抗菌藥物快速表型藥敏檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展*

吳秀禎，李姝麗，王志賢，盛長(zhǎng)忠，周澤奇，陳龍(1. 天津市侵襲性真菌病精準(zhǔn)診斷技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津00480；2. 丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津00480；. 天津大學(xué)醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，天津 0084)

隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，臨床上出現(xiàn)越來(lái)越嚴(yán)重的抗菌藥物耐藥問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織已將抗菌藥物耐藥視為“當(dāng)今全球健康、糧食安全和人類(lèi)發(fā)展面臨的最大威脅之一”[1]。導(dǎo)致抗菌藥物耐藥的重要原因之一是抗菌藥物的不合理應(yīng)用。為有效遏制抗菌藥物耐藥性的蔓延，重在實(shí)現(xiàn)感染性疾病的早期精準(zhǔn)診斷與治療，即在病原微生物種屬鑒定的基礎(chǔ)上，根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)(antibiotic susceptibility test，AST)結(jié)果選用抗菌藥物，實(shí)現(xiàn)抗菌藥物的合理應(yīng)用。

目前，國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的AST標(biāo)準(zhǔn)化方法是紙片擴(kuò)散法和稀釋法。紙片擴(kuò)散法是一種半定量藥敏檢測(cè)法，簡(jiǎn)便易行，但不能給出直觀的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，檢測(cè)結(jié)果受多種因素影響。稀釋法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，適用范圍廣，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前，Vitek 2、Microscan Panel、BD Phoenix和Sensititre等商用自動(dòng)化系統(tǒng)被廣泛用于臨床常規(guī)檢測(cè)，珠海迪爾、山東鑫科、上海復(fù)星等企業(yè)也相繼推出了國(guó)產(chǎn)自動(dòng)化藥敏檢測(cè)系統(tǒng)。但上述常規(guī)方法均需要24～48 h從患者樣本中純培養(yǎng)分離出病原微生物，并需要6～72 h完成藥敏試驗(yàn)，總耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)30 h～7 d，且難以應(yīng)用于難培養(yǎng)或生長(zhǎng)緩慢以及少見(jiàn)罕見(jiàn)的病原微生物。而臨床上對(duì)感染性疾病的針對(duì)性治療越早效果就愈好，對(duì)某些急性感染搶救的黃金窗口期僅為12 h。因此，發(fā)展快速藥敏檢測(cè)(rapid antibiotic susceptibility test，RAST)技術(shù)對(duì)臨床醫(yī)療具有重大意義。

目前涌現(xiàn)了多種RAST方法，根據(jù)檢測(cè)原理可分為基因型RAST和表型RAST?；蛐蚏AST，包括PCR、基因芯片和基因測(cè)序技術(shù)等，可通過(guò)鑒定耐藥基因來(lái)間接推測(cè)耐藥的可能性，檢測(cè)快速、靈敏；但其依賴于已知的耐藥基因序列，故不能檢測(cè)新的或不典型的耐藥機(jī)制[2]。表型RAST依賴于以不同的抗菌藥物溫育病原微生物，直接評(píng)估抗菌藥物能否抑制病原微生物生長(zhǎng)，可作為基因型RAST的有效補(bǔ)充。因此，本文就近年來(lái)興起的表型RAST技術(shù)的最新研究進(jìn)展作如下綜述。

1 單細(xì)胞形態(tài)分析技術(shù)

單細(xì)胞形態(tài)分析(single-cell morphological analysis，SCMA)技術(shù)是使用明視野顯微鏡監(jiān)測(cè)系列濃度抗菌藥物作用后單個(gè)病原微生物細(xì)胞的形態(tài)變化，然后采用自動(dòng)圖像處理算法對(duì)捕獲的圖像進(jìn)行處理，獲得生長(zhǎng)細(xì)胞的面積、數(shù)量、長(zhǎng)度等參數(shù)，進(jìn)而通過(guò)圖像分類(lèi)算法計(jì)算得到抗菌藥物的藥敏數(shù)據(jù)的一種技術(shù)。

