大白母豬發(fā)情期前后唾液蛋白組學(xué)分析

李晨雷 齊昆龍 劉鎣珂 葉建偉 李新建 王克君 李秀領(lǐng) 喬瑞敏 韓雪蕾

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046)

在豬生產(chǎn)過(guò)程中，發(fā)情鑒定的準(zhǔn)確性是影響母豬繁殖性能的重要因素。目前采用的發(fā)情鑒定法如外部觀察法、壓背反應(yīng)法和公豬試情法有工作量大、準(zhǔn)確率低等缺點(diǎn)，有些異常發(fā)情如安靜發(fā)情、短促發(fā)情、持續(xù)發(fā)情等情形很難把握配種時(shí)機(jī)，易造成鑒定準(zhǔn)確度不高、異常發(fā)情判斷不準(zhǔn)和重復(fù)配種資源浪費(fèi)的現(xiàn)象[1]，與此同時(shí)各類(lèi)家畜新型發(fā)情鑒定法的研究也從未停止，唾液[2]、血液[3]、尿液[4]等各種體液中差異表達(dá)的生物分子已成為診斷母畜發(fā)情的重要標(biāo)靶。

唾液主要由腮腺、舌下腺和下頜腺三對(duì)唾液腺及口腔黏膜下大量小唾液腺分泌物組成，主要有水和一些非蛋白類(lèi)有機(jī)物(如尿酸、膽紅素、肌酸酐、葡萄糖、脂肪酸等)及一些蛋白類(lèi)或多肽類(lèi)物質(zhì)(如α-淀粉酶、白蛋白、分泌型免疫球蛋白A、富酪蛋白等)，另外，還含有一些激素(如皮質(zhì)醇、睪酮、黃體激素、雌二醇、醛固酮等)和核酸物質(zhì)(如miRNA)等[5-6]，人體內(nèi)絕大多數(shù)的代謝產(chǎn)物、激素和抗體等可經(jīng)過(guò)血液的被動(dòng)擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)等方式進(jìn)入唾液，唾液的成分復(fù)雜而且相對(duì)穩(wěn)定。唾液是動(dòng)物體內(nèi)重要且必需的體液，唾液中含有豐富的類(lèi)固醇激素、DNA等，并含有高分子敏感度的RNA、氧化應(yīng)激標(biāo)志物等成分，近年來(lái)，除了血漿、血清和尿液外，唾液已成為檢測(cè)人類(lèi)和動(dòng)物生理、病理狀態(tài)的有效工具[7]。研究發(fā)現(xiàn)，人的唾液中含有2 000多種不同的蛋白，以及2 000多種低分子量的多肽片段，占分泌蛋白比重的40%～50%[8]，唾液與血液重疊部分蛋白質(zhì)含量約為27%，有40%的蛋白質(zhì)作為腫瘤、心血管疾病等的候選標(biāo)志物被發(fā)掘，在上個(gè)世紀(jì)以前，唾液已被人類(lèi)用于檢測(cè)疾病和健康評(píng)估，呂磊等[9]采用酶聯(lián)免疫法發(fā)現(xiàn)婦女唾液和血液中的E2含量成正比，且與卵泡大小和數(shù)目呈顯著相關(guān)，因此可通過(guò)檢測(cè)唾液E2含量側(cè)面反映血漿游離激素水平，用于臨床實(shí)踐。Lindsay等[10]研究證實(shí)唾液是準(zhǔn)確的臨床指標(biāo)，可以用來(lái)衡量游離型激素的含量并診斷HPA軸的功能不佳。目前唾液檢測(cè)在動(dòng)物中的應(yīng)用，主要在豬病檢測(cè)方面，包括PRRSV、豬流感病毒、豬口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒等病原體的抗原抗體檢測(cè)[11-15]。近年來(lái)，諸多研究證實(shí)，唾液和血液中的激素、藥物、抗體、病毒等的含量具有較高的相似度[16-22]。唾液采集相對(duì)于傳統(tǒng)的血液采集具有明顯的優(yōu)勢(shì)，具有簡(jiǎn)便性、無(wú)創(chuàng)性、樣本易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，同時(shí)在進(jìn)行唾液采集時(shí)，動(dòng)物處于主導(dǎo)地位，與被動(dòng)性的采血相比較能更真實(shí)的反映動(dòng)物機(jī)體的狀態(tài)，可明顯減少動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)[23]。唾液檢測(cè)是無(wú)創(chuàng)檢測(cè)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，具有很大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景，目前通過(guò)唾液蛋白標(biāo)記物對(duì)母豬進(jìn)行發(fā)情鑒定還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究通過(guò)對(duì)大白母豬發(fā)情周期不同階段的唾液樣品進(jìn)行蛋白組學(xué)測(cè)序和分析，以揭示發(fā)情母豬唾液中蛋白質(zhì)水平變化規(guī)律，篩選與發(fā)情相關(guān)的唾液蛋白，為母豬準(zhǔn)確發(fā)情鑒定提供重要參考，并為下一步母豬發(fā)情鑒定試劑盒/試紙條的開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

