野化白云黃茶悶黃過程中的品質(zhì)成分變化及其菌種分離鑒定

劉展良，吳曉蓉，黃溢鋸，黃錫朋，黃雪雅，伍錫岳，林月春，陳玲，周巧儀

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學院餐旅學院，茶葉研究所，廣東廣州 510430）（2.臺山市四九鎮(zhèn)瓶山野化白云茶場，廣東臺山 529200）（3.廣東省微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，廣東廣州 510070）（4.廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，廣東廣州 510640）

廣東省作為我國第一大茶葉消費省、第一大茶葉流通省，同時粵東西北均有野生樹種質(zhì)資源，其中白云茶是廣東臺山新會一帶野生群體種[1]。廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所于1985 年完成兩地的茶樹資料調(diào)查[2]，周順祥[3]對臺山白云茶等5 個品種形態(tài)特征差異分析發(fā)現(xiàn)云南鳳慶種和臺山白云茶最相似。當?shù)孛癖姴烧吧自撇枞~加工利用超過300 年歷史。在上世紀50、60 年代國有林場茶場從高海拔山上移植到海拔300 m 的茶園，從此白云茶開始被人工種植利用。近年當?shù)夭枞~企業(yè)為對白云茶樹進行無性扦插繁殖取得成功，將其種植在海拔300～500 m 臨崖山海岸幾十公里荒山叢林中，讓茶樹回歸生態(tài)自然環(huán)境生長，這種茶樹為野化白云茶樹。

黃茶屬中國特有茶類，與綠茶加工比較，其特殊性在揉捻工序后加入悶黃工藝形成了“黃湯黃葉”的品質(zhì)特征。因而黃茶融合了綠茶和黑茶的品質(zhì)特征，香氣清悅、味厚爽口，及其對胃腸道、消化道疾病有一定的保健護理作用，因而受到消費者的喜愛。國內(nèi)外喜愛及研究綠茶和紅茶的人群占絕大部分，而黃茶在六大茶類中聲名不顯，加工等研究內(nèi)容較少，為了發(fā)展黃茶，增加對黃茶的研究非常有必要。

將廣東特有的野化白云茶葉經(jīng)過萎凋→殺青→揉捻→再炒（除去部分水分）→悶黃→干燥工藝過程開發(fā)出黃茶，并對悶黃過程微生物生長和品質(zhì)成分變化進行研究，旨在揭示野化白云黃茶品質(zhì)形成機制和主要成分的變化，推動野化白云黃茶產(chǎn)品標準化生產(chǎn)，形成量產(chǎn)。在國家實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的背景下，開展利用對當?shù)靥赜蟹N質(zhì)資源創(chuàng)新發(fā)展適銷、有市場潛力的茶葉產(chǎn)品積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料于2020年4月中旬采自廣東省江門市臺山市四九鎮(zhèn)白云野化茶場無性扦插野化白云茶樹，采摘標準為1 芽2、3 葉。黃茶于2020 年4 月在臺山市四九鎮(zhèn)白云野化茶場加工廠進行。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技儀器有限公司；AE 200 型分析天平，上海梅特勒-托利多公司；752N 型紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；Agilent 1200 系列安捷倫高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2.2 主要試劑

福林酚（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；兒茶素類標準品：兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）8 種兒茶素單體，咖啡堿茶氨酸標準品均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣流程

鮮葉采回來后，按照以下加工工藝流程進行取樣：

采摘鮮葉（樣號1）→攤青（萎凋）→殺青（2）→揉捻（3）→再炒（滾炒除水）（4）→悶黃24 h（5）→悶黃48 h（6）→悶黃72 h（7）→干燥（滾炒）（8）

以上各過程分別取樣1200.0 g，其中600.0 g 茶樣立即在恒溫烘箱110 ℃烘干，其中，3 號樣直接烘干作為烘青綠茶，4 號樣后烘干作為半炒半烘綠茶，8號樣為黃茶；另600.0 g 茶樣裝入無菌袋密封置冰箱冷藏，收集1～8 號茶樣后進行微生物分析。