Choi等[3]設(shè)計(jì)了一種單細(xì)胞形態(tài)分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)檢測(cè)單元由連接到加藥孔的簡(jiǎn)單通道組成，集成為96孔板。檢測(cè)時(shí)，首先將病原微生物樣品懸浮在37 ℃含瓊脂糖的培養(yǎng)液中，加入通道中，當(dāng)溫度降至室溫時(shí)，培養(yǎng)液在通道內(nèi)形成凝膠并固定病原微生物；然后將抗菌藥物溶液加入加藥孔中，約5 min后，抗菌藥物溶液完全擴(kuò)散至凝膠中；最后用60×物鏡在明視野顯微鏡下對(duì)固定的病原微生物進(jìn)行成像，通過(guò)圖像分類(lèi)算法進(jìn)行計(jì)算，可以在3～4 h內(nèi)獲得抗菌藥物MIC值，這與標(biāo)準(zhǔn)的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)方法的一致性達(dá)91.5%。該系統(tǒng)還可用于血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的直接檢測(cè)，從血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)到得到藥敏結(jié)果僅需6 h[4]。Baltekin等[5]使用微流控芯片直接從低細(xì)菌濃度(104CFU/mL)的樣本中捕獲大腸埃希菌，并使用顯微鏡監(jiān)測(cè)單個(gè)細(xì)菌的生長(zhǎng)速率，從加樣到結(jié)果讀出，藥敏試驗(yàn)總時(shí)間小于30 min。該系統(tǒng)已由Astrego Diagnostics公司開(kāi)發(fā)上市(https://astrego.se/technology/)，適用于細(xì)菌和酵母樣真菌的藥敏檢測(cè)。

2 熒光分析技術(shù)

基于熒光分析技術(shù)的抗菌藥物敏感性檢測(cè)需要對(duì)系列濃度抗菌藥物作用后的病原微生物進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后采用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀對(duì)熒光進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得抗菌藥物藥敏數(shù)據(jù)。以下介紹4種主要的熒光分析方法。

2.1非放大數(shù)字成像法 基于所有類(lèi)型細(xì)胞在受到藍(lán)光照射時(shí)都發(fā)出黃綠色熒光這一原理，London等[6]開(kāi)發(fā)了一種非放大數(shù)字成像法，該方法用藍(lán)光照射微生物菌落，并在不放大的情況下將產(chǎn)生的細(xì)胞自身熒光定向到CCD芯片上，然后利用圖像分析軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)微菌落的光照像素簇。該技術(shù)將平板菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)時(shí)間由24 h縮短至5 h。在該技術(shù)的基礎(chǔ)上，F(xiàn)irst Light Diagnostics公司推出了用于微生物鑒別、快速藥敏檢測(cè)、毒素和生物標(biāo)志物檢測(cè)的全自動(dòng)MultiPath平臺(tái)(https://www.firstlightdx.com/)，該平臺(tái)可直接用于臨床樣本的檢測(cè)，通過(guò)靶向特異性熒光DNA探針標(biāo)記和免疫磁珠分離技術(shù)結(jié)合，能在30 min內(nèi)鑒別病原體，在4 h內(nèi)獲得藥敏結(jié)果[7]。

2.2ATP生物發(fā)光法 ATP是主要的生物能量來(lái)源，普遍存在于所有活的生物體中，具有相當(dāng)恒定的含量。通常細(xì)胞在凋亡、壞死或處于一些毒性狀態(tài)下，ATP水平會(huì)下降。因此，可以通過(guò)ATP濃度的測(cè)定，反映微生物的活性和活細(xì)胞的數(shù)量。ATP檢測(cè)的原理是在Mg2+存在和螢火蟲(chóng)熒光素酶的催化作用下，微生物細(xì)胞內(nèi)釋放出的ATP與熒光素反應(yīng)產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與ATP含量成正比，進(jìn)而通過(guò)用熒光分光光度計(jì)測(cè)定的熒光強(qiáng)度來(lái)估算活的微生物數(shù)量。ATP生物發(fā)光法檢測(cè)具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，目前主要用于食品中微生物總數(shù)的測(cè)定[8]。

