細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制及其在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用

王欣悅， 李德冠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300192

細(xì)胞焦亡是一種非典型的程序性細(xì)胞死亡方式，其發(fā)生依賴半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspases)的激活，并伴隨著細(xì)胞膜穿孔和細(xì)胞內(nèi)容物釋放引發(fā)的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡如果發(fā)生在肝癌細(xì)胞等損傷細(xì)胞中，可以加速免疫應(yīng)答，清除損傷細(xì)胞以拮抗病原體的感染；但是如果發(fā)生在肝星狀細(xì)胞等正常細(xì)胞中，就容易擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致正常細(xì)胞大量死亡、組織增生和器官功能衰竭，可見細(xì)胞焦亡在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中具有“雙刃劍”的特征。現(xiàn)圍繞著細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制及其在肝臟疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為此類疾病的防治和新藥開發(fā)提供新的思路。

1 細(xì)胞焦亡的發(fā)現(xiàn)

“細(xì)胞焦亡”這一現(xiàn)象于1992年由Zychlinsky等[1]在弗氏志賀桿菌感染的巨噬細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)。2001年，Cookson首次使用“細(xì)胞焦亡(pyroptosis)”來形容這種細(xì)胞死亡方式[2]。2009年，細(xì)胞死亡命名委員會(huì)根據(jù)細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)改變命名了13種類型，“細(xì)胞焦亡”是第13種死亡方式[3]。在形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞焦亡伴隨著細(xì)胞核固縮、DNA斷裂、細(xì)胞膜氣泡樣凸起，膜上迅速形成12～14 nm的小孔，水分內(nèi)流，細(xì)胞發(fā)生腫脹而膜破裂[4]。在生化上，細(xì)胞焦亡伴隨著caspases的激活，Gasdermin蛋白的切割和IL-1β、IL-18等炎性因子的釋放，其發(fā)生過程為一種新型程序性細(xì)胞死亡方式[5]。

2 細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制

人和鼠細(xì)胞焦亡的發(fā)生均存在三種途徑[6](圖1)。

2.1 依賴caspase-1的細(xì)胞焦亡途徑 病原體表面或核內(nèi)的特殊微生物結(jié)構(gòu)為病原體相關(guān)分子模式，受損宿主細(xì)胞釋放的內(nèi)容物信號為損傷相關(guān)分子模式，二者均可作為刺激原信號被固有免疫細(xì)胞上的模式識別受體識別，發(fā)生寡聚化，組裝成炎性小體[7]。炎性小體募集caspase-1前體，使caspase-1前體蛋白發(fā)生自剪接激活。激活的caspase-1蛋白裂解GSDMD蛋白釋放出31 kD的GSDMD-N片段，這一片段能特異性的識別并結(jié)合細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸和磷脂酰肌醇，從而在細(xì)胞膜上形成大的非選擇性膜孔道，使細(xì)胞膜失去控制物質(zhì)進(jìn)出的能力，細(xì)胞釋放出IL-1β、IL-18等炎性小體，同時(shí)腫脹破裂，發(fā)生細(xì)胞焦亡[8]。

2.2 依賴caspase-11 (caspase-4、5)的細(xì)胞焦亡途徑 在由細(xì)菌脂多糖(LPS)啟動(dòng)的細(xì)胞焦亡中，caspase-11發(fā)生寡聚化后被激活[9]?；罨腸aspase-11切割GSDMD前體釋放出GSDMD-N端P30片段[10]，GSDMD-N片段與細(xì)胞膜上的心磷脂結(jié)合[11]，從而在細(xì)胞膜上穿孔，激活控制小分子進(jìn)出的受體Pannexin-1，打開膜通道P2X7，導(dǎo)致K+和ATP外流，從而促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[12]。在這一焦亡途徑中，雖然caspase-11可以不依賴于caspase-1而直接介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，但是IL-1β前體只能由caspase-1裂解，GSDMD蛋白可被已經(jīng)活化的caspase-1/11/4、5蛋白切割。

