冷杉梢斑螟對林芝云杉球果揮發(fā)物的觸角電位及行為反應

唐曉琴，王思展，盧杰，高郯，陳羿渠

(1.西藏農(nóng)牧學院植物科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學院高原生態(tài)研究所，西藏 林芝 860000；3.西藏高原森林生態(tài)教育部重點實驗室，西藏 林芝 860000；4.西藏高原資源昆蟲與應用昆蟲實驗室，西藏 林芝 860000)

植食性昆蟲能準確定位寄主植物，對于其種群生存和繁衍具有重要的生物學意義[1-2]。植物揮發(fā)物是植物-昆蟲-天敵三級營養(yǎng)關系建立過程中的重要媒介，自然界中，植食性昆蟲可通過其靈敏的四大感知系統(tǒng)嗅覺、視覺、觸覺和味覺系統(tǒng)感知、搜索植物揮發(fā)物的痕跡，從而確定方向做出趨向寄主植物的選擇行為[3-4]。植物揮發(fā)物是由分子量為100～200 u 的醇類、酮類、酯類、萜烯類等小分子物質(zhì)組成[5-6]。針葉樹揮發(fā)物的主要成分是單萜和倍半萜，而針葉樹害蟲則借助這些揮發(fā)物成分確定其取食和產(chǎn)卵寄主[7-9]，尤其是單萜及其混合組分對有些梢斑螟成蟲引誘作用較強[10-12]。病蟲害和機械損傷均可誘導針葉樹特異性萜類揮發(fā)物含量及種類的增加，而梢斑螟成蟲的趨向則與這些特異性揮發(fā)物密切相關[13-14]。因此，明確寄主植物揮發(fā)物中引誘成分，有利于深入理解植食性昆蟲寄主選擇機制，對通過植物揮發(fā)物調(diào)控昆蟲行為以降低或控制害蟲的為害具有重要意義。

梢斑螟屬（Dioryctria）是針葉樹球果和枝梢害蟲的一大類，種類較多，危害較嚴重[15-16]，影響林木的生長和森林的天然更新。其中，冷杉梢斑螟Dioryctria abietella屬寡食性害蟲，主要危害我國松類球果和枝梢，在林芝地區(qū)危害林芝云杉（Picea likiangensisvar.linzhiensisW.C.Cheng &L.K.）球果，球果危害率為69.76%[17]。冷杉梢斑螟在林芝地區(qū)1 年發(fā)生1 代，以幼蟲危害林芝云杉球果果軸、種鱗和種子，影響林芝云杉的結(jié)實，從而影響其天然更新，且以幼蟲在球果內(nèi)越冬，有滯育現(xiàn)象，主要在每年6、7月份成蟲產(chǎn)卵期進行其寄主選擇[18]。已有研究表明，冷杉梢斑螟幼蟲趨向已經(jīng)危害的球果取食，而其成蟲則既能在當年生健康球果上產(chǎn)卵，也能在1 年生蟲害球果上產(chǎn)卵，但更趨向當年生健康球果產(chǎn)卵[19]。為了探討冷杉梢斑螟成蟲產(chǎn)卵期，林芝云杉球果引誘冷杉梢斑螟的特異性成分，本研究比較了林芝云杉蟲害球果和健康球果主要揮發(fā)物的差異，研究了冷杉梢斑螟成蟲對主要單萜揮發(fā)物EAG 反應和其不同組合的行為反應，為研發(fā)冷杉梢斑螟成蟲的引誘劑和驅(qū)避劑提供科學參考，為無公害防治該害蟲提供科學理論依據(jù)。1℃），相對濕度50%～60%，光周期為16L∶8D 下，用10%蜂蜜水補充營養(yǎng)，每天更換1 次蜂蜜水，待發(fā)育到2 日齡作為測試昆蟲。將當天羽化的雌雄成蟲轉(zhuǎn)入交配籠，待其交配完后分別放回養(yǎng)蟲杯內(nèi)，作為測試昆蟲。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試昆蟲 6月中下旬，從色季拉山林芝云杉天然林采集被害的林芝云杉球果，帶回實驗室解剖球果，對老熟幼蟲繼續(xù)放在球果中飼養(yǎng)，對蛹分雌雄，分別放置在30 cm×40 cm×50 cm 的羽化籠中待羽化，每天白天檢查冷杉梢斑螟成蟲羽化情況，對羽化成蟲單頭裝入透明塑料杯（350 mL）中，培養(yǎng)在人工氣候箱（白天20 ± 1℃，晚上為13 ±

