大豆酶解蛋白復(fù)合酶組合試驗(yàn)研究

宋士良，陸克文

(上海邦成生物工程有限公司，上海 201506)

大豆酶解蛋白是指大豆或大豆加工產(chǎn)品(脫皮豆粕/大豆?jié)饪s蛋白)經(jīng)酶水解、干燥后獲得的產(chǎn)品[1]。大豆因其蛋白質(zhì)含量高和氨基酸平衡性好而成為動物理想的植物性蛋白源。但大豆直接飼喂動物存在的問題是：大豆蛋白飼料只有75%～80%蛋白質(zhì)被消化，還有20%～25%蛋白質(zhì)被動物排泄掉。究其原因主要是大豆含有大量的抗?fàn)I養(yǎng)因子，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子包括非淀粉多糖(NSP)、大豆抗原蛋白、蛋白酶抑制因子、凝集素、酚類(單寧)、寡糖、植酸、抗維生素因子、致甲狀腺腫因子、皂甙、異黃酮和升氰糖甙等，因此，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子是提高大豆蛋白質(zhì)利用率的有效途徑[2]。消除或鈍化大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法如蒸煮加熱、蒸汽處理、微波處理、烘烤、擠壓膨化、輻照處理等；化學(xué)方法如采用酸堿或其它化學(xué)物質(zhì)處理等；生物方法如使用酶處理、微生物發(fā)酵等。熱不穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子包括蛋白酶抑制因子、凝集素、抗維生素因子、致甲狀腺腫因子等；熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子包括非淀粉多糖、大豆抗原蛋白(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等)、寡糖、植酸、酚類(單寧)、皂甙、異黃酮等[3]。生物酶解法可以通過不同酶制劑進(jìn)行選擇性酶解，被認(rèn)為是降低甚至完全消除大豆蛋白抗原性的有效方法[4]。本試驗(yàn)采用符合GB/T 19541—2017中一級品飼料原料豆粕作為試驗(yàn)材料[5]，經(jīng)擠壓膨化，已去除大部分的熱不穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子。對于熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子主要為非淀粉多糖、大豆抗原蛋白(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等)、寡糖等，本試驗(yàn)采用復(fù)合酶組合進(jìn)行酶解處理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1材料

1.1.1.1原料

豆粕，一級品 (GB/T 19541—2017)，購自舟山中海糧油工業(yè)有限公司，粉碎過30目篩。

1.1.1.2酶制劑

本試驗(yàn)所用酶制劑規(guī)格見表1。

表1 試驗(yàn)所用酶制劑

1.1.2試劑

硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、無水葡萄糖、鹽酸、碘、碘化鉀、乙醇、丙酮、石油醚、重鉻酸鉀、三羥甲基氨基甲烷、2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸、冰乙酸、硫酸、硼酸、硫酸銨、蔗糖、硫酸鉀、三氯乙酸、硝酸、氨水、高氯酸、草酸銨、高錳酸鉀，為國產(chǎn)分析純；酚酞、亞甲基蘭、甲基紅、溴甲酚綠，為指示劑。

1.1.3儀器

本試驗(yàn)所需儀器規(guī)格見表2。

表2 試驗(yàn)所需儀器

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.2緩沖酶液制備

1.2.2.1緩沖酶液(非淀粉多糖酶)

非淀粉多糖酶用0.2 M、pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解，備用。

1.2.2.2緩沖酶液(中性蛋白酶)

中性蛋白酶用0.2 M、pH 7.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解，備用。

1.2.2.3緩沖酶液(非淀粉多糖復(fù)合酶、中性蛋白酶)

非淀粉多糖復(fù)合酶用0.2 M、pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解，中性蛋白酶用0.2 M、pH 7.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解，不足部分用水補(bǔ)足量，備用。