注：Death Receptor，死亡受體；Chemotherapy drugs，化療藥物；Virus，病毒；Toxins，毒素；Bacteria，細(xì)菌；Cytochrome c，線粒體細(xì)胞色素c；Apoptosis，細(xì)胞凋亡。

2.3 依賴caspase-3的細(xì)胞焦亡途徑 在化療藥物作用下，腫瘤細(xì)胞中激活的caspase-3可特異性地切割GSDME蛋白，生成具有活性的GSDME-N片段，隨后驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從凋亡轉(zhuǎn)換成焦亡[13-14]；進(jìn)而可以激活抗腫瘤免疫力抑制腫瘤生長[15]。

3 細(xì)胞焦亡與肝臟相關(guān)疾病

據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公開數(shù)據(jù)，中國已經(jīng)有超過五分之一的人口受到肝臟疾病的影響，約有700萬人患有肝硬化，每年新發(fā)肝癌病例為46萬例，中國已成為全球肝臟疾病患者數(shù)量最多的國家[16]。常見的肝臟疾病包括病原體感染等引起的病毒性肝炎、酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、藥物性肝損傷(DILI)，以及肝細(xì)胞癌(HCC)等[17]。細(xì)胞焦亡在肝臟疾病中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)對其研究進(jìn)展總結(jié)如下。

3.1 細(xì)胞焦亡與病毒性肝炎 病毒性肝炎是世界上最常見的慢性病毒感染性疾病，其中HBV和HCV是最常見的感染[18-19]。研究證實(shí)細(xì)胞焦亡在病毒性肝炎發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。

利用 HBV感染HL7702肝細(xì)胞系時(shí)發(fā)現(xiàn)HBV中的X蛋白可以激活依賴caspase-1的細(xì)胞焦亡通路[20]。與未經(jīng)治療的HBV感染者肝臟相比，接受持續(xù)抗病毒治療HBV感染者的肝臟中caspase-1、NLRP3和IL-1β的表達(dá)顯著下調(diào)，肝細(xì)胞內(nèi)mitoROS含量增加，細(xì)胞外基質(zhì)沉積的雜質(zhì)增加[21]，提示HBV感染導(dǎo)致正常肝細(xì)胞發(fā)生了PAMP/NLRP3/caspase-1/IL-1β途徑的細(xì)胞焦亡，阻斷正常肝細(xì)胞的細(xì)胞焦亡可以起到抗HBV的效果。HBV除了引起普通肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，還可以引起肝血竇中的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)等免疫細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，釋放的IL-18、IL-1β等促炎介質(zhì)募集巨噬細(xì)胞清除病原體和損傷細(xì)胞，阻斷疾病進(jìn)程。Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染者中PBMC發(fā)生依賴AIM2/ caspase-1/GSDMD/IL-18通路的細(xì)胞焦亡，進(jìn)而促進(jìn)HBV的免疫清除；但是HBV表面的HBeAg蛋白會(huì)通過NF-κB通路抑制PBMC發(fā)生細(xì)胞焦亡。

Kofahi等[23]用HCV感染Huh-7.5肝細(xì)胞后，在細(xì)胞中檢測到活化的caspase-1和NLRP3，在細(xì)胞外檢測到乳酸脫氫酶。HCV相關(guān)晚期肝硬化患者中的caspase-1和NLRP3的表達(dá)水平也較健康的肝臟樣本高[24]。提示HCV被識別后可以誘導(dǎo)炎性小體NLRP3的組裝，引發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致肝損傷。Alhetheel等[25]研究發(fā)現(xiàn)，HCV通過下調(diào)STAT1和IRF-1的表達(dá)，抑制PBMC中細(xì)胞焦亡通路，阻止PBMC對HCV發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致HCV免疫逃逸，使肝細(xì)胞易受感染。上調(diào)PBMC中的細(xì)胞焦亡，可以加強(qiáng)免疫清除，阻止HCV的侵襲。