1.3.2 相關理化指標測定

茶多酚測定按GB/T 8313-2018 方法，游離氨基酸含量測定按GB/T 8314-2013 方法，可溶性糖含量測定參照GB 5009.8-2016 第二法進行。

咖啡堿及兒茶素的測定：采用HPLC 檢測法，色譜柱：ZORBAX Elipse XDB-C18 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：A 相為乙酸:乙腈:甲醇:水=0.5:1:2:96.5（V:V:V:V）；B 相為乙酸:乙腈:甲醇:水=0.5:10:20:69.5（V:V:V:V）；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；紫外檢測波長為280 nm。梯度洗脫程序如下：0 min～30 min，27.5% B～80% B；30 min～35 min，80% B～7.5%B；35 min～0 min，27.5% B。

1.3.3 微生物分析

1.3.3.1 樣品

根據(jù)GB 4789.1-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》中樣品的采集規(guī)則進行采樣。依照1.3.1 采集黃茶悶黃過程中不同時間段（悶黃堆表面、堆下1/4 處、堆中心、堆下3/4 處、堆底）8 份冷藏樣品，每份不少于500 g。

1.3.3.2 主要試劑和儀器

微生物培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)，真菌基因組提取試劑盒購自美國Omega公司，PCR擴增試劑購自廣州東盛生物科技有限公司，PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成。

滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、PCR儀、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、生物安全柜。

1.3.3.3 微生物計數(shù)和分離純化

菌落總數(shù)參照GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》、霉菌和酵母計數(shù)參照 GB 4789.15-2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》。用接種針挑取優(yōu)勢真菌純化到CYA 固體培養(yǎng)基上分離純化，獲得純種菌株。

1.3.3.4 菌種鑒定

（1）1傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定

將菌株三點接種于CYA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落特征并記錄，利用光學顯微鏡進行顯微形態(tài)觀察。

（2）2基于ITS rDNA 序列分析的系統(tǒng)發(fā)育方法

采用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株的DNA，具體步驟參照試劑盒說明書。利用引物ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）和ITS4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）擴增ITS rDNA 序列；PCR 擴增條件：94 ℃預變性，5 min；94 ℃變性，40 s；56 ℃退火，45 s；72 ℃延伸，45 s；共進行30 循環(huán)；最后72 ℃終延伸，5 min。擴增產(chǎn)物交付北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進行測序分析。最后將所得測序結(jié)果提交到GENBANK（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行比對，分析其與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性。在采用MEGA 7.0 進行Neighbor-Joining 法聚類系統(tǒng)發(fā)育及分子進化分析1000 次重復自檢分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行處理，用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。運用多重比較LSD 法對不同處理進行顯著性分析，顯著性水平選擇0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃茶與綠茶的茶多酚含量、兒茶素各組分及總含量比較

野化白云黃茶與同樣原料加工的烘青綠茶、半炒半烘綠茶的茶多酚含量、兒茶素各組分及總含量分析結(jié)果列于表1。

從表1 可知，野化白云黃茶與烘青、半烘炒綠茶的茶多酚含量比較下降了4.08%、7.18%與周繼榮等[4-5]研究鹿苑黃茶加工時悶堆19.5 h 后，與鮮葉樣相比，茶多酚含量下降1.53%（下降率6.14%）的結(jié)果一致。兒茶素總含量下降21.70 mg/g、18.48 mg/g與董占波等[6]研究平陽黃湯兒茶素總量為的10.69%與平陽早香茶11.50%比較下降的結(jié)果一致。酯型兒茶素總量下降21.62 mg/g、19.08 mg/g，EGCG 下降9.99 mg/g、6.98 mg/g，GCG 下降14.23 mg/g、13.80 mg/g，都差異性顯著，p＜0.05。非酯型兒茶素，EGC 和EC 基本保持不變，GC 增加2.41 mg/g、2.56 mg/g，C 減小2.49 mg/g、1.75 mg/g，都有顯著性差異，p＜0.05；這樣非酯型兒茶素各組分中既有增加的又有減小的，其總量變化差異性不顯著，p＞0.05；與龔永新等[7]進行鹿苑黃茶加工12 h悶黃與不悶黃處理的比較研究得到黃茶中酯型兒茶素（EGCG）含量大大降低，比綠茶少13.27 mg/g，而非酯型兒茶素EC 的含量卻明顯高于綠茶的結(jié)果一致。