1.1.2 供試標準化合物 在冷杉梢斑螟成蟲羽化高峰期，采集林芝云杉當年生健康球果、上年生健康球果、上年生受害球果，分別放入3 個500 mL 燒杯內(nèi)，每個樣重復3 次，用封口膜密封，在室溫條件（15～20℃）下放置12 h 后，采用固相微萃取進行吸附，萃取針型號 PDMS 100 μm，老化溫度270℃，時間1 h。萃取溫度30℃，萃取時間40 min，熱解析溫度260℃，熱解析時間30 s。然后立即進行GC-MS 分析，儀器是安捷倫5975，GC-MS 的色譜條件：色譜柱為Hp-5毛細管柱(30m×0.25mmID，膜厚0.25μm)，進樣口溫度260℃；柱溫起始溫度40℃，保持3min，以8℃·min?1升到280℃，保持10 min，載氣He (純度99.999%)，柱流量1 mL·min?1。質(zhì)譜條件：電離方式為EI 離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度260℃。揮發(fā)物根據(jù)質(zhì)譜庫Nist 2008 鑒定，統(tǒng)計相對含量大于1%以上的化合物。根據(jù)林芝云杉球果的GC-MS 結(jié)果以及冷杉梢斑螟成蟲趨向和產(chǎn)卵選擇的結(jié)果，確定冷杉梢斑螟觸角電位所用標準化合物共7 種（表1）[19]，均購于美國Sigma 公司，其中正己烷為溶劑。各標準品化合物均用正己烷作溶劑配制而成，濃度為100、10、1、0.5、0.1 μg·μL?1，測試冷杉梢斑螟不同成蟲類型對不同濃度標準化合物的EAG 反應。

表1 供試標準化合物特征Table 1 Characteristics of standard compounds for testing

1.1.3 儀器設備 觸角電位儀：觸角電位儀為德國Syntech 公司生產(chǎn)，型號為IDAC-2。信號采集系統(tǒng)：多通道USB 接口數(shù)據(jù)采集控制器，分辨率達到0.1 μv；取樣速率達到1～50 000·s?1；所用軟件為Syntech 公司提供的配套專用軟件；測量探頭：導電膠電極連接昆蟲觸角；氣流控制單元：刺激氣流控制單元，帶內(nèi)置氣泵，流量25 mL·s?1。

Y 型嗅覺儀：用玻璃訂制成的Y 型管，主臂長17 cm，兩側(cè)臂等長均為15 cm，內(nèi)直徑均為3.5 cm，兩側(cè)臂夾角60o，兩側(cè)臂的開口處連接樣品瓶、然后通過硅膠軟管連接風速流量計、加濕瓶、活性炭裝置和空氣抽氣泵（QC-2B）。開啟抽氣泵后，空氣經(jīng)過活性炭過濾、加濕、氣體流量控制器后分別吹過樣品瓶中的化合物和對照，然后進入Y 型嗅覺儀的側(cè)臂，再匯入主臂，氣流總流量控制在180 mL·min?1。

1.2 試驗方法

1.2.1 觸角電位測定 將健康活躍的冷杉梢斑螟未交配2 日齡雌雄成蟲和已交配雌成蟲的整根觸角用眼科剪沿基部剪下，觸角兩端切掉一節(jié)，通過導電膠（SPECTRA 360,Fairfield,NJ,USA）把觸角固定在電極兩端，然后將電極插入EAG 探頭中，隨之調(diào)試儀器，待基線平穩(wěn)后開始測定。為了減少試驗中觸角活性降低引起的誤差，每根觸角測試前，先用正己烷測試觸角是否有活性。

