苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的促炎因子有抑制作用，同時(shí)龍膽苦苷抑制IκBα蛋白降解和NF-κB p65、p-TBK1蛋白磷酸化，這些結(jié)果表明滇龍膽和龍膽苦苷在THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中有抗炎活性.本研究為天然產(chǎn)物抗炎藥的開發(fā)提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步了解滇龍膽對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控研究做出貢獻(xiàn).

1 材料與方法

1.1 天然藥物來源

滇龍膽提取物和龍膽苦苷單體由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院提供.滇龍膽提取物的制法：滇龍膽樣品粉碎后過50目篩，稱取1 kg樣品粉末，以料液比1∶10的比例加入95%乙醇，超聲提取30 min，過濾，取濾液；濾渣加入95%乙醇，超聲提取，重復(fù)提取兩次；將濾液合并，在45 ℃條件下減壓濃縮至干，得提取物.經(jīng)HPLC檢測(cè)，提取物中龍膽苦苷的含量為12.59%.龍膽苦苷單體純度為99%.

1.2 細(xì)胞株

人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞系購買于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái).

1.3 主要試劑

滇龍膽提取物用DMSO配置成500 mg/mL母液，并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成5 mg/mL藥物并分裝；龍膽苦苷單體用無菌去離子水配置成10 mg/mL母液，并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成1mg/mL藥物并分裝.佛波酯(PMA)購自Sigma公司，用DMSO配置成1 mg/mL母液分裝；LPS購自Sigma公司，用無菌去離子水配置成2.5 mg/mL母液，并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成10 μg/mL并分裝.以上試劑均-20 ℃保存.

MTT購自德國默克公司，胎牛血清購自美國英杰生命技術(shù)公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，熒光定量PCR引物購自擎科公司，STING、NF-κB p65、TBK1、p-TBK1一抗購自Cell Signaling Technology公司，p-NF-κB p65(Ser536)一抗購自Affinity公司，IkBa一抗購自萬類生物公司，β-actin一抗、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG二抗購自 Santa Cruz 公司，ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購自GE Healthcare公司.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10 %胎牛血清、50 μM β巰基乙醇和1%青-鏈霉素雙抗溶液)懸浮培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱.使用生長旺盛的懸浮THP-1細(xì)胞進(jìn)行巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，THP-1細(xì)胞接種6孔板(細(xì)胞密度1×106個(gè)/mL，每孔2 mL)，加入PMA(終濃度100 ng/mL)誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)48 h，棄上清，并用細(xì)胞PBS緩沖液沖洗3遍，加入新的1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入 LPS(終濃度100 ng/mL)刺激巨噬細(xì)胞向M1型分化，構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥模型，并加入不同藥物干預(yù).滇龍膽提取物空白對(duì)照組：PBS+DMSO；陽性對(duì)照組：LPS+DMSO.龍膽苦苷單體空白對(duì)照：PBS；陽性對(duì)照組：LPS.

1.5 MTT、CCK8法進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

將THP-1細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞密度7×105個(gè)/mL，每孔100 μL)，加入PMA(終濃度100 ng/mL)誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)48 h，棄上清，并用細(xì)胞PBS緩沖液沖洗3遍，加入新的1640培養(yǎng)基，加入 LPS(終濃度100 ng/mL)處理，同時(shí)加入不同濃度的滇龍膽提取物處理44 h ，每孔加入20 μL (5 mg/mL)的MTT，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，將96孔板取出，棄去液體并加入150 μL DMSO放置到搖床震蕩15 min，使甲瓚充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長的吸光度.CCK8法細(xì)胞鋪板同上，加入不同濃度的化合物處理44 h后，每孔加入20 μL CCK8試劑，并在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長的吸光度.滇龍膽提取物對(duì)照組：LPS+DMSO；龍膽苦苷單體對(duì)照組：LPS.