表1 黃茶與烘青綠茶、半炒半烘綠茶的茶多酚含量、兒茶素各組分及總含量Table 1 Contents of tea polyphenols,catechins and total catechin fraction in yellow tea,roasted green tea and semi-roasted green tea

2.2 黃茶與綠茶的水浸出物、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖含量比較

野化白云黃茶與同樣原料加工的烘青綠茶、半炒半烘綠的游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖含量分析結(jié)果列于表2。從表2 可知，與兩款綠茶比較，黃茶的水浸出物分別高出4.80%、7.11%差異性顯著，p＜0.05，黃茶內(nèi)含可溶性物質(zhì)更加豐富；氨基酸、咖啡堿含量黃茶略有下降，差異不顯著（p＞0.05）；黃茶可溶性糖含量發(fā)別高出0.41%、0.36%。劉曉慧[8]利用泰山小津口茶園黃山群體品種的春季1 芽1 葉鮮葉為原料加工成黃茶、綠茶比較，兩者品質(zhì)成分水浸出物含量分別為43.92%、42.38%，黃茶高出1.54%；可溶性糖含量分別為4.88%、4.70%，黃茶高出0.18%，與本研究結(jié)果一致。

表2 黃茶與綠茶的游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖含量分析結(jié)果Table 2 Analysis results of free amino acids,caffeine and soluble sugar in yellow tea and green tea

2.3 黃茶悶黃過程中微生物變化及分離鑒定

2.3.1 黃茶悶黃過程中微生物數(shù)量

黃茶加工過程中微生物類群及數(shù)量變化如表3 所示，茶青進行萎凋時從環(huán)境感染微生物，經(jīng)殺青后，真菌被殺死，只少量細菌仍然存在，悶黃過程微生物又開始繁殖。從微生物總數(shù)變化分析，從再炒葉即是悶黃開始至24 h，酵母菌數(shù)量明顯，到了48 h 細菌和霉菌也增至二次方數(shù)量級，至72 h 霉菌成優(yōu)勢菌種（3.5×105CFU/g），酵母菌、細菌呈下降趨勢。干燥后的毛茶（8 號樣），細菌和酵母菌已檢測不到，可檢測10 CFU/g 霉菌存在。

表3 野化白云黃茶加工過程微生物生長變化Table 3 Microorganism growth during processing of weedness Baiyun yellow tea

2.3.2 黃茶悶黃過程中微生物分離鑒定

從工序4 開始茶樣中共分離出8 株微生物，包括1 株擬盤多毛孢屬，4 株青霉屬，1 株枝孢屬及2 株酵母菌，菌株的形態(tài)學描述見表4，從GenBank 中選取與菌株較近的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。根據(jù)菌株的形態(tài)學特征與國內(nèi)外文獻進行對比，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析方法，將8 株分離株鑒定到種水平，從4 號樣分離出1 株擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis diploclisiae，5號分離到漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），6 號分離出1 株漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和1 株青霉屬Penicillium exsudans，7 號樣分離得到1 株短密青霉（Penicillium brevicompactum）和1 株青霉屬Penicillium exsudans，8 號樣分離出1株短密青霉（Penicillium brevicompactum）和1 株極細枝孢（Cladosporium tenuissimum）。

圖1 基于ITS 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS sequence construction

表4 黃茶悶黃過程中真菌鑒定結(jié)果Table 4 Results of identification of fungi in the yellowing process of tea

