質(zhì)譜快速鑒定聯(lián)合直接藥敏試驗(yàn)在腸桿菌目細(xì)菌血流感染診斷中的應(yīng)用評估

陸燕飛，劉根焰，張曉慧，許雨喬，倪芳，文怡(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京210029)

血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)。在血培養(yǎng)瓶陽性報(bào)警后通常需要48～72 h才能獲得傳統(tǒng)的血培養(yǎng)細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)結(jié)果?？焖俚难囵B(yǎng)細(xì)菌鑒定、及時(shí)可靠的藥敏結(jié)果對臨床及早合理使用抗菌藥物、降低患者死亡率有重要意義。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術(shù)可直接對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行快速鑒定且具有較高的準(zhǔn)確性[1]。歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)和美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)在2018年和2021年分別發(fā)布了紙片法血培養(yǎng)陽性瓶直接快速藥敏試驗(yàn)(rapid antimicrobial susceptibility testing, RAST)方法[2-3]，致力于縮短血培養(yǎng)藥敏報(bào)告時(shí)間。采用EUCAST方法可在4～8 h內(nèi)獲得快速藥敏結(jié)果，而CLSI方法則需要16～18 h。本研究在MALDI-TOF MS快速鑒定的基礎(chǔ)上參考EUCAST血培養(yǎng)RAST方法對腸桿菌目細(xì)菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行RAST，并將結(jié)果與常規(guī)藥敏結(jié)果進(jìn)行對比，以期為本實(shí)驗(yàn)室建立血培養(yǎng)快速鑒定及藥敏試驗(yàn)方法提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1菌株來源 收集2020年4月—7月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血培養(yǎng)報(bào)陽后直接涂片為單一革蘭陰性桿菌標(biāo)本，排除3 d內(nèi)重復(fù)送檢為同一種細(xì)菌及混合感染的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 BACTEC TM FX血培養(yǎng)系統(tǒng)和血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)；Vitek MS質(zhì)譜儀、Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)及配套試劑(法國生物梅里埃公司)；血平板、巧克力平板、M-H瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)；藥敏紙片(英國Oxoid公司)；真空采血管(Greiner bio-one公司)。

1.3方法

1.3.1血培養(yǎng)陽性標(biāo)本快速鑒定及藥敏試驗(yàn)

1.3.1.1Vitek MS快速鑒定 血培養(yǎng)陽性報(bào)警后，取出陽性瓶內(nèi)培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，當(dāng)鏡下顯示單一革蘭陰性桿菌時(shí)，顛倒混勻血培養(yǎng)瓶，用無菌注射器抽取4 mL陽性血培養(yǎng)液至帶分離膠的真空采血管內(nèi)，室溫3 500 r/min離心10 min，棄上清液后加入1 mL無菌去離子水，混勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管內(nèi)，16 000×g離心1 min，棄上清液后加入75%乙醇混勻，16 000×g離心2 min，棄上清液，待乙醇揮發(fā)后加入20 μL無菌去離子水混勻沉淀，取0.5 μL沉淀點(diǎn)樣至金屬靶板，加1 μL基質(zhì)液，待靶板干燥后使用Vitek MS進(jìn)行快速鑒定。

1.3.1.2陽性血培養(yǎng)液RAST 以MALDI-TOF MS快速鑒定結(jié)果為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本作為RAST的研究對象。參考2018年EUCAST公布的陽性血培養(yǎng)液RAST方法[2]，即從血培養(yǎng)瓶中直接吸取100 μL陽性培養(yǎng)液至直徑90 mm的M-H平板上，均勻涂布后貼上相應(yīng)抗菌藥物紙片，藥敏紙片包括哌拉西林/他唑巴坦(TZP，36 μg/6 μg)、頭孢噻肟(CTX，5 μg)、頭孢他啶(CAZ，10 μg)、美羅培南(MEM，10 μg)、環(huán)丙沙星(CIP，5 μg)、阿米卡星(AK，30 μg)、慶大霉素(CN，10 μg)，35 ℃溫育4 h、6 h、8 h后，分別從正面量取抑菌圈直徑，根據(jù)EUCAST指南中不同細(xì)菌在不同時(shí)間的快速藥敏折點(diǎn)判讀藥敏結(jié)果，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。參考EUCAST標(biāo)準(zhǔn)，RAST藥敏結(jié)果可分為敏感、耐藥和技術(shù)不定區(qū)域(area of technical uncertainty, ATU)。ATU是細(xì)菌敏感與耐藥折點(diǎn)重疊的區(qū)域，抑菌圈直徑范圍通常在1～3 mm[2]，與CLSI中“中介”的概念不同。當(dāng)抑菌圈直徑落入此范圍時(shí)，其判斷為敏感、中介、耐藥的錯(cuò)誤率比較高，因此對于ATU結(jié)果不提供藥敏結(jié)果的判讀[2,4]。

