應用生物信息學分析正常女性不同乳腺密度差異表達基因

徐文秀，蔣夢萍，王丹丹，張 建，吳 旸，張 薇，唐金海

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科，江蘇 南京210029

乳腺癌是女性中最常見的一種惡性腫瘤，同時致死率也居于女性癌癥第1位［1］。乳房鉬靶密度（mammographic density，MD）指的是在乳腺鉬靶中整個乳房中致密組織的百分比，乳房中致密區(qū)域主要是由成纖維細胞、上皮細胞和結(jié)締組織組成的纖維腺乳腺組織［2］。乳腺纖維腺組織在乳腺鉬靶上看起來很致密，而脂肪則顯得稀疏，所以比脂肪組織更能阻擋X射線，因此在乳房鉬靶上顯示為白色［3］。致密的乳腺組織的存在極大增加了患乳腺癌的風險［4］。在1項評估乳房密度為乳腺癌獨立危險因素研究的薈萃分析中，與密集乳房相關的相對風險為：密度為50%～74%的乳房為2.92，密度為75%或更高的乳房為4.64［5］。與低密度乳腺組織相比，致密的乳腺組織還具有更大的DNA損傷反應（DDR）基因表達和較短的端粒長度［6］。這些數(shù)據(jù)表明，MD的增加與乳腺癌風險的增加之間存在很強的正相關性。

近年來，隨著高通量技術的發(fā)展，基因芯片和基因測序的運用已成為研究腫瘤疾病必要且高效的方法。如今是數(shù)據(jù)共享時代，各大數(shù)據(jù)庫中擁有豐富的基因檢測和分析結(jié)果，但缺少精確、有效的數(shù)據(jù)挖掘。越來越多的研究者將目光投到基于生物信息學來分析各種癌癥的分子機制［7-8］。迄今為止很多研究表明致密型乳腺與乳腺癌患病風險增加有關，但尚未發(fā)現(xiàn)一些潛在的差異表達基因，核心基因和相關的信號通路，這可能有助于了解高MD增加乳腺癌發(fā)生的分子機制，并為高MD乳腺癌患者的治療提供候選靶點。本研究從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（NCBIGEO）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載原始的微陣列數(shù)據(jù)集GSE38506并進行分析，以獲取高MD和低MD的正常女性之間的差異表達基因。隨后，為了確定相關的基因和信號通路，進行了基因本體論（gene ontology，GO），京都市基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集途徑分析和蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析。通過生物信息學研究了正常女性不同MD的差異表達基因，為臨床治療和藥物靶標發(fā)現(xiàn)提供了潛在的生物標志物。

1 資料和方法

1.1 資料

NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫是一個公共的存儲高通量基因表達數(shù)據(jù)、芯片和微陣列的數(shù)據(jù)庫，從中下載數(shù)據(jù)集GSEGSE38506進行分析，該芯片數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺，共13例組織樣本，其中包括6位低MD女性以及7位高MD女性的正常乳腺組織樣本。

1.2 方法

1.2.1 鑒定差異表達基因

GEO2R（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）用于鑒定高MD組和低MD組的差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）。在分析結(jié)果中，基因表達的差異用P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的對數(shù)（logFC）表示。此次研究將P＜0.05且|log-FC|＞1的基因納入DEG。

1.2.2 DEGs的GO及KEGG信號通路富集分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，v6.8）［10］對DEG進行GO和KEGG功能注釋和富集分析，發(fā)掘其涉及的相關通路。GO的功能注釋主要分為3部分，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cellular component，CC）。KEGG是一個包含關于基因組、生物途徑、疾病和化學物質(zhì)信息的數(shù)據(jù)庫集合。富集分析的結(jié)果以P＜0.05作為入選標準。