3.2 細(xì)胞焦亡與ALD ALD是一種由長期酗酒導(dǎo)致的慢性肝病，其特征是初期表現(xiàn)為脂肪肝，后期肝衰竭，發(fā)生酒精性肝炎并伴隨敗血癥和多器官功能衰竭等并發(fā)癥，其短期病死率很高[26]。肝細(xì)胞焦亡是導(dǎo)致ALD的重要原因，依賴caspase-1和依賴caspase-11的細(xì)胞焦亡途徑均參與了ALD的發(fā)生發(fā)展[27]。Heo等[28]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇代謝產(chǎn)生的FoxO1蛋白導(dǎo)致TXNIP蛋白過表達(dá)；而TXNIP可激活NLRP3 炎性小體和caspase-1細(xì)胞焦亡通路，導(dǎo)致ALD的發(fā)生。Khanova等[29]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)8周乙醇飲食喂養(yǎng)的小鼠肝勻漿中caspase-11和GSDMD的活性明顯增加。乙醇代謝增加了NADH/NAD+的比例，產(chǎn)生的活性氧(ROS)引起NLRP3的組裝，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生依賴caspase-11的細(xì)胞焦亡，引起全身性炎癥反應(yīng)綜合征和敗血癥，危及生命。此外，caspase-11基因敲除可抑制乙醇喂養(yǎng)造成的小鼠肝細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減輕肝臟炎癥和脂肪變性[30]；NLRP3缺陷也可以改善肝脂肪變性和慢性乙醇造成的損傷[31]。這些結(jié)果說明，抑制caspase介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，可以緩解ALD的癥狀[32]。

3.3 細(xì)胞焦亡與NASH NASH是指與酒精濫用無關(guān)的肝臟疾病。高脂飲食、缺乏鍛煉等都可能會(huì)引起非酒精性脂肪肝，其特征為肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性和過度堆積，非酒精性脂肪肝患者會(huì)逐漸發(fā)展為NASH[33]。在NASH的發(fā)生發(fā)展中，細(xì)胞焦亡發(fā)揮著重要的作用。

高脂飲食會(huì)引發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，Ioannou等[34]用膽固醇含量≥0.5%的飲食喂養(yǎng)小鼠時(shí)，在肝巨噬細(xì)胞Kupffer細(xì)胞中檢測到了細(xì)胞焦亡。Koh等[35]發(fā)現(xiàn)，NLRP3基因敲除的小鼠由于缺乏誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡通路的炎性小體，因而避免了高膽固醇飲食導(dǎo)致的NASH。Xu等[36]檢測到NASH小鼠肝組織中GSDMD-N末端片段的表達(dá)上調(diào)，而GSDMD敲除的小鼠表現(xiàn)出較低的脂肪變性和炎癥反應(yīng)。提示膽固醇晶體可激活炎性小體NLRP3，切割生成GSDMD-N誘發(fā)細(xì)胞焦亡，誘發(fā)炎癥。

3.4 細(xì)胞焦亡與DILI DILI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、代謝和免疫等多種因素；表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)發(fā)生大量的肝細(xì)胞壞死和肝功能的迅速喪失，是引起急性肝衰竭的重要原因[37]。細(xì)胞焦亡也參與了DILI的發(fā)生。

對乙酰氨基酚引起的DILI是研究最多的藥物之一。Jaeschke等[38]研究發(fā)現(xiàn)，對乙酰氨基酚的代謝產(chǎn)物可以作為DAMP引起炎性小體NLRP3組裝，從而導(dǎo)致依賴caspase-1的細(xì)胞焦亡發(fā)生，導(dǎo)致DILI。Imaeda等[39]發(fā)現(xiàn)利用阿司匹林等限制DILI中caspase-1的組裝可以抑制細(xì)胞焦亡發(fā)生，進(jìn)而降低肝細(xì)胞的病死率，減輕了肝損傷。