1.3.2血培養(yǎng)陽性標(biāo)本常規(guī)鑒定及藥敏試驗(yàn) 當(dāng)血培養(yǎng)儀提示陽性報(bào)警時(shí)，取出陽性瓶進(jìn)行革蘭染色并轉(zhuǎn)種至相應(yīng)平板溫育18～24 h，分離出單個(gè)菌落，制備成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?。革蘭陰性桿菌采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀配套鑒定卡及藥敏卡(AST GN09)進(jìn)行菌株鑒定及藥敏，同時(shí)加做CTX(30 μg)K-B法藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果按照CLSI M100-S29規(guī)定進(jìn)行判讀，當(dāng)儀器顯示亞胺培南或美羅培南耐藥時(shí)經(jīng)K-B法復(fù)核后，根據(jù)CLSI定義判定為耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae bacteria，CRE)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3.3藥敏結(jié)果比較 比較RAST藥敏與常規(guī)藥敏結(jié)果的一致性，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)符合(categorial agreement, CA)：常規(guī)藥敏結(jié)果為敏感(或耐藥)，RAST結(jié)果為敏感(或耐藥)；(2)錯(cuò)誤(error, Er)：常規(guī)藥敏結(jié)果與RAST結(jié)果不一致，包括①非常重大錯(cuò)誤(very major errors, VME)：假敏感，即常規(guī)藥敏結(jié)果為耐藥，RAST結(jié)果為敏感；②重大錯(cuò)誤(major errors, ME)：假耐藥，即常規(guī)藥敏結(jié)果為敏感，RAST結(jié)果為耐藥；③微小錯(cuò)誤(minor errors, mE)：常規(guī)藥敏結(jié)果為中介，RAST結(jié)果為敏感或耐藥。無ATU結(jié)果的判讀及比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。四格表資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Vitek MS快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較分析 共有126例血培養(yǎng)陽性標(biāo)本利用Vitek MS進(jìn)行快速鑒定，Vitek 2 Compact常規(guī)鑒定為腸桿菌目細(xì)菌104株和非發(fā)酵革蘭陰性桿菌22株。質(zhì)譜快速鑒定腸桿菌目細(xì)菌的檢出率為96.2%(100/104)。細(xì)菌快速鑒定結(jié)果與常規(guī)鑒定結(jié)果一致，見表1。Vitek MS快速鑒定通?？稍? h內(nèi)完成。

表1 革蘭陰性桿菌血培養(yǎng)陽性標(biāo)本Vitek MS快速鑒定與常規(guī)鑒定結(jié)果比較

2.2陽性血培養(yǎng)液RAST藥敏結(jié)果分析

2.2.1RAST可量取的抑菌圈直徑結(jié)果分析 共有90株腸桿菌目細(xì)菌進(jìn)行血培養(yǎng)RAST，包括肺炎克雷伯菌50株和大腸埃希菌40株。腸桿菌目細(xì)菌陽性血培養(yǎng)液RAST在4 h、6 h、8 h可量取抑菌圈的比例分別為94.3%、100%、100%。見表2。

表2 細(xì)菌各時(shí)間段可量取抑菌圈直徑的比例(%)

2.2.2RAST藥敏結(jié)果判讀 在4 h、6 h、8 h判讀腸桿菌目細(xì)菌藥敏結(jié)果時(shí)，7種抗菌藥物在4 h、6 h、8 h時(shí)的RAST結(jié)果平均CA比例上升，分別為76.0%(453/596)、92.4%(551/596)、94.0%(560/596)；ATU比例下降，分別為17.8%(106/596)、7.0%(42/596)、5.7(34/596)。6 h判讀腸桿菌目細(xì)菌藥敏結(jié)果的符合率優(yōu)于4 h判讀腸桿菌目細(xì)菌藥敏結(jié)果的符合率(χ2=15.566，P<0.001)，與8 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.495，P=0.482)。4 h、6 h、8 h藥敏結(jié)果判讀時(shí)CA比例最高的抗菌藥物分別為CIP、MEM、MEM；CA比例最低的抗菌藥物分別為TZP、CAZ、CAZ。4 h、6 h、8 h藥敏結(jié)果判讀平均錯(cuò)誤的比例分別為0.7%(4/596)、0.5%(3/596)、0.5%(3/596)，僅有1例肺炎克雷伯菌對CTX的藥敏結(jié)果在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)判讀時(shí)均為VME，見表3。肺炎克雷伯菌在各時(shí)間段判讀的藥敏結(jié)果CA比例均高于大腸埃希菌；ATU比例均低于大腸埃希菌，其中兩者CA及ATU比例在4 h和6 h判讀時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌各判讀時(shí)間藥敏結(jié)果比較[n(%)]

