針康法對腦缺血小鼠神經(jīng)功能及叉頭轉錄因子3和維甲酸相關孤兒受體γt表達的影響

楊赫，唐強，朱路文

1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱市 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

缺血性腦卒中是一種可導致運動、感覺、視覺和認知障礙甚至死亡的腦血管病[1]。在臨床實踐中，各種療法已被用于腦卒中后康復，如藥物治療、針灸、運動訓練和外科手術[2-3]。溶栓療法是腦卒中后最有效的首選治療方法[4]。

腦卒中的治療藥物包括組織型纖溶酶原激活劑、依達拉奉、尼莫地平、氯吡格雷、阿司匹林和雙嘧達莫等，這些藥物由于禁忌證、嚴重的副作用和狹窄的治療窗導致患者依從性低，影響生活質(zhì)量[5]。目前，康復治療是治療腦卒中后神經(jīng)功能缺損的最佳方法[3,6]。除康復治療外，針灸在臨床上也頗受歡迎。腦卒中治療的最終目標是恢復患者的行為功能[7]，針刺治療的腦卒中患者表現(xiàn)出比常規(guī)治療更多的行為功能和結構完整性的改善[8]。

針康法是腦梗死和神經(jīng)功能缺損康復的新策略，即遴選頭穴刺激區(qū)留針同期運用康復手法專項治療，體現(xiàn)“針康同步、動態(tài)治療、整體康復”的診療思路[9]。前期臨床研究[10]和其他報告[11-12]結果表明，針康法是治療缺血性腦卒中后功能重塑和行為改善安全有效的治療方法[13]。針康法減輕腦缺血的機制可能與炎癥細胞和炎癥通路有關[14-15]。糾正輔助性T 細胞17(T helper cell 17,Th17)/調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells,Tregs)失衡的方法可能是改善缺血性卒中致病的關鍵因素[16]。Gelderblom 等[17]發(fā)現(xiàn)封閉白細胞介素17 (interleukin 17,IL-17)的功能后，腦梗死面積縮小，可以起到腦保護作用。而維甲酸相關孤兒受體γt (retinoic acid-related orphan receptor γt,RORγt)能直接激活編碼IL-17A 和IL-17F[18]。根據(jù)缺血模型和研究目標選用改良神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)，優(yōu)點是容易操作，可簡單快速地綜合評估缺血損傷整體程度。相較于轉棒測試、脫膠測試、曠場試驗，它敏感性高、測試窗口寬，適合長期觀察[19]。

本研究探討針康法能促進缺血性腦卒中小鼠缺血側皮質(zhì)Th17/Treg平衡及改善神經(jīng)功能的假說。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雌性SPF 級C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(22.0±3.2)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，許可證號SCXK(遼)2015-0001。適應性飼養(yǎng)3 d，實驗前篩選適應跑臺訓練，一般狀況正常小鼠納入研究。實驗過程中給予動物充足的食物和飲水。室溫(22±2)℃，相對濕度45%～65%，每4 min換氣1次，采用12 h/12 h 光照/黑夜循環(huán)照明系統(tǒng)。對實驗小鼠處理遵循2006年國科委《關于善待實驗動物的指導性意見》執(zhí)行。隨機化編碼將45 只小鼠分為假手術組、模型組、針刺組、康復組、針康組，每組9 只。在造模術后3 d、7 d、14 d三個時間點每次抓取3只。

所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.2 主要儀器和試劑

ZH-PT 型動物實驗跑臺：安徽正華生物儀器設備有限公司。潔凈工作臺：蘇州安泰技術有限公司。TS-1000 脫色搖床數(shù)顯定時：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。TGL16E 臺式高速冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司。Western blotting 系統(tǒng)、Chemi-Doc MP 凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD 公司。一次性使用無菌皮內(nèi)針：蘇州針灸用品有限公司。兔抗叉頭轉錄因子3(transcription factor Forkhead box P3,Foxp3)(ab75763)：艾博抗上海貿(mào)易有限公司。兔抗ROR Gamma T、兔抗β-actin：北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 模型建立