1.6 熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)

細(xì)胞鋪板同上細(xì)胞培養(yǎng)描述，加入LPS和不同濃度藥物刺激48 h，收取細(xì)胞RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，配置好擴(kuò)增體系后使用熒光定量PCR檢測(cè).引物信息如下(5’-3’)：TNF-α F-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG，R-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG；MCP-1 F-GAAACATCCAATTCTCAAACTG，R-AATGAAGGTGGCTGCTAT；IL-1β F-TCTCTTCAGCCAATCTTCA ，R-CCACTGTAATAAGCCATCATT；IL-6 F-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG，R-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG；TGF-β F-CAAGTTCAAGCAGAGTACA，R-TATCGCCAGGAATTGTTG；IL-10 F-TCCCAGGCAACCTGCCTAAC，R-AAATCGATGACAGCGCCGTAG；CCL22 F-GGATCGCCTACAGACTGCACTC，R-GAATCATCTTCACCCAGGGCACTC；STING F-AGCATTACAACAACCTGCTACG，R-GTTGGGGTCAGCCATACTCAG；IFN-α4 F-AAACCTAGAGGCCGAAGTTCAAGG，R-TCACAGCCCAGAGAACAGATG；IFN-β1 F-GCTTGGATTCCTACAAAGAAGCA，R-ATAGATGGTCAATGCGGCGTC；GAPDH F-GTCTTCACCACCATGGAGAAGGC，R-TTGTTGTCATGGATGACCTTGGCC.

1.7 Western blot檢測(cè)炎癥通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞鋪板同上細(xì)胞培養(yǎng)描述，加入LPS和不同濃度龍膽苦苷單體藥物作用1 h，收取細(xì)胞蛋白，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒確定蛋白濃度，并配制等濃度體系，金屬浴上90 ℃ 10 min進(jìn)行蛋白變性，通過10% SDS-PAGE電泳分離細(xì)胞裂解蛋白(15 μg)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，將PVDF膜用抗STING、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IkBa、TBK1、p-TBK1、β-actin IgG抗體(均為1∶1 000稀釋)標(biāo)記4 ℃孵育過夜，在Tris緩沖液清洗后將PVDF膜用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠或抗兔IgG抗體(均為1∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，洗膜后使用ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Tanon)識(shí)別條帶.龍膽苦苷單體空白對(duì)照：PBS；陽性對(duì)照組：LPS.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)均采用Graph pad 7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD) 表示，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)檢驗(yàn).P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.標(biāo)注中：*表示與LPS組相比*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001.

2 結(jié) 果

2.1 滇龍膽粗提物細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

經(jīng)LPS刺激的THP-1樣巨噬細(xì)胞加入不同濃度(10、50、100、200 μg/mL)的滇龍膽粗提物，體外培養(yǎng)48 h，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性.結(jié)果如圖1所示，各濃度藥物處理組與未加藥組相比，其光密度值(OD值)無明顯變化，表明0～200 μg/mL濃度滇龍膽粗提物對(duì)巨噬細(xì)胞無藥物毒性.

圖1 滇龍膽粗提物對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的藥物毒性作用Fig.1 Toxicity of crude extract of Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl. on M1 macrophages

2.2 滇龍膽粗提物對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎、抑炎因子mRNA表達(dá)的影響

前期MTT結(jié)果證實(shí)，在200 μg/mL范圍內(nèi)的滇龍膽提取物沒有明顯的細(xì)胞毒性，選擇了三個(gè)濃度(25、50、100 μg/mL)進(jìn)行接下來的試驗(yàn).向LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中加入不同濃度滇龍膽處理48 h，結(jié)果如圖2所示.與空白組相比，LPS刺激組TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著升高(P<0.001或0.000 1)(圖2a).然而，加入不同劑量的滇龍膽(25，50，100 μg/mL)后，TNF-α mRNA表達(dá)水平相比 LPS刺激組均顯著下降(P<0.001)；IL-6 mRNA表達(dá)水平也顯著下降(P<0.05)，IL-1β mRNA表達(dá)則在中、高劑量組(50，100 μg/mL)明顯下降(P<0.05)；MCP-1的mRNA表達(dá)水平未有明顯變化(圖2a).同時(shí)，我們也檢測(cè)了M2相關(guān)因子CCL22、IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖2b所示，加入滇龍膽組的CCL22、IL-10 mRNA表達(dá)沒有明顯變化，加入50 μg/mL的滇龍膽組的TGF-β mRNA表達(dá)水平相比 LPS刺激組下降(P<0.05).