3 討論

3.1 野化白云黃茶與綠茶的茶多酚含量、兒茶素各組分及總含量比較

結(jié)合本文2.3（黃茶悶黃過程中微生物變化及分離鑒定）的實驗結(jié)果，悶黃過程中存在微生物生長繁殖，在濕熱和微生物繁殖的條件下，使茶葉中酯型兒茶素EGCG、ECG 等含量減少，轉(zhuǎn)化為GC、EC 等非酯型兒茶素，多酚物質(zhì)被微生物利用和被氧化而減少。

3.2 野化白云黃茶與綠茶的水浸物、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖含量比較

劉曉等[9]對蒙頂黃茶不同悶黃時間的跟蹤，發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和纖維素酶活性隨悶黃進程出現(xiàn)了動態(tài)變化。4 種酶在殺青之后活性大幅下降，酶活基本喪失，但在悶黃1 h 酶活性又得到一定的回升。其中，多酚氧化酶、過氧化氫酶、纖維素酶活性在悶黃6 h 達到最大，與悶黃1 h 的酶活性相比，增加了7.79 倍、14.15 倍、1.57 倍。過氧化物酶活性在悶黃過程中呈先增加后減少的趨勢，在悶黃2 h 達到峰值，相較于悶黃1 h 增加了2.38 倍，在悶黃6 h 時，該酶活性降至最低，與悶黃2 h 呈顯著差異。

野化白云黃茶加工過程與蒙頂黃茶加工工藝基本相同，因此野化白云黃茶水浸出物、可溶性糖含量與同種原料加工的兩款綠茶比較增加明顯，說明悶黃過程中在濕熱、微生繁殖以及微生物分泌胞外多酚氧化酶、纖維素酶等[10]酶促氧化和水解反應多重因素作用下，黃茶水溶性物質(zhì)增加。

3.3 野化白云黃茶悶黃過程中微生物變化和菌種鑒定

從4 號樣開始到10 號，五階段中共分離出8 株微生物。4 號樣中分離得到Pestalotiopsis diploclisiae（無中文名）屬擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis），是黑盤孢科（Amphisphaeriaceae）中的無性形真菌，其分生孢子具附屬絲。該真菌類群在熱帶和亞熱帶生態(tài)系統(tǒng)中。從5 號樣到8 號樣中沒有再分離出這類真菌。因此認為這類真菌是從茶葉生長環(huán)境中帶來的。但類擬盤多毛孢真菌作為內(nèi)生真菌的重要類群，能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，如具有抗癌、抗HIV等活性的物質(zhì)[11-12]，說明在悶黃開始階段茶樣中分離Pestalotiopsis diploclisiae菌株，該菌不會給黃茶質(zhì)量安全帶來風險。同時在茶葉加工過程分離Pestalotiopsis diploclisiae菌株中未見文獻報道。

5、6 號樣分離得到漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）是一種耐鹽的酵母，并且能在低溫生長。它作為發(fā)酵劑中的重要成分在食品，特別是肉制品中廣泛應用。該種酵母菌具有QPS 身份，具有食品安全性。文杰宇[13]從茯磚茶中分離出優(yōu)勢酵母漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），并將培養(yǎng)漢遜德巴利酵母接種到察氏液體培養(yǎng)基中進行28 ℃、4～7 d 培養(yǎng)粗提酶可降解纖維素，說明漢遜德巴利酵母菌能分泌胞外纖維素酶。因而黃茶悶黃過程中有漢遜德巴利酵母繁衍和分泌胞外纖維素酶，可導致茶葉中的纖維素等物質(zhì)的水解，提高黃茶水浸出物含量。

6、7 號樣中分離出1 株漢遜德巴利酵母、3 株青霉屬Penicillium exsudans和1 株短密青霉（Penicillium brevicompactum）。人類利用青霉生產(chǎn)抗生素已多年，除此青霉還產(chǎn)生檸檬酸、葡萄糖酸等有機酸，纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、核酸酶等代謝產(chǎn)物[9-10]。Penicillium exsudans首次在茶葉中被分離鑒定出來。短密青霉（Penicillium brevicompactum）次級代謝分泌產(chǎn)生的一種抗生素，它具有抗真菌、抗腫瘤和免疫抑制的作用。青霉菌在黃茶悶黃過程中逐步成為優(yōu)勢菌種，依據(jù)前人的研究結(jié)論[9-10]可以認為青霉菌代謝產(chǎn)生有機酸和纖維素酶、蛋白酶等胞外酶，酶促反應使茶葉的更多物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可溶性成分，這與2.1、2.2 結(jié)果一致。