1.2.3酶解試驗(yàn)方法

1.2.3.1非淀粉多糖酶酶解試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取100 g 豆粕原料，加80 ml緩沖酶液(非淀粉多糖酶)至1 L燒杯中置50℃水浴鍋內(nèi)水浴，水浴過程中每隔1 h攪拌處理1次，反應(yīng)時(shí)間6 h，85℃滅酶30 min，70℃鼓風(fēng)干燥(水分≤10% )。

1.2.3.2中性蛋白酶酶解試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取100 g 的豆粕原料，加80 ml緩沖酶液(中性蛋白酶)至1 L的燒杯中置50℃水浴鍋內(nèi)水浴，水浴過程中每隔1 h攪拌處理1次，反應(yīng)時(shí)間6 h，85℃滅酶30 min，70℃鼓風(fēng)干燥(水分≤10% )。

1.2.3.3非淀粉多糖酶、中性蛋白酶酶解試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取100 g 豆粕原料，加80 ml緩沖酶液(非淀粉多糖復(fù)合酶、中性蛋白酶)至1 L燒杯中置50℃水浴鍋內(nèi)水浴，水浴過程每隔1 h攪拌處理1次，反應(yīng)時(shí)間6 h，85℃滅酶30 min， 70℃鼓風(fēng)干燥(水分≤10% )。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1還原糖測定

還原糖的測定按照費(fèi)林試劑比色法[7]。

1.3.2總膳食纖維(TDF)含量測定

總膳食纖維(TDF)含量按照GB/T 5009.88方法測定[8]。

1.3.3肽含量測定

肽含量的測定按照雙縮脲顯色法[9]。

1.3.4大豆抗原蛋白測定

大豆抗原蛋白測定按照酶聯(lián)免疫法[9]。

1.3.5粗蛋白質(zhì)測定

粗蛋白質(zhì)按照GB/T 6432方法測定[10]。

1.3.6酸溶蛋白(三氯乙酸可溶蛋白)測定

酸溶蛋白(三氯乙酸可溶蛋白)按照GB/T 22492中方法測定[11]。

1.3.7粗灰分測定

粗灰分按照GB/T 6438方法測定[12]。

1.3.8鈣測定

鈣含量按照GB/T 6436方法測定[13]。

1.3.9棉籽糖、水蘇糖測定

棉籽糖、水蘇糖是測定按照高效液相色譜法[14]。

1.3.10水分測定

水分按照GB/T 6435方法測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為2次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2016處理后，定量測定數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 非淀粉多糖復(fù)合酶處理豆粕對豆粕中非淀粉多糖含量的影響

非淀粉多糖(NSP)是豆粕中除淀粉外所有碳水化合物的總稱，包括纖維素、非纖維多糖或叫半纖維素性聚合體(包括阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖等)和果膠聚糖等。

2.1.1纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶最佳組合試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)，優(yōu)化纖維素酶(A)、果膠酶(B)、甘露聚糖酶(C)最佳用量組合，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶正交試驗(yàn)組合對豆粕中還原糖釋放量的影響

從表3可見，A、B、C用量的最佳組合為：A2B3C2，即纖維素酶80 U/g、果膠酶180 U/g、甘露聚糖酶40 U/g。

影響因子從大到小依次為果膠酶、甘露聚糖酶、纖維素酶。

2.1.2纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶組合中果膠酶最佳用量試驗(yàn)

從表3可以看出，果膠酶180 U/g用量并非其最佳用量，其最佳用量應(yīng)大于或等于180 U/g，選取果膠酶用量180、200、220、240、260、280 U/g，進(jìn)一步進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶組合中不同果膠酶用量對豆粕中還原糖釋放量的影響

從表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性分析結(jié)果可見，纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶組合中果膠酶的最佳用量為220 U/g。因此，纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶的最佳組合為纖維素酶80 U/g、甘露聚糖酶40 U/g、果膠酶220 U/g。