(a) M1巨噬細(xì)胞促炎因子mRNA表達(dá)

(b) 巨噬細(xì)胞抑炎因子mRNA表達(dá)(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1)圖2 滇龍膽粗提物對(duì)M1巨噬細(xì)胞促炎、抑炎因子mRNA表達(dá)的調(diào)控作用Fig.2 The regulation of the crude extract of Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl. on the mRNA expression of pro-inflammatory

2.3 滇龍膽對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞一型干擾素mRNA的影響

LPS刺激巨噬細(xì)胞同時(shí)也會(huì)激活其干擾素通路，因此，檢測(cè)了一型干擾素的表達(dá)變化.結(jié)果如圖3所示，IFN-β1、IFN-α4的mRNA表達(dá)水平在LPS刺激下未有明顯變化，但滇龍膽提取物作用后IFN-β1表達(dá)下降(P<0.05或0.01)(圖3c)，而IFN-α4表達(dá)無明顯變化.STING 的mRNA表達(dá)水平在LPS刺激下未有明顯變化，但在中、高劑量(50，100 μg/mL)滇龍膽提取物作用下其表達(dá)下降(P<0.05或0.01).

(*P<0.05 ，**P<0.01)圖3 滇龍膽對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞的一型干擾素mRNA的影響Fig.3 Effect of Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl. on type I interferon mRNA of macrophages stimulated by LPS

2.4 龍膽苦苷的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

(*P<0.05 ； **P<0.01)圖4 龍膽苦苷對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的藥物毒性作用Fig.4 Toxic effects of gentiopicroside on M1 macrophages

前期數(shù)據(jù)表明滇龍膽粗提物具有抑制促炎因子產(chǎn)生的效果，而龍膽苦苷(GPS)是滇龍膽的主要活性成分，因此接下來我們?cè)贛1型巨噬細(xì)胞中研究了GPS的抗炎作用.

通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)龍膽苦苷藥物細(xì)胞毒性，經(jīng)LPS刺激的THP-1樣巨噬細(xì)胞加入不同濃度的龍膽苦苷，體外培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞活性.結(jié)果如圖4所示，各濃度(0.05、0.1、0.25、0.5、0.1、2.5、5、15、50 μg/mL)龍膽苦苷與未加藥組相比其OD值無明顯差異，表明0～50 μg/mL龍膽苦苷藥物對(duì)巨噬細(xì)胞模型無藥物毒性.

2.5 龍膽苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

接下來檢測(cè)不同濃度龍膽苦苷對(duì)促炎細(xì)胞因子的作用，結(jié)果如圖5a所示，與單獨(dú)LPS刺激組相比，加入不同劑量龍膽苦苷(2.5，25 μg/mL)24h后，促炎因子TNF-α的mRNA表達(dá)水平有所下降(P<0.05)；IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯降低，高劑量組(25 μg/mL)下降非常顯著(P<0.001)；CCL2的mRNA表達(dá)無明顯變化.同時(shí)我們也檢測(cè)了龍膽苦苷對(duì)一型干擾素的表達(dá)變化，但加入龍膽苦苷作用后IFN-β1、IFN-α4的mRNA表達(dá)水平未見明顯變化(圖5b).

(a) 巨噬細(xì)胞促炎因子mRNA表達(dá)

(b) 巨噬細(xì)胞一型干擾素mRNA表達(dá)(*P<0.05 ，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1)圖5 龍膽苦苷對(duì)M1巨噬細(xì)胞促炎因子、一型干擾素mRNA表達(dá)的調(diào)控作用Fig.5 Regulatory effect of gentiopicroside on the expression of cytokine mRNA in M1 macrophages

2.6 龍膽苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路的調(diào)控作用

采用Western blot檢測(cè)龍膽苦苷對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路蛋白的影響.LPS與龍膽苦苷(2.5 μg/mL)藥物同時(shí)作用巨噬細(xì)胞，處理1 h，采用Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果如圖6所示.與PBS空白對(duì)照組相比，單獨(dú)LPS刺激組的IκBα、NF-κB p65的表達(dá)量明顯下降，而龍膽苦苷處理組的IκBα、NF-κB p65的表達(dá)相比LPS刺激組有所回升；龍膽苦苷處理組的磷酸化NF-κB p65的表達(dá)相比LPS刺激組明顯降低(圖6a).

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激后巨噬細(xì)胞STING的蛋白表達(dá)無明顯變化，但是TBK1的表達(dá)明顯下降，而p-TBK1的表達(dá)明顯增加.而與LPS刺激組相比，加入龍膽苦苷(2.5 μg/mL)增加了TBK1的蛋白量，降低了p-TBK1的表達(dá)量，p-TBK1/TBK1比例降低.