March-Rosselló等[9]將ATP 生物發(fā)光法用于細(xì)菌RAST檢測(cè)。該方法的檢測(cè)限為103CFU/mL。每次檢測(cè)微生物ATP的時(shí)間可以控制在幾分鐘之內(nèi)，2 h即可獲得MIC值。然而該方法需要先裂解微生物，將ATP釋放到溶液中后再進(jìn)行檢測(cè)，操作較復(fù)雜，且真菌細(xì)胞壁厚，裂解難度較大，可能影響檢測(cè)靈敏度。Sun等[10]使用一種商業(yè)化BacTiter-Glo detection reagent試劑檢測(cè)藥物對(duì)肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等臨床分離株的藥敏活性?？咕幬镒饔煤?，無(wú)需ATP提取，僅需加入該試劑室溫溫育15 min后即可檢測(cè)ATP含量，大大簡(jiǎn)化了操作流程，但該試劑是否適用于真菌藥敏檢測(cè)還有待研究。

2.3刃天青還原法 刃天青是一種藍(lán)色染料，在還原條件下可以轉(zhuǎn)化成一種粉紅色熒光終產(chǎn)物試鹵靈，后者常在細(xì)胞活力測(cè)定中用作氧化還原指示劑。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原狀態(tài)。攝入細(xì)胞內(nèi)的刃天青被這些代謝中間體及細(xì)胞色素類(lèi)還原成試鹵靈后釋放到細(xì)胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無(wú)熒光的靛青藍(lán)變成有熒光的粉紅色，最后用普通分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。利用這種方法，March-Rosselló等[11]在2 h內(nèi)繪制了葡萄球菌、腸球菌和大腸埃希菌的抗菌譜，檢測(cè)限為106～108CFU/mL。Avesar等[12]開(kāi)發(fā)了一種基于刃天青還原法的微流體芯片，可直接檢測(cè)從尿液樣本中分離的細(xì)菌，6 h內(nèi)可獲得MIC值。然而，刃天青的缺點(diǎn)是不被非發(fā)酵革蘭陰性桿菌代謝，因此該方法無(wú)法用于所有病原微生物的藥敏檢測(cè)。

2.4活死細(xì)胞染色法 活死細(xì)胞染色是AST中常用的標(biāo)記方法之一。SYBR Green I是一種滲透性染料，可將所有活細(xì)胞染成綠色，而碘化丙啶(PI)是一種非滲透性染料，只可將細(xì)胞膜受損的死亡或受損細(xì)胞染成紅色。因此，通過(guò)熒光顯微鏡或熒光酶聯(lián)儀測(cè)得綠/紅熒光比值，表征細(xì)胞種群的存活狀態(tài)。Feng等[13]利用SYBR Green染色活細(xì)胞、PI染色死細(xì)胞，在抗菌藥物溫育30 min后，即可檢測(cè)各種快速生長(zhǎng)的病原微生物的藥敏活性，而生長(zhǎng)慢的微生物則需要更長(zhǎng)的溫育時(shí)間。

3 納米機(jī)械傳感技術(shù)

抗菌藥物效應(yīng)可以通過(guò)檢測(cè)微生物的微運(yùn)動(dòng)來(lái)判斷。盡管有些微生物沒(méi)有鞭毛或菌毛，但活菌體通常比死亡菌體表現(xiàn)出更高的內(nèi)在運(yùn)動(dòng)。利用這一原理，將微生物附著在200 μm長(zhǎng)的懸臂上，通過(guò)監(jiān)測(cè)懸臂的運(yùn)動(dòng)來(lái)檢測(cè)抗菌藥物效應(yīng)。Stupar等[14]設(shè)計(jì)了一種納米機(jī)械傳感器，將一束激光聚焦在傳感器表面，通過(guò)接收反射光來(lái)監(jiān)測(cè)懸臂運(yùn)動(dòng)。當(dāng)無(wú)活菌附著在傳感器上時(shí)，波動(dòng)僅由熱運(yùn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)，幅度很??；附著活菌后，波動(dòng)幅度變大；抗菌藥物作用后，敏感性細(xì)菌無(wú)法存活，波動(dòng)恢復(fù)至較低水平。該系統(tǒng)檢測(cè)限為105CFU/mL，在30 min內(nèi)即可完成藥敏檢測(cè)。Villalba等[15]利用納米機(jī)械傳感器對(duì)生長(zhǎng)緩慢的百日咳桿菌進(jìn)行RAST檢測(cè)，8 h內(nèi)即可獲得MIC值。該技術(shù)已由Resistell公司開(kāi)發(fā)上市(https://resistell.com/)。