2.1.3纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶組合中木聚糖酶、β-葡聚糖酶最佳組合試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化木聚糖酶、β-葡聚糖酶最佳用量組合(基礎(chǔ)酶組合纖維素酶80 U/g、果膠酶220 U/g、甘露聚糖酶40 U/g)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 木聚糖酶、β-葡聚糖酶最佳組合對豆粕中還原糖釋放量的影響

從表5可見，A、B用量的最佳組合為：A3B2，即木聚糖酶40 U/g、β-葡聚糖酶20 U/g。影響因子從大到小依次為木聚糖酶、 β-葡聚糖酶。

2.1.4纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶最佳組合處理豆粕對豆粕中非淀粉多糖含量的影響

經(jīng)兩次正交試驗(yàn)優(yōu)化組合，獲得纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的最佳組合為果膠酶220 U/g、纖維素酶80 U/g、甘露聚糖酶40 U/g、木聚糖酶40 U/g、β-葡聚糖酶20 U/g，該組合酶即為非淀粉多糖復(fù)合酶。經(jīng)處理豆粕，測定非淀粉多糖含量(以總膳食纖維，TDF計(jì))，計(jì)算去除率，結(jié)果見表6。

表6 非淀粉多糖復(fù)合酶處理豆粕對豆粕中非淀粉多糖含量的影響

從表6的試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性分析結(jié)果可見，加非淀粉多糖復(fù)合酶處理豆粕對豆粕中非淀粉多糖含量的消除率達(dá)到24.91%(P<0.05)，與豆粕原料相比，有顯著性差異。

2.2 蛋白酶處理豆粕對豆粕中蛋白質(zhì)、大豆抗原蛋白的降解效果

陳星等進(jìn)行不同蛋白酶酶解產(chǎn)物活性大豆肽分子量分布狀態(tài)的研究，結(jié)果表明中性蛋白酶酶解后大豆肽分子量136～32 968 Da，其中分子量≤5 000 Da的占92.53%，分子量≤1 000 Da的占89.54%，是所有試驗(yàn)蛋白酶如單一蛋白酶木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶等，其它復(fù)合蛋白酶如木瓜蛋白酶加堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶加堿性蛋白酶等中處理效果最好的[17]。因此，本試驗(yàn)選用中性蛋白酶作為處理豆粕的蛋白酶，試驗(yàn)其處理豆粕對豆粕中蛋白質(zhì)、大豆抗原蛋白的降解效果。

2.2.1中性蛋白酶處理豆粕對豆粕中肽含量的影響

緩沖酶液(中性蛋白酶)添加用量200、600、1 000、1 400、2 000 U/g，溫度50℃，pH 7.0，反應(yīng)4 h或6 h，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 不同用量中性蛋白酶酶解處理豆粕對豆粕中肽含量的影響

從表7試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性分析結(jié)果可見，添加不同用量中性蛋白酶酶解處理豆粕4 h對豆粕中肽含量的影響有顯著性差異(P<0.05)，添加量越大豆粕中肽含量越高；添加1 400 U/g、2 000 U/g中性蛋白酶酶解處理豆粕6 h對豆粕中肽含量無顯著性差異(P>0.05)；中性蛋白酶添加量1 400 U/g，酶解處理豆粕4 h和6 h，豆粕中肽含量有顯著性差異(P<0.05)；中性蛋白酶添加量2 000 U/g，酶解處理豆粕4 h和6 h，豆粕中肽含量無顯著性差異(P>0.05)。因此，從肽含量分析宜選擇中性蛋白酶添加量1 400 U/g，酶解處理豆粕6 h。

2.2.2中性蛋白酶酶解處理對豆粕中大豆抗原蛋白含量的影響

不同用量中性蛋白酶處理豆粕對豆粕中大豆抗原蛋白含量的影響見表8。

從表8的試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性分析結(jié)果可見，中性蛋白酶添加量1 400 U/g時(shí)，豆粕中大豆球蛋白含量為3.10 mg/g，β-伴大豆球蛋白含量為4.60 mg/g；添加量2 000 U/g處理，豆粕中大豆球蛋白含量為2.80 mg/g，β-伴大豆球蛋白含量為4.30 mg/g；兩者均無顯著性差異(P>0.05)，因此，宜選擇添加量為1 400 U/g，處理6 h。