(a) NF-κB炎癥通路蛋白表達(dá) (b) STING通路蛋白表達(dá)圖6 龍膽苦苷對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞的炎癥通路蛋白表達(dá)的調(diào)控Fig.6 Regulation of gentiopicroside on the expression of inflammatory pathway proteins stimulated by LPS in macrophages

3 討 論

巨噬細(xì)胞被招募到炎癥部位后，免疫微環(huán)境中源自病原體、受傷組織或適應(yīng)性免疫的激活信號(hào)會(huì)在巨噬細(xì)胞分化中引發(fā)不同的遺傳程序，從而誘導(dǎo)不同的極化狀態(tài)，M1和M2代表在體外激活為促炎或抗炎的巨噬細(xì)胞.M1極化的巨噬細(xì)胞是損傷后引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，而切換到M2表型對(duì)于消退炎癥和損傷組織的再生至關(guān)重要.M1-M2平衡失調(diào)通常與炎癥性疾病有關(guān)，因此調(diào)控巨噬細(xì)胞亞群極化是抗炎藥物的潛在靶標(biāo).在體外實(shí)驗(yàn)中，M1的刺激效應(yīng)物能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞大量分泌促進(jìn)炎癥產(chǎn)生的細(xì)胞因子，因此在藥物抗炎活性研究工作中首先觀察藥物是否能改變巨噬細(xì)胞中以上幾種細(xì)胞因子的分泌，這樣可以反映出藥物對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化的影響.同時(shí)，在炎癥消退階段，巨噬細(xì)胞啟動(dòng)M1到M2表型轉(zhuǎn)換，逐漸獲得抗炎表型，包括下調(diào)炎癥介質(zhì)、增加抗炎細(xì)胞因子(例如TGF-β和IL10)的產(chǎn)生等.因此，在實(shí)驗(yàn)中我們也關(guān)注了M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物TGF-β、IL-10和CCL22的變化.

我們初步確定了滇龍膽提取物及龍膽苦苷單體的抗炎效果.在M1型巨噬細(xì)胞模型中，滇龍膽粗提物、龍膽苦苷可抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)，表明減弱炎癥性M1巨噬細(xì)胞的極化.這與Mubashir等人在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的研究結(jié)果一致[14]，龍膽提取物以劑量依賴性方式抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6兩種細(xì)胞因子.巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控不僅取決于關(guān)閉炎癥信號(hào)的產(chǎn)生，而且還取決于增加抗炎介質(zhì)的產(chǎn)生[15].因此我們還檢測(cè)了M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，結(jié)果顯示，滇龍膽粗提物并未增加M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CCL22、IL-10的表達(dá)，提示滇龍膽的抗炎作用主要通過抑制M1巨噬細(xì)胞的炎癥，而不是通過增強(qiáng)M2型相關(guān)抗炎介質(zhì)來引發(fā)抑炎作用.Yang等人[16]在小鼠接觸性皮炎的治療中發(fā)現(xiàn)龍膽根提取物對(duì)包括MCP-1的細(xì)胞因子有抑制作用，但我們的研究中滇龍膽提取物對(duì)巨噬細(xì)胞MCP-1的mRNA表達(dá)無明顯調(diào)控作用，可能與龍膽不同提取方式和研究模型差異有關(guān).

NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是LPS活化巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生中的重要信號(hào)通路.用龍膽苦苷處理可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα蛋白降解和NF-κB p65的磷酸化，這表明龍膽苦苷抑制NF-κB信號(hào)通路活化.Zhang等人[17]的研究也顯示龍膽苦苷能調(diào)控p65蛋白表達(dá)，與我們結(jié)果一致.同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷處理可部分抑制LPS誘導(dǎo)的TBK1的磷酸化.在LPS誘導(dǎo)的干擾素產(chǎn)生中，滇龍膽抑制了STING和一型干擾素IFN-β1的表達(dá)，但是龍膽苦苷未有相同作用，提示滇龍膽對(duì)干擾素的調(diào)控作用不是其中的龍膽苦苷起作用，而是其他成分，有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)滇龍膽和龍膽苦苷進(jìn)行抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)有明顯抑制作用，提示其具有較好抗炎活性.進(jìn)一步結(jié)果顯示，龍膽苦苷可抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα蛋白降解和NF-κB p65、TBK1的磷酸化,其可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用.