4 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜技術(shù)是基于拉曼散射效應(yīng)，對(duì)與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。由于拉曼光譜技術(shù)分析速度快、靈敏度高、樣品所需量小，已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)[16]、安檢安防[17]、考古勘探[18]、珠寶文物鑒定[19]、醫(yī)藥[20]檢測(cè)等眾多領(lǐng)域。

在微生物藥敏檢測(cè)領(lǐng)域，由于微生物在抗菌藥物作用后，會(huì)產(chǎn)生一定的生化響應(yīng)，如自身組成變化、代謝產(chǎn)物變化、同化速率變化等。通過(guò)拉曼光譜技術(shù)對(duì)這些變化進(jìn)行檢測(cè)，從而確定抗菌藥物對(duì)微生物是否有效。Karanja等[21]采用受激拉曼散射成像技術(shù)對(duì)白念珠菌菌株中脂肪生成活性進(jìn)行直接成像，可以在5 h內(nèi)區(qū)分敏感菌株和耐藥菌株。Moritz[22]、Kirchhoff[23]、Premasiri[24]等應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)在2 h內(nèi)對(duì)細(xì)菌藥敏進(jìn)行了快速檢測(cè)，但由于譜圖需要利用專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，操作相對(duì)復(fù)雜。Tao等[25]利用拉曼結(jié)合重水標(biāo)記，考察了不同抗菌劑對(duì)細(xì)菌活性的影響，并發(fā)展了基于細(xì)菌代謝活性的最小活性抑制濃度指標(biāo)。檢測(cè)中，重水中氘(D)參與微生物重要生物大分子的合成，從而在拉曼光譜的生物靜默區(qū)出現(xiàn)一個(gè)明顯的C-D峰。根據(jù)C-D峰的強(qiáng)弱及有無(wú)，即可判斷病原微生物對(duì)抗菌藥物的敏感性。

Yang等[26]通過(guò)聯(lián)用單細(xì)胞拉曼和重水標(biāo)記，利用抗菌藥物作用下耐藥菌和敏感菌“飲用”重水活性不同，在僅標(biāo)記重水半小時(shí)后，即可根據(jù)氘相關(guān)拉曼特征峰判斷細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的活性響應(yīng)，篩選出有效抗菌藥物。該方法從接收尿液到報(bào)告藥敏結(jié)果的全流程，可在2.5 h內(nèi)完成，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于尿道感染標(biāo)準(zhǔn)藥敏檢測(cè)方法所需的48 h。由于拉曼可以在單細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)，臨床樣本無(wú)需培養(yǎng)，也無(wú)需染色或標(biāo)記，可直接用于藥敏檢測(cè)，克服了臨床樣本病原微生物數(shù)量少、需要冗長(zhǎng)培養(yǎng)的難題，且適用于不可培養(yǎng)微生物的測(cè)定。這些研究表明拉曼光譜是一種非常有前景的快速藥敏檢測(cè)的工具，該技術(shù)越來(lái)越受到研究者的重視。目前國(guó)內(nèi)已有中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所、威朋(蘇州)醫(yī)療器械有限公司和上海氘峰醫(yī)療器械有限公司等機(jī)構(gòu)從事基于拉曼光譜技術(shù)的微生物快速藥敏設(shè)備的開(kāi)發(fā)。

5 異步磁珠旋轉(zhuǎn)技術(shù)

