核型正常髓系腫瘤患者的基因突變研究

高 波，晁紅穎，韓文敏*，盧緒章，陳梅玉，劉 潔，何金媛，沈宏杰

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院血液科，江蘇 常州213003；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省血液研究所，衛(wèi)生部血栓與止血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州215000

急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）和骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一類臨床和分子遺傳學(xué)異質(zhì)性很強(qiáng)的造血干細(xì)胞克隆性惡性疾病。盡管細(xì)胞遺傳學(xué)改變已成為AML及MDS患者重要的致病機(jī)制及獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一，但仍有部分正常核型患者預(yù)后差異較大，致病機(jī)制不明。隨著分子學(xué)研究的進(jìn)展，近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者在正常核型患者中檢測(cè)到多個(gè)基因異常，推測(cè)單一的分子事件不足以導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞的形成需要2次或多次基因事件協(xié)同完成［1-2］。因此，對(duì)此類患者進(jìn)行多基因多位點(diǎn)檢測(cè)有助于進(jìn)一步精確診斷，為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療及靶向治療提供新的理論依據(jù)。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，綜合檢測(cè)了102例正常核型髓系腫瘤患者51種腫瘤相關(guān)基因突變，初步探討正常核型患者的分子學(xué)特點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

回顧性檢測(cè)2013年6月—2017年8月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院及蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診及住院治療的正常核型的原發(fā)AML及MDS患者共102例。82例AML患者中，男48例，女34例，中位年齡45（17～68）歲，包括M02例，M17例，M228例，M47例，M535例，M61例，未能分型AML 2例。20例MDS患者中，男11例，女9例，中位年齡49（29～70）歲，包括難治性貧血伴有環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞 增 多（refractory anemia with ring sideroblast，RARS）1例，難治性血細(xì)胞減少伴有多系發(fā)育異常（refractory cytopenia with multilineage dysplasia，RCMD）2例，難治性貧血伴原始細(xì)胞增多1型（refractory anemia with excess of blasts-1，RAEB-1）7例，RAEB-2型10例。所有患者均經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、白血病免疫分型、染色體核型及分子生物學(xué)檢查（morphology immunology cytogenetics molecular，MICM）確診，其中MDS分型依據(jù)WHO-2016標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取患者首診時(shí)乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的骨髓或者外周血單個(gè)核細(xì)胞，按照DNA提取試劑盒（Gentra公司，美國(guó)）標(biāo)準(zhǔn)步驟抽取基因組DNA。根據(jù)吸光度值確定DNA濃度和純度，并將基因組DNA樣品統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL。

1.2.2 高通量DNA測(cè)序

取所檢樣品基因組DNA 12 ng，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增基因組DNA的目標(biāo)區(qū)域，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，消化引物；參考IonAmpliSeq文庫(kù)試劑盒操作的標(biāo)準(zhǔn)流程，將Am-Pure XP磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合，純化文庫(kù)，去除小的片段，在避光條件下檢測(cè)文庫(kù)濃度。采用Termofisher科技（中國(guó)）有限公司S5系統(tǒng)進(jìn)行49種基因的所有外顯子突變。平均基因覆蓋率＞99%，平均測(cè)序深度×2 000，檢測(cè)靈敏度約3.0%。采用IGV軟件分析結(jié)果，讀取數(shù)據(jù)選擇基因組外顯子上的突變，突變頻率＞3%被認(rèn)為陽(yáng)性，同時(shí)去除基因多態(tài)性及同義突變。49種髓系相關(guān)腫瘤基 因 突 變 包 括PTPN11、BCOR、NRAS、WT1、MYD88、C-KIT、TET2、IDH1、IDH2、FLT3、DNMT3A、CBL、ZRSR2、BCORL1、U2AF1、GATA2、ETV6、SH2B3、MPL、CSF3R、SETBP1、ASXL1、ASXL2、ETNK1、SETD2、PDGFRA、CALR、PDGFRB、CSMD1、RUNX1、SRSF2、TP53、NOTCH1、JAK1、JAK2、JAK3、IL7R、PAX5、EZH2、STAG2、PIGA、PHF6、BIRC3、KRAS、SF3B1、CDKN2A、PTEN、BRAF及FBXW7基因突變。