1.2.3 PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建

使用STRING數(shù)據(jù)庫［11］（https：//string-db.org）對DEG蛋白質(zhì)間的相互作用進行分析，構(gòu)建DEG的PPI網(wǎng)絡。綜合得分＞0.4作為相互作用存在的標準。Cytoscape軟件（3.8.0版）是用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡的開源生物信息學軟件平臺［12］，可對STRING數(shù)據(jù)庫得到的PPI信息進一步構(gòu)建。MCODE是Cytoscape中一種用于基于拓撲對給定網(wǎng)絡進行聚類以發(fā)現(xiàn)密集連接區(qū)域的插件［13］，可篩選出PPI網(wǎng)絡中最顯著的模塊。

1.2.4 Hub基因的篩選

使用Cytoscape的CytoHubba插件，用5種分類方法來評估核心基因。先篩選出每種方法分值排名前15位的基因，然后根據(jù)5種方法重疊的基因篩選為Hub基因。

1.2.5 Hub基因的預后分析

Breast Cancer Gene-Expression Miner（bc-GenEx-Miner）數(shù)據(jù)庫是一個收錄乳腺癌數(shù)據(jù)的在線數(shù)據(jù)挖掘工具（http：//bcgenex.centregauducheau.fr/，v4.5），提供了評估乳腺癌基因預后信息，并可將結(jié)果繪制為生存分析曲線圖，分析腫瘤中某特定基因與死亡時間的關系，結(jié)果以95%置信區(qū)間（CI）和危險比來表示［14-15］。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選結(jié)果

通過對基因芯片GSE65652的分析，以P＜0.05且|Log2FC|≥1為標準，共篩選到830個DEG，其中442個為上調(diào)基因，388個為下調(diào)基因，將結(jié)果繪制為熱圖（圖1）和火山圖（圖2）。

圖1 顯著差異基因的熱圖Figure 1 The heat map of DEGs

圖2 所有差異基因的火山圖Figure 2 Volcanic map of all the different genes

2.2 DEG的GO功能富集及KEGG通路分析

然后，使用在線軟件DAVID對這830個DEG進行功能分類。如圖3所示，顯示了GO分析的每個部分的前7個富集分析。對于BP富集分析，結(jié)果表明DEG顯著參與了信號轉(zhuǎn)導（GO：0007165）、GTP酶活性的正調(diào)控（GO：0043547）、固有免疫反應（GO：0045087）、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導（GO：0035556）、細胞黏附（GO：0007155）、MAPK級聯(lián)（GO：0000165）和血管形成（GO：0001525）。對于CC富集分析，本研究表明DEG主要涉及質(zhì)膜（GO：0005886）、質(zhì)膜組成部分（GO：0005887）、細胞表面（GO：0009986）、黏著斑（GO：0005925）、細胞連接（GO：0030054）、細胞骨架（GO：0005856）和核膜（GO：0031965）。此外，在MF的富集分析中，DEG主要富集于ATP結(jié)合（GO：0005524）、肌動蛋白結(jié)合（GO：0003779）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（GO：0008134）、鈣調(diào)蛋白結(jié)合（GO：0005516）、Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子活性（GO：0005088）、酪氨酸激酶活性（GO：0004713）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3激酶活性（GO：0046934）和鳥嘌呤核苷酸交換因子活性（GO：0005085）。KEGG通路分析表明，DEG主要富集在癌癥通路（hsa05200）、PI3K-Akt信號通路（hsa04151）、Rap1信號通路（hsa04015）、神經(jīng)活動配體-受體相互作用（hsa04080）、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)（hsa04810）、癌癥中蛋白多糖（hsa05205）、Ras信 號 通 路（hsa04014）和MAPK信 號 通 路（hsa04010），見圖4。

圖3 DEG的GO富集通路圖Figure 3 Enrichment analysis of GO in DEG hy GO

圖4 DEG的KEGG富集通路圖Figure 4 Enrichment analysis of KEGG in DEG

2.3 PPI網(wǎng)絡建立和模塊分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫對DEG進行PPI分析，節(jié)點代表DEG，邊緣代表DEG之間的相互作用。然后，使用cytoHubba軟件的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡進行分組，形成多個模塊。最終，本研究篩選出最顯著的（評分排名前2位）的模塊（圖5）。