異步磁珠旋轉(zhuǎn)(asynchronous magnetic bead rotation，AMBR)是一種處于原理驗(yàn)證階段的新型生物技術(shù)。磁珠可在磁場(chǎng)中異步旋轉(zhuǎn)，任何物體黏附在磁珠上，均可改變其旋轉(zhuǎn)速度。當(dāng)微生物通過(guò)正負(fù)電荷吸附作用黏附在磁珠上生長(zhǎng)時(shí)，盡管生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的變化極其微妙，磁珠旋轉(zhuǎn)遭遇的阻力卻發(fā)生了明顯變化，導(dǎo)致磁珠的旋轉(zhuǎn)速度發(fā)生改變。因此，可根據(jù)磁珠旋轉(zhuǎn)速度的變化來(lái)測(cè)定微生物生長(zhǎng)出現(xiàn)的納米級(jí)變化。

Kinnunen等[27-28]設(shè)計(jì)了一種AMBR傳感器。檢測(cè)時(shí)，將已知濃度細(xì)菌細(xì)胞與直徑2.8 μm的磁粒子混合，37 ℃振蕩溫育10 min，再將溶液移入孔板，置于永磁體陣列上方5 min，以誘導(dǎo)磁粒子自組裝到AMBR傳感器中。每個(gè)AMBR傳感器由大約106個(gè)磁粒子組成。光電二極管通過(guò)自阱板底部測(cè)量波動(dòng)光來(lái)檢測(cè)AMBR的旋轉(zhuǎn)周期。當(dāng)黏附在AMBR傳感器上的細(xì)菌開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)，傳感器的旋轉(zhuǎn)周期延長(zhǎng)。AMBR方法可以在大約1.5 h內(nèi)評(píng)估小濃度細(xì)菌的初始生長(zhǎng)情況，檢測(cè)限為5×103CFU/mL。由于微粒對(duì)表面的黏附效應(yīng)影響系統(tǒng)的效率和靈敏度，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性不足。此外，這種設(shè)置較復(fù)雜，目前尚不適用于臨床。

6 微流體技術(shù)

微流體(microfluidic)技術(shù)通過(guò)在芯片上建立一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，利用微米級(jí)通道內(nèi)的少量可控流體，實(shí)現(xiàn)微生物培養(yǎng)、核酸雜交和擴(kuò)增、細(xì)胞裂解等多種功能。與現(xiàn)有的宏觀檢測(cè)方法相比，微流體技術(shù)有助于減少樣品量、簡(jiǎn)化操作流程、縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)靈敏度，并有可能提高整個(gè)系統(tǒng)的適用性。一些研究小組已經(jīng)開(kāi)發(fā)了微流體RAST平臺(tái)，這些設(shè)備可以利用通道、微流體陷阱或水凝膠板產(chǎn)生離散或連續(xù)的藥物梯度[29]。

6.1離散梯度稀釋法 Kim等[30]設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速進(jìn)行RAST的微流體芯片，將標(biāo)準(zhǔn)肉湯微量稀釋法縮小到20 mm×20 mm微流體裝置上。檢測(cè)時(shí)，將含或不含抗菌藥物的細(xì)菌(5×105CFU/mL)懸浮液分別注入2個(gè)加樣孔，通過(guò)變動(dòng)通道的長(zhǎng)度來(lái)改變液體流速，從而產(chǎn)生非連續(xù)的濃度梯度，故稱離散梯度稀釋法。不同濃度的抗菌藥物再進(jìn)入后續(xù)的培養(yǎng)小室，然后使用相差顯微鏡監(jiān)測(cè)各培養(yǎng)小室內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量。利用該平臺(tái)，在3 h內(nèi)可測(cè)定大腸埃希菌菌株對(duì)氨芐青霉素和鏈霉素的MIC值。