1.2.3 Sanger測(cè)序

鑒于第2代高通量DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)大片段插入缺失序列結(jié)果讀取的局限性，本研究采用Sanger測(cè)序法對(duì)FLT3-ITD、NPM1基因12號(hào)外顯子補(bǔ)充突變檢測(cè)及CEBPA基因的TAD、BZIP功能區(qū)、CALR基因9號(hào)外顯子進(jìn)行突變檢測(cè)［3-4］。

1.2.4 染色體核型分析

抽取肝素抗凝骨髓懸液2～4 mL，采用24 h短期培養(yǎng)法、常規(guī)R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果均采用SPSS21.0軟件分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因突變?cè)谡：诵虯ML患者中的分布情況

82例正常核型AML患者中，81例患者至少攜帶1個(gè)基因突變，總突變率為98.8%，其中，單基因突變發(fā)生率18.3%（15/82），雙基因突變發(fā)生率為28.0%（23/82），≥3個(gè)基因突變共存發(fā)生率為52.4%（43/82）。突變檢出率最高為NPM1（35.4%，29/82），其他突變率＞5%的基因依次為FLT3-ITD（25.6%，21/82）、CEBPA雙突變（24.4%，20/82）、DNMT3A（19.5%，16/82）、TET2（18.3%，15/82）、NRAS（13.4%，11/82）、RUNX1（11.0%，9/82）、CSF3R（11.0%，9/82）、IDH1（9.8%，8/82）、IDH2（8.5%，7/82）、FLT3-TKD（7.3%，6/82）、PTPN11（6.1%，5/82）、JAK3

（6.1%，5/82），見(jiàn)圖1。

按照基因功能進(jìn)行歸類為參與DNA甲基化的調(diào)節(jié)基因、RNA剪接因子、酪氨酸激酶受體基因、RAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因及組蛋白修飾基因6組基因，NPM1作為核仁磷酸化蛋白單獨(dú)分類（表1）。82例AML患者中，酪氨酸激酶受體基因突變陽(yáng)性率最高（56.1%，46/82）；其他依次為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因（41.5%，34/82）、DNA甲基化的調(diào)節(jié)基因（40.2%，33/82）、RAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因（14.6%，12/82）、組蛋白修飾基因（8.5%，7/82）和RNA剪接因子（4.9%，4/82），見(jiàn)圖1。

表1 51種突變基因功能分類Table 1 Functional classification of 51 mutated genes

圖1 AML患者常見(jiàn)基因突變分布及功能基因突變率比較Figure 1 Comparison of common gene mutation distribution and functional gene mutation rate in patients with AML

2.2 基因突變?cè)谡：诵蚆DS患者中的分布情況

20例正常核型MDS患者中，17例患者至少攜帶1個(gè)基因突變，總突變率為85%，其中單基因突變發(fā)生率15.0%（3/20），雙基因突變發(fā)生率為20.0%（4/20），≥3個(gè)基因突變共存發(fā)生率為55.0%（11/20）。突變檢出率最高為RUNX1（35.0%，7/20），其他突變依次為ASXL1（25.0%，5/20）、SF3B1（15.0%，3/20）、BCOR（15.0%，3/20）、FLT3-TKD（15.0%，3/20），突變發(fā)生率為10%（2/20）的基因包括DNMT3A、SH2B3、U2AF1、PHF6、PTPN11、GATA2及NPM1。僅1例MDS患者發(fā)生FLT3-ITD突變（圖2）。

功能歸類后顯示，約60%（12/20）的患者攜帶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因突變；30%（6/20）的患者攜帶RNA剪接因子及組蛋白修飾基因突；分別有25%（5/20）和20%（4/20）的患者攜帶酪氨酸激酶受體基因及RAS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因突變；僅有15%（3/20）的患者攜帶參與DNA甲基化的調(diào)節(jié)基因突變，見(jiàn)圖2。

圖2 MDS患者常見(jiàn)基因突變分布及功能基因突變率比較Figure 2 Comparison of gene mutation distribution and functional gene mutation rate in patients with MDS