測定時，用移液槍取不同濃度的揮發(fā)物組分1 μL 滴到干凈的濾紙片上(25 mm×7.5 mm)，室溫下靜置20 s 待正己烷揮發(fā)后，裝入巴斯德管內(nèi)(管口直徑2 mm，長12 cm)，巴斯德管的尖端接入到氣體刺激控制裝置，通過踏板控制將巴斯德管內(nèi)的氣味物質(zhì)送入有連續(xù)氣流的鋼管中，鋼管內(nèi)連續(xù)氣流速度為4 mL·s?1，刺激管軟管中間隔氣流速度為4 mL·s?1，兩股氣流混合后被送到鋼管出口端相距約1 cm 處的觸角上，從而引起冷杉梢斑螟觸角產(chǎn)生電位反應，為保證觸角完全恢復感受功能，連續(xù)兩次刺激間隔時間不少于30 s。每種揮發(fā)物測試10 根（每頭蟲取1 根觸角）有活性觸角，每個劑量平行測定3 次，每種揮發(fā)物測定前后各進行1 次對照測定；不同揮發(fā)物測定順序隨機，而同一揮發(fā)物測試順序為低劑量到高劑量。

1.2.2 Y 型嗅覺儀生物測定 利用Y 型嗅覺儀測定冷杉梢斑螟已交配雌成蟲、2 日齡未交配雌雄成蟲對球果揮發(fā)物組分的選擇行為，各標準品的用量根據(jù)蟲害球果中含量和標準品的揮發(fā)量確定，林芝云杉揮發(fā)物組分配制情況見表2。

表2 冷杉梢斑螟Y 型嗅覺儀測定的揮發(fā)物組分Table 2 Determined volatiles on D.abietella by Y-tube olfactometer

生測時，用移液槍各取1 μL 表2 中的揮發(fā)物組分滴在干凈的小濾紙片上(30 mm×40 mm)，待正己烷揮發(fā)20 s 后，將其放入連接在一個側(cè)臂的樣品瓶中，另一個側(cè)臂上的樣品瓶為對照正己烷濾紙片。打開空氣泵后，調(diào)節(jié)氣體流量計使兩側(cè)臂的氣流均為90 mL·min?1，然后于Y 型管主臂開口端1/2 處分別單頭引入冷杉梢斑螟已交配雌成蟲、2 日齡未交配雌、雄成蟲觀察5 min，當試蟲到達其中一個臂的1/2 處，并在該側(cè)臂停留1 min 以上，就記錄該試蟲已經(jīng)做出選擇，選擇氣味源臂記錄“+”，選擇無氣味源臂記錄“-”。如果試蟲引入后在5 min 內(nèi)都不做選擇，則記錄該蟲為不選擇，同時結(jié)束本次試驗。林芝云杉球果氣味源物質(zhì)的配方共10 種（見表2），每種配方測試30 頭冷杉梢斑螟成蟲，每測試15 頭試蟲調(diào)換樣品瓶，每測試1 種配方，更換Y 型管和樣品瓶，用無水乙醇和蒸餾水清洗干凈內(nèi)臂，200℃烘干備用。Y 型嗅覺儀生測試驗條件為：照度2 000 lx，溫度為20℃左右，相對濕度50%～60%，由于冷杉梢斑螟成蟲在夜間活躍，所測試時間在晚上8:00—12:00 進行，試蟲測試前饑餓4 h。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Syntech 公司提供的軟件對不同處理的觸角電位反應值進行標準化校正，根據(jù)王茹林等[20]和閻雄飛等[21]的方法，為了消除昆蟲個體間的差異以及環(huán)境、溶劑的影響，以正己烷為對照，按公式計算觸角電位反應相對值：觸角電位反應相對值=處理反應值－前后對照反應均值。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件對同一成分不同濃度的EAG 反應值進行單因素方差分析，檢驗雌、雄蛾間對同一化合物不同濃度的EAG 反應差異顯著性。

按下列公式計算冷杉梢斑螟對不同揮發(fā)物組合的誘引率、驅(qū)避率[22]：

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計和分析，對Y 型嗅覺儀的對照臂和測試臂中蟲數(shù)進行X2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 當年生健康球果與上年生受害球果的揮發(fā)物成分