6.2連續(xù)梯度稀釋法 Hou等[31]將含有均勻分散細(xì)菌(5×106CFU/mL)的低溫瓊脂糖注射入放置在倒置顯微鏡上方的微流體培養(yǎng)裝置中，凝膠凝固后，將含或不含抗菌藥物的培養(yǎng)基注入凝膠兩側(cè)的2個(gè)通道，形成穩(wěn)定連續(xù)的抗菌藥物梯度，故稱連續(xù)梯度稀釋法。使用CCD相機(jī)拍攝延時(shí)圖像，分析單細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并與溫育時(shí)間繪制成生長(zhǎng)速率曲線，進(jìn)而確定MIC值。使用該裝置可以在2.5～4 h獲得MIC值。該系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是以連續(xù)梯度測(cè)量抗菌藥物的生長(zhǎng)抑制，可以給出更精確的MIC值。

7 總結(jié)與展望

目前，常規(guī)藥敏檢測(cè)和自動(dòng)化技術(shù)仍是當(dāng)今臨床微生物實(shí)驗(yàn)室AST檢測(cè)的主要方法。由于這些方法易于使用，成本相對(duì)較低，預(yù)計(jì)在未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)仍不可或缺。然而，隨著多重耐藥菌感染率與耐藥率的逐年增高，為遏制抗菌藥物耐藥問(wèn)題，提高抗菌藥物合理利用的程度，RAST將是未來(lái)臨床實(shí)驗(yàn)室病原微生物藥敏檢測(cè)的必然趨勢(shì)。理想的RAST應(yīng)能直接用于臨床樣本以及生長(zhǎng)緩慢和不可培養(yǎng)微生物的檢測(cè)；檢測(cè)時(shí)間應(yīng)控制在4 h內(nèi)，以便在同一班次內(nèi)為臨床醫(yī)生提供用藥指導(dǎo)；能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)自動(dòng)化，減少人工操作，提高檢測(cè)效率；高通量檢測(cè)，能夠滿足臨床多樣本同時(shí)檢測(cè)的需求[32]。

本綜述討論的RAST技術(shù)中(見(jiàn)表1)，ATP檢測(cè)需要裂解細(xì)胞，難以適用細(xì)胞壁厚的真菌；刃天青染色法無(wú)法用于所有病原微生物的檢測(cè)；異步磁珠旋轉(zhuǎn)技術(shù)所需設(shè)備較復(fù)雜。這些技術(shù)在RAST領(lǐng)域的應(yīng)用還需要進(jìn)行不斷的技術(shù)改進(jìn)。相比而言，拉曼光譜技術(shù)不但可以在2 h內(nèi)完成藥敏檢測(cè)，而且還能生成微生物唯一的“全生物體拉曼指紋圖譜”用于病原微生物的快速鑒定，可同步實(shí)現(xiàn)病原微生物鑒定和快速藥敏檢測(cè)，將是未來(lái)RAST的主力；微流體技術(shù)將檢測(cè)縮小到一個(gè)很小的芯片上，僅需少量的樣品和試劑就能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，具有高通量、自動(dòng)化的特點(diǎn)，該技術(shù)與其他檢測(cè)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，將有助于開(kāi)發(fā)出新的RAST技術(shù)。

表1 快速表型藥敏檢測(cè)技術(shù)比較

若將拉曼光譜技術(shù)與微流體技術(shù)相結(jié)合，利用微流體技術(shù)產(chǎn)生微量抗菌藥物梯度用于病原微生物的培養(yǎng)，然后利用拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)病原微生物產(chǎn)生的拉曼指紋圖譜，可實(shí)現(xiàn)微生物鑒定和藥敏活性的快速檢測(cè)。該技術(shù)具有所需檢測(cè)樣本量少、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等突出優(yōu)勢(shì)，將成為新一代強(qiáng)大的RAST工具。該技術(shù)一旦成功，可直接用于臨床樣本及血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的檢測(cè)，大大縮短微生物鑒定和藥敏檢測(cè)時(shí)間。

目前，國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化方法主要有美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)發(fā)布的最新抗菌藥物敏感試驗(yàn)方法。為獲得與這些現(xiàn)行金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)一致的藥敏檢測(cè)結(jié)果，RAST新技術(shù)需要不斷在臨床實(shí)驗(yàn)中獲取數(shù)據(jù)，建立新的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。