DILI中發(fā)生細(xì)胞焦亡會(huì)加重肝損傷。Xu等[40]研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3特異性抑制劑Ac-DMPD/DMLD-CMK可以降低DILI中肝細(xì)胞的細(xì)胞焦亡發(fā)生，從而減少肝細(xì)胞損傷，緩解DILI。但是由于DILI的發(fā)病機(jī)制是多因素的，宿主因素如年齡、性別、伴發(fā)疾病和藥物、表觀遺傳學(xué)、感染、飲食等其他因素都使其變得更加復(fù)雜，再加上缺乏有效的動(dòng)物模型，人們對DILI的機(jī)制了解甚少，目前細(xì)胞焦亡在DILI中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確[41]。

3.5 細(xì)胞焦亡與HCC 細(xì)胞焦亡對于細(xì)胞本身而言，不利于自身的存活和增殖，但是如果發(fā)生在癌細(xì)胞中則有利于癌細(xì)胞的清除。因此，激活癌細(xì)胞中細(xì)胞焦亡或許能為癌細(xì)胞的治療提供新思路。

在HCC中，肝癌細(xì)胞通過抑制自身的caspase-1途徑防止細(xì)胞焦亡發(fā)生，起到自我保護(hù)的作用。Chen等[42]研究發(fā)現(xiàn)，HepG2肝癌細(xì)胞系中小核仁RNA宿主基因7(small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7)通過靶向microRNA-34a/SIRT1軸抑制細(xì)胞焦亡發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；而敲低SNHG7基因可解除HCC中細(xì)胞抑制自身發(fā)生caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡，從而加劇肝癌細(xì)胞的死亡，抑制體內(nèi)HCC腫瘤的生長。Guo等[43]研究表明，天然異喹啉生物堿小檗堿通過激活caspase-1活化誘導(dǎo)小鼠HCC發(fā)生細(xì)胞焦亡，從而增強(qiáng)HCC小鼠中癌細(xì)胞的免疫清除作用。Wei等[44]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素17β-雌二醇通過上調(diào)NLRP3的表達(dá)誘導(dǎo)HCC發(fā)生依賴caspase-1途徑的細(xì)胞焦亡，阻礙HCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

HCC細(xì)胞還可通過抑制caspase-11和caspase-3的途徑發(fā)揮自我保護(hù)作用。Lozano-Ruiz等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在HCC發(fā)生的早期階段，細(xì)胞會(huì)通過mTOR-S6K1途徑下調(diào)AIM2和caspase-11的表達(dá)抑制自身發(fā)生細(xì)胞焦亡，增加細(xì)胞增殖和集落形成。Wang等[46]發(fā)現(xiàn)，HCC細(xì)胞中caspase-3的活性受到PI3K/AKT/mTOR信號途徑抑制，進(jìn)而抑制細(xì)胞焦亡，刺激HCC細(xì)胞的生長，上調(diào)HCC焦亡通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量。Wang等[47]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HepG2細(xì)胞中的GSDME基因表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M中，從而抑制其細(xì)胞增殖。Liang等[48]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過細(xì)胞內(nèi)ROS積累，誘導(dǎo)caspase-3和GSDME的表達(dá)，導(dǎo)致HepG2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡。

HCC細(xì)胞死亡方式中除細(xì)胞焦亡外，還存在細(xì)胞凋亡等其他死亡方式的疊加和轉(zhuǎn)化[49]。Zhang等[50]發(fā)現(xiàn)從丹參根中分離出的菲醌衍生物Miltirone能激活線粒體固有凋亡通路并通過中心信號軸ROS/ERK1/2-BAX-caspase 9-caspase 3-GSDME誘導(dǎo)HCC細(xì)胞從細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)換成細(xì)胞焦亡。

4 小結(jié)

細(xì)胞焦亡在肝臟疾病中發(fā)揮了“雙刃劍”的作用，如果在治療過程中促進(jìn)損傷細(xì)胞和免疫細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，同時(shí)能抑制正常細(xì)胞的焦亡，或許能起到清除損傷細(xì)胞和保護(hù)正常組織的作用，從而控制肝臟的發(fā)生發(fā)展，提高疾病的治愈率。但是由于肝臟疾病的復(fù)雜性和缺乏有效的臨床模型，該領(lǐng)域還需要更深入的探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王欣悅等負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文；李德冠等負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最終定稿。