表8 不同用量中性蛋白酶處理豆粕對豆粕中大豆抗原蛋白含量的影響

中性蛋白酶添加量1 400 U/g酶解處理豆粕6 h，計(jì)算大豆抗原蛋白(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白)去除率，結(jié)果見表9。

表9 豆粕中大豆抗原蛋白的去除率

從表9的試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性分析結(jié)果可見，中性蛋白酶添加量1 400 U/g酶解處理豆粕6 h，大豆抗原蛋白(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白)去除率分別為97.61%(P<0.05)和96.60%(P<0.05)，與豆粕原料相比，有顯著性差異。

2.3 非淀粉多糖復(fù)合酶、中性蛋白酶復(fù)合處理豆粕試驗(yàn)結(jié)果

非淀粉多糖復(fù)合酶(果膠酶220 U/g、纖維素酶80 U/g、甘露聚糖酶40 U/g、木聚糖酶40 U/g、β-葡聚糖酶20 U/g)、中性蛋白酶1 400 U/g，配制成緩沖酶液(非淀粉多糖復(fù)合酶、中性蛋白酶)，溫度50℃，反應(yīng)6 h，滅酶干燥得到大豆酶解蛋白。結(jié)果見表10。

表10 大豆酶解蛋白檢測指標(biāo)

從表10的檢測結(jié)果可見，經(jīng)非淀粉多糖復(fù)合酶、中性蛋白酶復(fù)合處理后大豆酶解蛋白的粗蛋白質(zhì)含量有所提高，酸溶蛋白、肽含量大大提升；非淀粉多糖(以總膳食纖維，TDF計(jì))，大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白，棉籽糖、水蘇糖等含量，脲酶活性大大下降。

3 討論

3.1 非淀粉多糖復(fù)合酶降解豆粕中的非淀粉多糖效果分析

采用非淀粉多糖酶優(yōu)化組合形成非淀粉多糖復(fù)合酶(果膠酶220 U/g、纖維素酶80 U/g、甘露聚糖酶40 U/g、木聚糖酶40 U/g、β-葡聚糖酶20 U/g)，酶解處理豆粕6 h，非淀粉多糖(以總膳食纖維，TDF計(jì))從17.02%下降到12.78%，清除率達(dá)到24.91%。陳乃松等進(jìn)行了酶制劑體外酶解豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究，試驗(yàn)采用4種單一酶制劑(植酸酶、果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶)和3種復(fù)合酶制劑(α-半乳糖甘酶加木聚糖酶，植酸酶加果膠酶加纖維素酶，植酸酶加果膠酶加纖維素酶加α-半乳糖甘酶加木聚糖酶)，最適水解反應(yīng)條件：水分50%、pH4.8～5.0、溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間45 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶對相關(guān)的抗?fàn)I養(yǎng)因子均呈顯出不同程度的協(xié)同降解效應(yīng)[18]。高理想等進(jìn)行了體外模擬消化法優(yōu)化生長豬飼糧非淀粉多糖譜的研究，試驗(yàn)采用纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果膠酶組成非淀粉多糖復(fù)合酶，酶解處理玉米-豆粕型、玉米-雜粕型飼糧，玉米-豆粕型飼糧體外干物質(zhì)消化率提升了3.26%，玉米-雜粕型飼糧體外干物質(zhì)消化率提升了3.75%，間接說明了非淀粉多糖復(fù)合酶對非淀粉多糖(NSP)的有效降解作用[19]。