參照Longa的方法[20]加以改良。術前1 d禁食不禁水，4%水合氯醛0.01 ml/g 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于改良手術臺上，頸前部剃毛消毒。鈍性分離皮下肌肉、腺泡，顯微鏡下找到右側頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，顯微血管夾夾閉頸總動脈的近心端，頸總動脈下方備線系活結，6-0 號縫合線于頸內(nèi)動脈的遠心端打一松結，用線阻閉頸外動脈血流。在頸總動脈和頸內(nèi)動脈兩線結間刺一小口，方向朝頸內(nèi)動脈頭端，將已備好線栓緩慢推入，有輕微阻力停止。線栓插入深度約0.8 cm，固定好線栓，線結系死。拉緊頸總動脈打方結，松開顯微止血夾，縫合皮膚，術區(qū)消毒，單籠保溫飼養(yǎng)。假手術組操作不插線栓，術后24 h即進行Longa評分，1～3分可入組。

1.4 干預方法

假手術組和模型組剝奪治療，只給予同等條件抓取。

針刺組：術后1 d，參考華興邦等[21]研制的《大鼠針灸穴位圖譜》及于氏頭穴叢刺針法[22]取穴。用皮筋及醫(yī)用膠帶將模型小鼠固定在手術臺上，從前頂至百會方向定位在百會穴及左右各旁開2 mm 處，直徑0.22 mm、長5 mm 撳針叢刺4～5 mm，快速提插1 min后留針1 h，之后每天1 次，以3 d、7 d、14 d 為觀察時間節(jié)點。

康復組：術后1 d，施以電動跑臺訓練治療。坡度0°；術后第1～3 天10 m/min，第4～14 天15 m/min；每次30 min，每天1次。以3 d、7 d、14 d為觀察時間節(jié)點。

針康組：術后1 d，針康組進行針康法治療。用皮筋及醫(yī)用膠帶將模型小鼠固定在手術臺上，頭穴叢刺取穴方法參考針刺組。在小鼠頭穴叢刺留針過程中同步接受電動跑臺訓練，每天1 次。跑臺訓練同康復組設計標準。

1.5 神經(jīng)功能評定

分別于治療后3 d、7 d、14 d 進行采用mNSS[23]進行評價。分值越高神經(jīng)功能缺損程度越重，取兩次均值。

1.6 Western blotting

術后3 d、7 d、14 d三個時間點每組分別取3只小鼠，腹腔注射戊巴比妥50 mg/kg 麻醉。斷頭，離體立刻冰凍5 min 后，-80 ℃保存。割取腦組織冠狀位前囟前后各2 mm 放冰盒上稱取右側腦組織質(zhì)量，液氮研磨，稱重約70 mg 勻漿。將這些冷凍組織粉轉移到含有RAPI 裂解緩沖液(P0013D，上海Beyotime 公司)的1.5 ml 離心管中冰上裂解，勻漿在4 ℃下12 000 g離心5 min，收集上清液作為總蛋白，整個過程30 min 內(nèi)完成。蛋白定量根據(jù)考馬斯亮藍法用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(P0006，上海Beyotime 公司)對蛋白質(zhì)樣品進行定量，根據(jù)標準孔蛋白濃度和吸光度計算標準曲線。12%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，轉移到聚偏氟乙烯膜上。然后用酶促反應發(fā)光法直接顯色，脫脂牛奶(5%)封閉膜，并在4 ℃下與以下一抗孵育過夜：兔多克隆抗Foxp3 (1∶500)，兔多克隆抗Roγt (1∶500)。洗滌3 次后，用辣根過氧化物酶標記的二抗37 ℃下偶聯(lián)1 h，以β-actin 為內(nèi)對照。用ECL試劑盒顯影免疫條帶。