所有AML及MDS患者中，分別有94%（15/16）的RUNX1突變及90%（28/31）的NPM1均與其他突變共存。其中，NPM1最常見(jiàn)的共存基因?yàn)镕LT3-ITD及參與DNA甲基化的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)基因DNMT3A、TET2和IDH1/2突變，未檢測(cè)到IDH1與IDH2突變、RUNX1與NPM1突變共存。各基因突變?cè)诓煌颊咧械姆植记闆r見(jiàn)圖3。

2.3 基因突變?cè)贏ML及MDS患者間的分布差異比較

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，正常核型的AML患者與MDS組患者在總的基因突變率、單基因突變、雙基因突變及≥3個(gè)基因突變共存上比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AML患者主要以NPM1、FLT3-ITD、CEBPA雙突變、DNMT3A及TET2突變?yōu)橹?，其中NPM1、CEBPA雙突變?cè)贏ML中的發(fā)生率明顯高于MDS患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MDS患者基因突變主要以RUNX1、ASXL1、SF3B1及BCOR為主，發(fā)生率明顯高于AML患者，差異均達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。功能歸類后顯示，除NPM1突變外，正常核型的AML患者主要為酪氨酸激酶受體基因突變、轉(zhuǎn)錄因子突變及DNA甲基化調(diào)節(jié)基因突變；正常核型MDS患者主要為轉(zhuǎn)錄因子突變、RNA剪接因子突變及組蛋白修飾基因突變。其中，DNA甲基化調(diào)節(jié)基因突變及酪氨酸激酶受體基因突變?cè)贏ML中的發(fā)生率明顯高于MDS患者，而組蛋白修飾基因及RNA剪接因子突變?cè)贛DS中的發(fā)生率明顯高于AML，以上功能基因在兩組患者間的分布差異均達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 常見(jiàn)基因突變?cè)贏ML及MDS組的分布差異比較Table 2 Comparison of the distribution of gene mutations in patients with AML and MDS ［n（%）］

3 討論

截至目前，約半數(shù)的AML及MDS患者表現(xiàn)為正常核型，此類患者在診斷、微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）監(jiān)測(cè)、預(yù)后判定等方面往往缺乏理論參考依據(jù)，為臨床診斷和治療選擇帶來(lái)困惑。近年來(lái)，隨著分子學(xué)研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的基因事件被發(fā)現(xiàn)與正常核型相關(guān)并具有預(yù)后價(jià)值，如NPM1及FLT3-ITD等突變，以上基因已被WHO作為AML危險(xiǎn)度分層的分子標(biāo)志納入了AML的常規(guī)診療指南［5］。然而，盡管AML患者有相同NPM1突變，其臨床表現(xiàn)及預(yù)后仍有較大異質(zhì)性，提示AML患者存在多基因突變共存可能［6］。

國(guó)外學(xué)者在正常核型AML、MDS患者中綜合檢測(cè)了16種髓系腫瘤基因，發(fā)現(xiàn)有85%的患者至少攜帶1種基因突變，其中，ASXL1和TET2在繼發(fā)性AML患者中的突變率分別高達(dá)48.5%和30.3%［7］。Lin等［8］通過(guò)高通量DNA測(cè)序技術(shù)在112例原發(fā)AML患者中檢測(cè)260種腫瘤基因，發(fā)現(xiàn)平均每個(gè)患者發(fā)生17.2個(gè)基因突變。以正常核型為主的中危組患者中，大多數(shù)患者顯示為多基因突變共存。其中，NPM1突變往往與FLT3、PTPN11、PRF8及SF3B1突變共存，而IDH2則主要與DNMT3A、JAK1-3、AXSL1和U2AF1突變共存，但與TET2突變互排［8］。本研究綜合檢測(cè)了51種腫瘤基因突變，結(jié)果顯示，半數(shù)以上的原發(fā)AML及MDS患者同時(shí)存在≥3個(gè)基因突變。正常核型AML患者中以NPM1、FLT3-ITD及CEBPA突變?yōu)橹?，其他突變率?0%的基因?yàn)镈NMT3A、TET2、NRAS、RUNX1及CSF3R。MDS患者的主要突變基因與AML有很大不同，主要為RUNX1、ASXL1、SF3B1、BCOR。參考相關(guān)研究，按照基因功能進(jìn)行歸類分析［9-11］，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化調(diào)節(jié)基因及酪氨酸激酶受體基因突變?cè)贏ML中的發(fā)生率明顯高于MDS患者，而組蛋白修飾基因及RNA剪接因子突變?cè)贛DS中的發(fā)生率明顯高于AML，差異均較顯著。以上研究說(shuō)明，正常核型的髓系腫瘤可能是多個(gè)不同功能基因突變不斷疊加的結(jié)果，盡管MDS具有高的AML轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)，并被稱為“白血病前期”，但其基因表達(dá)譜與原發(fā)AML有很大不同，應(yīng)屬2種不同類型的疾病實(shí)體。