冷杉梢斑螟成蟲在當年生健康球果和上年生蟲害球果上產(chǎn)卵，GC-MS 檢測林芝云杉當年生健康球果和上年生蟲害球果揮發(fā)性萜類化合物的比較見表3。由于 ≥ 1%的化合物加起來在95%以上，因此統(tǒng)計了含量 ≥ 1%的化合物。健康新果和蟲害舊果均含有6 種化合物，不同之處是健康新果含有7.64%的雙環(huán)[3.1.0]六-2-烯，4-甲基-1-(1-甲基乙基)-，而蟲害舊果不含；健康新果不含3-亞甲基-6-(1-甲基乙基)環(huán)己烯，蟲害舊果卻含7.39%環(huán)己烯。相同組分含量除健康新果的β-蒎烯和檸檬烯顯著高于蟲害舊果外，其他組分含量在健康新果和蟲害舊果間差異不顯著（P>0.05）。前期研究發(fā)現(xiàn)，上年生健康球果除主成分與本研究一樣外，另外含7.39%的月桂烯和1.53%的3-蒈烯[19]。

表3 林芝云杉當年生健康球果、上年生蟲害球果的揮發(fā)性萜類化合物Table 3 Volatile terpenoids from new healthy cones and old pest cones of P.likiangensis var.linzhiensis

2.2 觸角電位反應

未交配冷杉梢斑螟2 日齡成蟲、完成交配的雌成蟲對6 種不同濃度林芝云杉球果揮發(fā)物的EAG 反應（見表4）。3 種狀態(tài)下的冷杉梢斑螟對不同濃度的α-蒎烯、β-蒎烯、(1S)-(-)-β-蒎烯、檸檬烯、反式石竹烯、月桂烯均有EAG 反應，但具有差異性。在10 μg·μL?1范圍內(nèi)，與對照正己烷相比，α-蒎烯、β-蒎烯、(1S)-(-)-β-蒎烯、檸檬烯隨著各組分濃度的增加，3 種狀態(tài)下的冷杉梢斑螟EAG 值也逐漸增大，當劑量超過10 μg·μL?1，EAG值下降，且當各組分濃度為10 μg·μL?1時，不同狀態(tài)的冷杉梢斑螟EAG 值顯著高于其他濃度（P<0.05）。未交配雌、雄蛾對反式石竹烯的EAG 反應隨著濃度的增加而增大，在0.5 μg·μL?1內(nèi)的EAG 反應值與對照差異不顯著性（P>0.05），達到1 μg·μL?1以后，EAG 值在各濃度間差異亦不顯著（P>0.05），而0.5 μg·μL?1與1 μg·μL?1間EAG反應差異顯著（P<0.05）。交配雌蛾、未交配雌蛾對月桂烯的EAG 反應隨濃度增大而增強，當濃度為100 μg·μL?1時EAG 值最大，但100 μg·μL?1與10 μg·μL?1的EAG 值差異不顯著（P>0.05）?？傮w上來看，冷杉梢斑螟對10 μg·μL?1的不同揮發(fā)物EAG 反應最強，且對檸檬烯EAG 反應最大，對反式石竹烯EAG 反應最弱。除反式石竹烯外，其他幾種揮發(fā)性化合物EAG 反應總體上表現(xiàn)為已交配雌蛾<未交配雌蛾<未交配雄蛾。