采用Image Lab 軟件5.2.1 版本對每個條帶的密度進行量化。蛋白表達量=目的條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。選中一個條帶作為對照“1”，選擇定量工具比較其余條帶，每個泳道的定量結果就會顯示出來。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均采用()表示，組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)及Tukey 多重比較檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS

術后各時間點，假手術組mNSS 為0 分，模型組mNSS均高于假手術組(P＜0.05)。術后3 d，與模型組比較，康復組、針康組mNSS 降低(P＜0.05)。術后7 d，與假手術組比較，針刺組mNSS 升高(P＜0.05)。術后14 d，與模型組和針刺組比較，針康組mNSS 降低(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組造模后mNSS

2.2 Western blotting

2.2.1 腦組織Foxp3表達

術后3 d，與假手術組、模型組比較，針康組Foxp3 表達量降低(P ＜0.05)。術后7 d，與其他組比較，針康組Foxp3 表達量均降低(P ＜0.05)。術后14 d，與假手術組、模型組比較，針康組Foxp3 表達量降低(P ＜0.05)。見表2、圖1。

表2 各組腦Foxp3表達

圖1 術后各時間點各組腦組織Foxp3的蛋白表達(Western blotting)

2.2.2 腦組織RORγt表達

術后3 d，與其他組比較，針康組RORγt 表達量增加(P ＜0.05)。術后7 d，與針刺組、假手術組比較，針康組RORγt表達量均增加(P ＜0.05)。術后14 d，與假手術組比較，模型組、針刺組、針康組RORγt表達量均降低(P ＜0.05)；與模型組、針刺組比較，康復組RORγt表達量升高(P ＜0.05)；與康復組比較，針康組RORγt表達量降低(P ＜0.05)。見表3、圖2。

圖2 術后各時間點各組腦組織RORγt的蛋白表達(Western blotting)

表3 各組小鼠腦RORγt表達

3 討論

本研究顯示，對Th17 細胞形成起著關鍵作用的RORγt，經(jīng)過康復訓練和針康法治療7 d 后明顯升高，同時，F(xiàn)oxp3 含量明顯降低。本研究還顯示，針康組可降低腦缺血損傷后3 d、7 d、14 d的mNSS。

腦缺血后腦組織激活適應性免疫并參與卒中慢性期神經(jīng)修復減輕腦水腫。給予針刺、康復治療后Foxp3 表達明顯受到抑制、RORγt 表達明顯增強。且針康組治療后Foxp3 水平低于單純針刺或康復訓練，7 d 時效果最顯著；針康組RORγt 水平明顯高于單純針刺或康復訓練，3 d、7 d 效果最顯著，14 d 時，針康組RORγt 表達減少。關于病灶側Foxp3、RORγt 蛋白改變的機制如下。①Foxp3、RORγt 蛋白的驅(qū)動因素尚不明確，IL-6、STAT 3 和TGF-β 信號通路可共同促進RORγt 的表達[24]。針康法能同時激活IL-6、IL-10促進免疫細胞集聚[25]，促進Tregs 中RORγt 的表達，誘導Foxp 3分化[26]。②Tregs通過淋巴細胞功能相關抗原-1/細胞間黏附分子-1 (lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-1/intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)途徑增加血小板與缺血腦內(nèi)皮細胞的黏附性，導致腦缺血后微血管功能障礙[27]。針康法可改善缺血后血管內(nèi)皮損傷，促進血管再生[28]。③星形膠質(zhì)細胞活化異常觸發(fā)T 細胞免疫反應，上調(diào)炎癥因子作用[29]。針刺、康復、針康法干預均能抑制腦缺血后星形膠質(zhì)細胞的活化[30]，降低Th17細胞表達[31]。

本研究觀察了一系列與腦卒中后神經(jīng)炎癥有關的組織化學反應，這些結果還需在隨后的研究中加以擴展，并加入小鼠的腦血流監(jiān)測及增加炎性因子指標。

綜上所述，針康法治療可進一步改善腦缺血小鼠功能結果，限制腦損傷，可能與調(diào)節(jié)Foxp3、RORγt表達有關。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。