2.2.3血流感染CRE時(shí)RAST藥敏結(jié)果分析及比較 共有25株CRE，在4 h、6 h、8 h 藥敏判讀時(shí)CRE檢出率分別為92.0%(23/25)、96.0%(24/25)、96.0%(24/25)，各時(shí)間段CRE檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.528，P=0.768)。CRE菌株分別在4 h、6 h、8 h判斷整體抗菌譜時(shí)，平均CA分別為96.0%(167/174)、97.7%(170/174)、98.3%(171/174)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.908，P=0.385)；平均ATU分別為3.4%(6/174)、1.7%(3/174)、1.1%(2/174)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.415，P=0.299)。見表5。

表5 CRE各時(shí)間段快速藥敏結(jié)果符合率比較(%)

3 討論

一項(xiàng)薈萃分析顯示，利用MALDI-TOF MS對陽性血培養(yǎng)液進(jìn)行快速鑒定時(shí)，對革蘭陰性菌特別是腸桿菌目細(xì)菌具有極高的準(zhǔn)確性，對革蘭陽性菌鑒定的準(zhǔn)確率略低[5]。由于細(xì)菌分布及陽性血培養(yǎng)液前處理方法不同，各研究的準(zhǔn)確率有所差異[6]。本研究126株革蘭陰性菌中121株可快速準(zhǔn)確鑒定到種，準(zhǔn)確率高達(dá)96.0%，且鑒定時(shí)間控制在1 h內(nèi)，為臨床早期經(jīng)驗(yàn)性用藥及后續(xù)快速藥敏結(jié)果判讀提供了快速可靠的病原學(xué)依據(jù)。

陽性血培養(yǎng)液RAST近年來已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7]。目前，快速獲得血培養(yǎng)病原菌藥敏結(jié)果的方法眾多，部分研究者將陽性血培養(yǎng)液預(yù)處理后制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?，使用自?dòng)化儀器或紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[8]，此法耗時(shí)相對較長，特別是紙片擴(kuò)散法仍需18～24 h，且無規(guī)范化折點(diǎn)來判斷藥敏結(jié)果；有學(xué)者用直接涂片檢查分析不同抗菌藥物條件下細(xì)菌形態(tài)的變化，可在6 h內(nèi)檢測細(xì)菌的耐藥性[9]，該方法較為復(fù)雜，不易常規(guī)操作；谷鈺峰等[10]利用流式細(xì)胞術(shù)對微生物的代謝參數(shù)進(jìn)行檢測，可在3 h內(nèi)檢測細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，此法儀器價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以檢測；另外，利用分子生物學(xué)手段可以快速檢測細(xì)菌的耐藥基因[11]，但檢測價(jià)格昂貴，不易常規(guī)檢測。2018年4月EUCAST發(fā)布了陽性血培養(yǎng)液RAST及折點(diǎn)，該法方法簡單、成本低、耗時(shí)短，易于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展及標(biāo)準(zhǔn)化，具有普遍適用性，在一定程度上可彌補(bǔ)上述各方法存在的缺陷，目前腸桿菌目細(xì)菌中肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌可進(jìn)行RAST。

本研究在質(zhì)譜快速鑒定的基礎(chǔ)上參考EUCAST陽性血培養(yǎng)液RAST方法，分別在4 h、6 h、8 h對90例陽性血培養(yǎng)液RAST結(jié)果進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌目細(xì)菌大部分抑菌圈直徑4 h即可量取，且肺炎克雷伯菌可量取比例高于大腸埃希菌，6 h起大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直徑即可全部測量，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[12]。細(xì)菌抑菌圈直徑量取的準(zhǔn)確性直接影響后續(xù)藥敏結(jié)果的判讀，若出現(xiàn)細(xì)菌生長不良或抑菌圈邊緣不清時(shí)不應(yīng)量取，對于大腸埃希菌溫育早期可能存在抑菌圈內(nèi)的薄霧狀生長應(yīng)忽略[1,12]。各時(shí)間點(diǎn)量取的抑菌圈直徑根據(jù)EUCAST血培養(yǎng)液RAST藥敏折點(diǎn)進(jìn)行判讀[1]，每種細(xì)菌在4 h、6 h、8 h都有獨(dú)立的折點(diǎn)，可分別進(jìn)行藥敏分析。有文獻(xiàn)報(bào)道若將RAST抑菌圈直徑使用常規(guī)的藥敏折點(diǎn)進(jìn)行判讀，結(jié)果準(zhǔn)確性偏低[13]。