8 號樣中分離出來1 株短密青霉（Penicillium brevicompactum）和1 株極細枝孢霉（Cladosporium tenuissimum）。周紅杰等[14]在黑茶類普洱茶中分離1株枝孢霉。傅冬和等[15]篩選出極細枝孢霉發(fā)酵獲得多酚氧化酶可以較高收率地體外合成茶黃素粗提物，因此說明該菌能分泌多酚氧化酶。從黃茶中分離能得到極細枝孢霉，說明黃茶是綠茶與黑茶加工藝一定程度結(jié)合的產(chǎn)品，同時黃茶長期貯存可能存在微生物分泌胞外多酚氧化酶促使多酚氧化的現(xiàn)象。

以上說明野化白茶黃茶加工過程，尤其在悶黃階段微生物生長種類和數(shù)量來看，與國內(nèi)對黃茶加工微生物的影響研究結(jié)果比較，細菌、霉菌、酵母菌生長變化趨勢一致。國內(nèi)學者研究黃茶加工過程中分析了多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和纖維素酶活性變化，鮮葉中酶活性高，殺青后失活，隨悶黃進程出現(xiàn)了微生物種類和數(shù)量的增加同時這些酶的活性逐步增強[9]。這些微生物的生長繁殖及其分泌胞外酶深刻影響黃茶的品質(zhì)成分的變化。

從野化白云黃茶悶黃過程各工序取樣進行可培養(yǎng)微生物分析和產(chǎn)品對照綠茶品質(zhì)成分分析，說明過程中既有濕熱作用又有微生物的作用。同時也提示微生物分泌的胞外酶的種類和活性變化等問題需進行一步深入研究。

4 結(jié)論

4.1 野化白云黃茶與烘青綠、半烘半炒綠茶比較，茶多酚總量、兒茶素總量、酯型兒茶素類總量均呈下降趨勢，EGCG 下降9.99 mg/g、6.98 mg/g，GCG 下降14.23 mg/g、13.80 mg/g，都是差異性顯著，p＜0.05。非酯型兒茶素組分EGC 和EC 基本保持不變，GC 增加2.41 mg/g、2.56 mg/g，C 減小2.49 mg/g、1.75 mg/g，都有顯著性差異，p＜0.05；非酯型兒茶素總量因各組分既增加的又有減小的，總量的變化差異性不顯著，p＞0.05。

4.2 野化白云黃茶與兩款綠茶比較，水浸出物分別高出4.80%、7.11%，差異顯著（p＜0.05），悶黃使野化白云黃茶內(nèi)含可溶性物質(zhì)更加豐富；氨基酸、咖啡堿含量黃茶略有下降，差異不顯著（p＞0.05）；黃茶可溶性糖含量分別高出0.41%、0.36%，差異顯著（p＜0.05）。

4.3 野化白云黃茶加工可培養(yǎng)微生物分析表明，殺青和炒制可以殺死真菌和部分細菌，悶黃24 h 細菌和酵母生長，48 h 酵母菌為優(yōu)勢菌種、72 h 霉菌則為優(yōu)勢菌種；在悶黃過程及干燥4 個階段取的茶樣中共分離鑒定出8 株微生物，包括1 株擬盤多毛孢屬，4 株青霉屬，1 株枝孢霉及2 株酵母屬，其中擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis diploclisiae、青霉屬Penicillium exsudans首次從茶葉加工中和茶葉中分離并鑒定。結(jié)合前人[8,9]研究結(jié)果，認為微生物繁殖和分泌分胞外酶如多酚氧化酶、纖維素酶、果膠酶促使茶多酚氧化、酯型兒茶素水解，可溶性物質(zhì)增加。悶黃過程的微生物繁殖影響黃茶品質(zhì)的形成。