DNA甲基化是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)事件，參與DNA甲基化調(diào)控的基因發(fā)生突變可以通過(guò)介導(dǎo)基因組甲基化的異常而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化［12］。DNMT3A及TET2突變是AML患者中陽(yáng)性率最高的DNA甲基化調(diào)節(jié)基因，文獻(xiàn)報(bào)道，其在正常核型AML患者中的檢出率分別在35%～38.9%和13.2%～16%之間［1，13-14］。DNMT3A突變者平均年齡高于野生型，并與較短的總體生存時(shí)間有關(guān)，是患者在完全緩解期仍持續(xù)存在的主要分子事件［15-16］。伴有TET2純和突變者具有更高的復(fù)發(fā)率及更短的無(wú)病生存時(shí)間，是正常核型AML患者獨(dú)立不良預(yù)后標(biāo)志［14］。Guo等［17］和Hunter等［18］多個(gè)研究行Meta分析顯示，TET2突變?cè)贛DS中并無(wú)預(yù)后價(jià)值，但去甲基化治療對(duì)伴有TET2突變而ASXL1突變陰性的患者效果最好。本研究中TET2突變率與國(guó)外報(bào)道相仿，但DNMT3A突變發(fā)生率稍低于國(guó)外報(bào)道，分析這一差異的主要原因可能為納入的研究對(duì)象中患者的年齡性別分布不同、檢測(cè)方法的靈敏性不同、樣本的數(shù)量及種族差異等，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

RUNX1突變是目前發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子突變，在AML及MDS發(fā)生率約為10%［10，19-20］，在MDS-RAEB-1/2及繼發(fā)性AML患者中檢出率＞20%，與低的血小板計(jì)數(shù)、不成熟的細(xì)胞形態(tài)及短的生存期有關(guān)［19］。ASXL1是最常見(jiàn)的組蛋白修飾基因之一，該基因突變主要見(jiàn)于繼發(fā)性AML（30%），在原發(fā)AML及MDS中的檢出率分別為6.1%及11%，并與RUNX1及IDH2突變密切相關(guān)［10，21］。伴ASXL1突變的AML患者，其總體緩解率低，生存時(shí)間短，而伴有此突變的MDS患者則更易出現(xiàn)白血病轉(zhuǎn)化［22］。以上2種基因突變已被作為新危險(xiǎn)度分層的分子標(biāo)志納入了2017急性髓系白血病診療指南［23］。SF3B1基因在MDS-RARS患者中陽(yáng)性率達(dá)57%～75%，在其他類型的MDS中為6%～18%，具有該突變的患者較少發(fā)生血細(xì)胞減少并具有更長(zhǎng)的無(wú)事件生存期，但在AML中非常罕見(jiàn)［24-25］。本研究在原發(fā)AML中未檢測(cè)到SF3B1突變，在MDS中的突變發(fā)生率與國(guó)外報(bào)道基本一致，預(yù)后意義暫不明確。

總之，正常核型的髓系腫瘤患者體內(nèi)存在多個(gè)不同功能基因突變組合的亞克隆，其中，原發(fā)AML與MDS在基因突變譜上有很大不同，這些不同功能的基因突變?nèi)绾喂餐瑳Q定其臨床表型及預(yù)后尚不明確，未來(lái)進(jìn)一步行基因功能研究可能有助于我們更深入認(rèn)識(shí)此類疾病的發(fā)生機(jī)制。