根據(jù)CLSI M52及美國FDA規(guī)定，一個(gè)可接受的藥敏系統(tǒng)必須要達(dá)到的條件包括CA≥90%、VME≤1.5%、ME≤3.0% 以及mE<10%[13-14]。本研究結(jié)果顯示，腸桿菌目細(xì)菌從6 h判讀時(shí)CA比例即>90%，與4 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與8 h相比無明顯差異，提示6 h判讀腸桿菌目細(xì)菌整體抗菌譜在準(zhǔn)確性和時(shí)間上具有優(yōu)勢，Soo等[14]的研究也得出類似結(jié)論。不同抗菌藥物在不同時(shí)間點(diǎn)判讀時(shí)藥敏結(jié)果符合率有所差別，有文獻(xiàn)報(bào)道4 h判讀腸桿菌目細(xì)菌藥敏結(jié)果時(shí)，TZP和CIP分別表現(xiàn)出最低和最高的CA(60% vs 94.6%)，而當(dāng)6 h判讀時(shí)CA最低和最高的抗菌藥物則為AK和MEM(88.5% vs 98.4%)[13]。本研究4 h藥敏判讀結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，其中TZP僅有55.6%的RAST藥敏結(jié)果與常規(guī)相符，可能是由于此藥ATU范圍內(nèi)的抑菌圈直徑跨度較大，導(dǎo)致很大一部分藥敏結(jié)果落在ATU范圍內(nèi)，從而降低了CA的比例。MEM從6 h起即成為藥敏符合率最高的抗菌藥物，CA比例高達(dá)98.9%，僅有1株耐藥株的藥敏結(jié)果落在ATU范圍內(nèi)，可能是由于抑菌圈直徑量取誤差導(dǎo)致。肺炎克雷伯菌CA的比例普遍高于大腸埃希菌，表明此RAST針對肺炎克雷伯菌血流感染存在優(yōu)勢。

本研究中25株CRE在4 h、6 h、8 h的檢出率無明顯差異，表明CRE可提前至4 h判斷。由于CRE菌株對大多數(shù)抗菌藥物均耐藥，因此臨床更關(guān)注CRE快速藥敏結(jié)果為敏感的抗菌藥物的結(jié)果準(zhǔn)確性， 此RAST方法中AK、CN、CIP及CAZ無判斷錯(cuò)誤的情況發(fā)生，僅有1株CTX耐藥的肺炎克雷伯菌在3次藥敏判讀時(shí)均判讀為敏感，可能是由于抑菌圈直徑量取時(shí)，剛好落在敏感折點(diǎn)處發(fā)生錯(cuò)誤，各時(shí)間段CRE藥敏CA的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4 h即可判斷整體抗菌譜。

研究結(jié)果顯示，腸桿菌目細(xì)菌在4 h、6 h、8 h判讀時(shí)藥敏結(jié)果的錯(cuò)誤比例均遠(yuǎn)小于CLSI M52及FDA標(biāo)準(zhǔn)，Jasuja等[15]報(bào)道TZP和CIP存在VME的情況，本研究暫未發(fā)現(xiàn)，可能與菌株數(shù)量有關(guān)，該現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究探討。 ATU是陽性血培養(yǎng)液RAST不可忽視的一部分。一般來說，溫育時(shí)間越短，ATU結(jié)果的比例越高[1,13]，本研究結(jié)果顯示腸桿菌目細(xì)菌在4 h時(shí)的ATU比例最高，6 h、8 h可從17.2%降至6.9%、5.4%。ATU區(qū)域的存在減少了假敏感和假耐藥的情況發(fā)生，降低了VME和ME的比例[15]，但同時(shí)也會(huì)降低CA的比例，過高的ATU比例可導(dǎo)致過多的藥敏結(jié)果留白，降低快速藥敏的準(zhǔn)確性[15]，本研究中ATU比例最高的抗菌藥物其CA比例亦最低。

當(dāng)然，本研究目前仍存在一定缺陷，耐藥菌分析的數(shù)量不多，且未對非發(fā)酵菌及革蘭陽性菌快速藥敏進(jìn)行評價(jià)。有關(guān)陽性血培養(yǎng)液RAST方法學(xué)，目前也仍有一些問題需要探討，如其他血培養(yǎng)常見腸桿菌目細(xì)菌是否可以進(jìn)行RAST、折點(diǎn)如何確立；如何克服抑菌圈量取時(shí)的人工誤差；怎樣將此RAST方法流程合理化，這些問題都有待進(jìn)一步研究解決。

綜上所述，腸桿菌目細(xì)菌血培養(yǎng)陽性標(biāo)本質(zhì)譜快速鑒定準(zhǔn)確性高，參考EUCAST血培養(yǎng)RAST方法，腸桿菌目細(xì)菌血培養(yǎng)標(biāo)本快速藥敏結(jié)果與常規(guī)結(jié)果一致性好，6 h可作為腸桿菌目細(xì)菌RAST藥敏判讀的最佳時(shí)間點(diǎn)，4 h即可判斷是否存在CRE感染并推測其整體抗菌譜。