表4 冷杉梢斑螟成蟲對 6 種揮發(fā)物的EAG 反應Table 4 EAG responses of adults of D.abietella

2.3 Y 型嗅覺儀生物測定

根據(jù)觸角電位測試結(jié)果，以2 日齡冷杉梢斑螟雌雄成蟲、已交配雌蟲為試蟲，以α-蒎烯為對照，根據(jù)GC-MS 測試結(jié)果，在α-蒎烯基礎上按比例添加其他化合物組分進行Y 型嗅覺儀生物行為測定，結(jié)果如表5～7 所示。由表5 可知，各配方對2 日齡未交配冷杉梢斑螟雌成蟲的引誘數(shù)量由多到少為：A7>A8>A2、A5>A3>CK >A1>A6>A4、A10>A9，其中，配方A7、A8對其引誘率分別為73.3%和60.0%；配方A4、A9和A10對其趨避率分別高達56.7%、63.3%和60.0%；配方A6對其引誘作用不明顯。各配方對2 日齡未交配冷杉梢斑螟雄成蟲的引誘數(shù)量（見表6）由多到少為：A7>A3、A5、A8>A2>CK >A1、A6>A10>A9>A4，其中，配方A7對其引誘率最高，為76.7%；配方A4、A9和A10對其趨避率最高，分別為63.3%、56.7%和56.7%；配方A6對其引誘作用不明顯。表7 統(tǒng)計了各配方對已交配冷杉梢斑螟雌成蟲的引誘數(shù)量，由高到低分別為：A7>A3、A5>A2>A8>A6、A1>CK >A4>A9、A10，其中，配方A3、A5和A7對其引誘數(shù)量高于20 頭，引誘率依次為70.0%、70.0%和80.0%；配方A4、A9和A10對其趨避率最高，分別為63.3%、60.0%和60.0%?？傮w上，配方A2、A3、A5、A7、A8對其具有明顯引誘效果，尤以配方A7最佳，配方A4、A9、A10對其具有明顯趨避效果。

表5 冷杉梢斑螟未交配雌成蟲對不同配方化合物組分的Y 型嗅覺儀生測結(jié)果Table 5 Y-tube olfactometer bioassay results of unmated female adults of D.abietella on different formulation of compound components

表6 冷杉梢斑螟未交配雄成蟲對不同配方化合物組分的Y 型嗅覺儀生測結(jié)果Table 6 Y-tube olfactometer bioassay results of unmated male adults of D.abietella on different formulation of compound components

表7 冷杉梢斑螟交配后雌成蟲對不同配方化合物組分的Y 型嗅覺儀生測結(jié)果 Table 7 Y-tube olfactometer bioassay results of mated female adults of D.abietella on different formulation of compound components

3 討論

植食性昆蟲同植物在長期協(xié)同進化的過程中，形成了特定寄主植物范圍，并在不同生理期取食或產(chǎn)卵于寄主植物的特定組織和器官，這與寄主定向識別或選擇的過程中，寄主植物釋放的特異性揮發(fā)物承擔著重要通訊引導作用有關[23-24]。已有研究表明，蟲害、機械損傷均能引起揮發(fā)物成分變化，進而影響害蟲的寄主選擇[10-11]。本研究中，健康球果和蟲害球果的揮發(fā)物組分略有差異，這可能是蟲害引起寄主植物揮發(fā)物成分改變。

昆蟲生物活性判定的常用方法是觸角電位和嗅覺行為反應測定。前者是判斷昆蟲觸角對化學信號刺激的電生理反應，后者則是判斷昆蟲對化學信號的定向行為響應[5]。本研究中不同狀態(tài)下的冷杉梢斑螟成蟲對不同濃度下的α-蒎烯、β-蒎烯、(1S)-(?)-β-蒎烯、檸檬烯、反式石竹烯、月桂烯均具有EAG 反應，但不完全隨濃度的升高而增大，總體上，在劑量為10 μg·μL?1時，冷杉梢斑螟對不同化合物具有最大EAG 值，這與松梢象對紅松的α--蒎烯、反--檸檬烯、β--蒎烯、β--月桂烯、羅勒烯、莰烯及3--蒈烯的不同濃度EAG 反應一致[25]，這可能是達到了反應濃度的閾值。綜合不同組分各濃度下EAG 值，反式石竹烯對冷杉梢斑螟的刺激能力較弱，結(jié)合行為測試結(jié)果，含有反式石竹烯的配方（A7、A8）對冷杉梢斑螟的引誘能力較強，這可能是冷杉梢斑螟對其較為敏感，也可能是因為EAG反映的是嗅覺感受器對特定化合物反應電壓的強弱，而最終產(chǎn)生的行為反應則要經(jīng)歷3 個過程，依次為：嗅覺受體至大腦嗅葉之間的神經(jīng)編碼和投射、中樞神經(jīng)系統(tǒng)對神經(jīng)電生理信號的綜合評判以及大腦根據(jù)評判結(jié)果對運動器官進行反饋調(diào)控，這3 個過程均有可能造成神經(jīng)電生理信號的重新整合[26]，同時也說明僅靠EAG 反應不能確定昆蟲在定向過程中寄主揮發(fā)物的作用效果。雌蟲的EAG反應<雄蟲，這與楊干象（Cryptorrhynchus lapathi）、分月扇舟蛾（Clostera anastomosis）的不同性別EAG 反應結(jié)果不一致[27-28]。