圖5 PPI網(wǎng)絡的排名前2的模塊1（A）和模塊2（B）Figure 5 Top 2 modules of PPI network

2.4 Hub基因篩選

根據(jù)cytoHubba中的5種分類方法，選擇每種排名方法的前15個基因。最終，通過重疊前15個基因來鑒定了5個核心基因，即EGFR、JUN、CDC42、SRC和RAC1（圖6）。

圖6 5種分類方法的韋恩圖Figure 6 Venn diagrams for 5 classifi caticn methods

2.5 Hub基因的預后信息

本研究在bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫中采用生存曲線評價了5個Hub基因在乳腺癌組織中總生存期（OS）的預后價值。在乳腺癌患者中，乳腺癌患者中高 表 達SRC基因的OS更 差（HR=1.16，95% CI：1.07～1.27，P=0.000 7），高表達JUN（HR=0.89，95%CI：0.81～0.97，P=0.006 4）和CDC42（HR=0.87，95%CI：0.79～0.95，P=0.002 4）基因的OS更佳（圖7）。

圖7 Hub基因的Kaplan-Meier生存曲線Figure 7 Survival curves of Hub gene

3 討論

目前，高MD和患乳腺癌的風險增加之間的關聯(lián)是公認的［16-21］。然而，具體發(fā)生和發(fā)展的分子機制仍未充分闡明。隨著高通量測序技術的發(fā)展，在基因組水平探討致密型乳腺的女性易患乳腺癌的分子機制成為可能，進而可以尋找更多的基因靶標。評估乳房鉬靶MD的最常用工具是乳房成像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BI-RADS）［22］。在1項美國佛蒙特州人口研究中，使用BI-RADS乳房密度分類，乳房極致密的女性被診斷出患有乳腺癌的相對風險為4.6（95%CI：1.7～12.6）［23］。

本研究通過生物信息學的方法預測致密型乳腺的女性乳腺癌高發(fā)的潛在治療和預后評估靶點。最終篩選出5個關鍵基因，分別為EGFR、JUN、CDC42、SRC、RAC1。EGFR屬于受體酪氨酸激酶的ErbB家族，主要生理功能是調(diào)節(jié)上皮組織的發(fā)育和體內(nèi)平衡［24］。EGFR經(jīng)常在不同類型的人類癌癥中發(fā)生突變或過表達，是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動因素，并且是目前臨床實踐中采用的多種癌癥療法的靶標［25-26］。JUN屬于激活蛋白-1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子家族，參與許多細胞活動，例如增殖、凋亡、存活、腫瘤發(fā)生和組織形態(tài)發(fā)生［27］。在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用，包括惡性黑色素瘤、鼻咽癌等［28-29］。SRC原癌基因是1種蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，在細胞生長、分裂、遷移和存活信號通路中起關鍵作用［30］。RAC1是小鳥苷三磷酸酶（GTPase）Rho家族的成員，屬于Ras超家族［31］。RAC1定位于染色體7p22，并包含7個外顯子，全長29 kb［32］，對許多細胞活動至關重要，例如吞噬作用、黏附和運動、細胞增殖、軸突和樹突生長以及血管生成［33］。CDC42也是1個與多種人類癌癥相關的小鳥苷三磷酸酶，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞周期進程、遷移/侵襲、腫瘤生長、血管生成和致癌轉(zhuǎn)化有關［34］。此外，在數(shù)據(jù)庫中分析了這5個Hub基因與OS的關系，提示了它們可能在乳腺癌進展中的作用，可能是致密型乳腺癌潛在的診斷和預后生物標志物，但后續(xù)仍需要進一步實驗證實。