3.2 蛋白酶降解豆粕中的蛋白質(zhì)、大豆抗原蛋白效果分析

采用中性蛋白酶，添加量1 400 U/g，酶解處理豆粕6 h，肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)從3.38%上升到18.34%。同時(shí)，大豆球蛋白從129.9 mg/g下降到3.10 mg/g，清除率達(dá)到97.61%；β-伴大豆球蛋白從135.1 mg/g下降到4.60 mg/g，清除率達(dá)到96.60%。龔阿瓊等研究了不同酶制劑對豆粕中抗原蛋白的影響，試驗(yàn)采用200 g豆粕，按照料水比5∶4加入一定體積蒸餾水，在25℃條件下再加入一定量的酶制劑，處理24 h后將濕料攪拌均勻，取樣測定抗原蛋白含量。結(jié)果表明，在0.7%的添加量下，堿性蛋白酶對豆粕中的大豆球蛋白降解率為82.3%；在0.6%的添加量下，酸性蛋白酶對豆粕中的β-伴大豆球蛋白降解率為53.6%；在0.5%的添加量下，中性蛋白酶對豆粕中的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白降解率為最高[20]。張忠鑫等研究了不同蛋白酶對豆粕抗原蛋白降解程度的影響，對不同來源蛋白酶降解豆粕后酸溶蛋白、大豆抗原蛋白含量進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶、中性蛋白酶結(jié)合乳酸菌和枯草芽孢桿菌混合酶解發(fā)酵，最終產(chǎn)物中酸溶蛋白含量達(dá)到14.76%，大豆球蛋白含量由245.86 mg/g下降至25.3 mg/g[21]。

3.3 非淀粉多糖復(fù)合酶、中性蛋白酶復(fù)合處理豆粕試驗(yàn)結(jié)果分析

采用非淀粉多糖復(fù)合酶(果膠酶220 U/g、纖維素酶80 U/g、甘露聚糖酶40 U/g、木聚糖酶40 U/g、β-葡聚糖酶20 U/g)，中性蛋白酶1 400 U/g，酶解處理豆粕6 h，獲得的大豆酶解蛋白為粗蛋白質(zhì)49.15%、酸溶蛋白(三氯乙酸可溶蛋白)28.32%、肽含量18.49%、非淀粉多糖11.74%、大豆球蛋白3.4 mg/g、β-伴大豆球蛋白4.9 mg/g、棉籽糖1.00 mg/g、水蘇糖3.20 mg/g、脲酶活性0.01 U/g、粗灰分6.44%、鈣0.44%、水分8.10%。何中山進(jìn)行了豆粕酶解參數(shù)及酶解豆粕飼用效果的研究，結(jié)果表明，采用非淀粉多糖復(fù)合酶(纖維素酶80 U/g、果膠酶160 U/g、甘露聚糖酶40 U/g)，溫度50℃、pH 5.0、反應(yīng)6 h，再加中性蛋白酶500 U/g，溫度50℃、pH 7.0、反應(yīng)4 h，酶解后得到的產(chǎn)品中還原糖為8.18%，蛋白質(zhì)水解度為4.50%[22]。陽艷林等在模擬胃環(huán)境下，先將豆粕與蛋白酶、木聚糖酶、NSP酶在pH值為2.5、溫度在37℃條件下消化1 h,；再在模擬腸環(huán)境下，將胃水解條件調(diào)整為pH7.0、溫度37℃，再消化2 h。結(jié)果表明，NSP復(fù)合酶能顯著促進(jìn)蛋白酶水解豆粕中的蛋白質(zhì)，對降解產(chǎn)物中游離氨基酸含量從17 mmol/L提高到18.2 mmol/L(P<0.05)。游離氨基酸含量越高，說明蛋白質(zhì)消化越多，消化率越高[23]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用非淀粉多糖復(fù)合酶，聯(lián)合中性蛋白酶，酶解處理豆粕，能將大分子蛋白質(zhì)有效降解成小分子肽，能有效清除非淀粉多糖(NSP)、大豆抗原蛋白、寡糖和脲酶等抗?fàn)I養(yǎng)因子，豆粕酶解成大豆酶解蛋白可大大提高蛋白質(zhì)的消化吸收利用率。