已有研究表明[29-30]，植食性昆蟲在尋找寄主階段，主要通過識別寄主植物特異性化學指紋圖譜而到達植物，影響昆蟲反應的重要因子是植物揮發(fā)物的特定濃度和不同揮發(fā)物的特定比例。本研究中配方A7對3 種類型的成蟲引誘率最高，配方A4、A9、A10誘蟲率低，與對照相比，均有顯著性差異，說明月桂烯對冷杉梢斑螟有驅(qū)避作用。配方A7、A8在配方A5、A6及基本組分的基礎上添加一定量的反式石竹烯，說明反式石竹烯在球果揮發(fā)物組分中引誘成蟲有增效作用，而且GC-MS 檢測到成蟲期的健康新果、上年生蟲害球果含少量反式石竹烯，而上年生健康球果沒有檢測到反式石竹烯（上年生健康球果無引誘效果）。配方A5和A6組成成分相同而含量不同，但配方A6無明顯引誘效果，這可能與化合物比例不同有關。僅含α-蒎烯的對照與A1、A2、A3配方的2 日齡雌雄成蟲誘蟲數(shù)量無顯著性差異，說明α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯是球果揮發(fā)物的基礎組分，在冷杉梢斑螟搜尋寄主的過程中起著重要作用。嚴格地講，Y 形嗅覺儀并不是測定驅(qū)避效果的有效儀器，只能對驅(qū)避的檢測作參考，因為在自然界中，昆蟲面臨著豐富的嗅覺信息。

查閱相關文獻，月桂烯和石竹烯對昆蟲常有趨避和引誘作用。楊慧通過研究興安落葉松鞘蛾對寄主揮發(fā)物的反應，發(fā)現(xiàn)落葉松鞘蛾雄成蟲對月桂稀在濃度0.8 mol·L?1時有驅(qū)避作用[31]；劉勝英通過研究落葉松毛蟲對落葉松揮發(fā)性化合物的誘導和利用，發(fā)現(xiàn)月桂烯對落葉松毛蟲幼蟲有驅(qū)避作用[32]，這些研究結(jié)果與本研究一致；王延來通過研究花椒窄吉丁對其高發(fā)期寄主果實揮發(fā)物的電位觸角和行為反應，發(fā)現(xiàn)月桂烯在濃度在10 μg·μL?1時對花椒窄吉丁雄成蟲有較強的吸引作用[33]；袁麗芳通過研究花椒窄吉丁對寄主揮發(fā)物的化學感受機制，發(fā)現(xiàn)10 μg·μL?1的石竹烯對花椒窄吉丁雌蟲有驅(qū)避作用[34]；張振通過化學生態(tài)技術調(diào)控青楊脊虎天牛種群研究發(fā)現(xiàn)，月桂烯在濃度10?2mol·L?1時對青楊脊虎天牛雌、雄成蟲均有引誘作用[35]。昆蟲分類地位不同，昆蟲個體差異大，昆蟲觸角上的感器不同，對不同的氣味物質(zhì)感受不同，則行為反應表現(xiàn)不同。

4 結(jié)論

蟲害可引起球果內(nèi)揮發(fā)性化合物的組成成分及含量發(fā)生變化，在劑量10 μg·μL?1時，各組分可引起冷杉梢斑螟最大的EAG 反應值，配方A1、A2、A3引誘冷杉梢斑螟的效果與僅含α-蒎烯的對照無顯著差異，在此基礎上若增加反式石竹烯可增強引誘冷杉梢斑螟的效果，若增添月桂烯，可顯著提高冷杉梢斑螟趨避的效果，這一結(jié)論是在實驗室條件下得出的，與野外的實際環(huán)境有較大的不同，今后有待在室外開展冷杉梢斑螟的引誘和趨避試驗。