選取4頭三胎經(jīng)產(chǎn)大白母豬，豬舍類(lèi)型為全封閉豬舍，大圈飼養(yǎng)模式，每圈8～10頭母豬，豬舍內(nèi)溫度控制在15～22 ℃，濕度保持在45%～60%，飼養(yǎng)環(huán)境適宜，繁殖機(jī)能正常，健康無(wú)遺傳疾病。發(fā)情鑒定采用外部觀察法和壓背反應(yīng)法綜合鑒定母豬發(fā)情，在試驗(yàn)期間每天早上、中午和晚上分別對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)肛i進(jìn)行觀察，每次觀察30 min，當(dāng)母豬出現(xiàn)躁動(dòng)不安，食欲減退，陰部充血、腫脹并有粘液分泌和爬跨其他豬等行為時(shí)，在豬鼻上噴灑公豬氣味劑并用力按壓背部，母豬靜立不動(dòng)并弓背豎耳即鑒定為發(fā)情，發(fā)情日當(dāng)天記為第0天。采用咀嚼式方法對(duì)發(fā)情前后生殖激素含量變化明顯的3個(gè)階段進(jìn)行唾液采集[24]，包括發(fā)情前期(PE/Proestrus)：發(fā)情前3天，發(fā)情期(E/Estrus)：發(fā)情當(dāng)天和發(fā)情后期(AE/After estrus)：發(fā)情后3天。唾液采集時(shí)間為每天早上飼喂前(早6：00—早7：30)，4 ℃，4 000 g低溫離心后收集上清液，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，供后續(xù)使用Lable-free定量蛋白組學(xué)技術(shù)進(jìn)行唾液蛋白組測(cè)序。

1.2 樣品消化和酶水解

分別采集4頭經(jīng)產(chǎn)母豬3個(gè)階段的唾液，按不同階段分別轉(zhuǎn)移至3 ku超濾管，4 ℃ 7 000 g離心濃縮，加入1 mL 25 mmol /L ABC,4 ℃ 7 000 g 30 min 離心3次，每次吸取濾膜上層保留的液體(約100 μL)。每份樣本加100 μL SDT裂解液，100 ℃ 金屬浴3 min，離心取上清。于-80 ℃中取出樣本蛋白質(zhì)裂解液，凍融，取1 μL進(jìn)行BCA法定量。根據(jù)定量結(jié)果取20 μg蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳。取各樣品300 μg進(jìn)行FASP酶解。樣品加入200 μL UA buffer(8 mol Urea，150 mmol Tris-HCl pH 8.5)混合搖勻，在室溫下14 000 g離心30 min，棄濾液，此步驟重復(fù)3次。加100 μL IAA(50 mmol IAA in UA)，600 r/min 振蕩1 min，室溫避光300 r/min 孵育30 min，14 000 g 室溫離心30 min。加入100 μL UA buffer后室溫14 000 g離心30 min，重復(fù)3次。然后加100 μL 25 mmol/L ABC，相同條件離心，重復(fù)3次。濾出液棄置后加入40 μL Trypsin buffer(2 μg Trypsin in 40 μL 100 mmol/L ABC)，放置恒溫混勻儀上(300 r/min，18 h，37 ℃)。室溫14 000 g離心30 min，收集濾出液并換新收集管后加入40 μL 100 mmol/L ABC，室溫14 000 g離心30 min，取濾液，OD280肽段定量。

1.3 質(zhì)譜分析

樣品酶解后進(jìn)行毛細(xì)管高效液相色譜脫鹽以及分離，之后使用Orbitrap-Elite 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用自動(dòng)進(jìn)樣器，以150 nL/min的流速將每個(gè)樣品共1 μg上到Thermo Scientific EASY柱(兩柱)上。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜(MS2 scan)的方法采集，MS2 Activation Type:CID，Isolation window：1 m/z，質(zhì)譜儀在正離子模式下運(yùn)行，母離子掃描范圍為300～2 000 m/z。Orbitrap Elite在200 m/z的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜掃描分辨率分別設(shè)置為60 000 at m/z和15 000 at m/z。選取獲得的質(zhì)譜中最強(qiáng)烈的10個(gè)信號(hào)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、蛋白質(zhì)鑒定與定量

LC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)使用的系統(tǒng)為ABSCIEX Triple TOFTM 5 600 plus質(zhì)譜系統(tǒng)，AB SCIEX分析柱，使用標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)譜數(shù)據(jù)流程進(jìn)行分析。

對(duì)于鑒定到的蛋白質(zhì)，蛋白鑒定分值(Unused score)≥1.3(即可信度水平在95%以上)且每個(gè)蛋白至少包含一個(gè)唯一肽段的蛋白定義為可信蛋白。按照LFQ值對(duì)蛋白進(jìn)行Fold Change(FC)計(jì)算，利用Persus軟件(Version1.4.1.3，http:∥www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:start)中Significant A算法對(duì)FC進(jìn)行顯著性參數(shù)PValue計(jì)算。

使用Maxquant軟件進(jìn)行分析，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)由譜峰形式轉(zhuǎn)化為直觀的雙向凝膠圖譜，圖上每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)肽段，通過(guò)比較不同樣本上相應(yīng)肽段的強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量，選擇肽匹配圖譜(PSM)FDR<0.01和肽段 FDR<0.01進(jìn)行篩選[25]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)通過(guò)LFQ值進(jìn)行Fold change(FC)計(jì)算、P Value計(jì)算，并且按照表達(dá)倍數(shù)上調(diào)≥1.5且P<0.05進(jìn)行篩選，使用Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(www.Uniprot.com)進(jìn)行分析，并設(shè)置3個(gè)比較組：E vs AE、E vs PE和AE vs PE。將篩選出來(lái)的差異蛋白進(jìn)行Gene Ontology (GO)功能注釋和KEGG 信號(hào)通路分析，篩選差異蛋白富集的GO功能和KEGG信號(hào)通路，并利用 String數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥string.embl.de/)和Cytoscape(http:∥www.cytoscape.org/)軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白母豬發(fā)情周期唾液蛋白質(zhì)鑒定

通過(guò)對(duì)發(fā)情周期3個(gè)階段的唾液蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別得到2 205、1 918和2 104個(gè)肽段，共鑒定出405個(gè)蛋白，其中PE、E和AE分別有290、191和318個(gè)蛋白質(zhì)(表1)，分子量分布主要在 10～20 ku、20～30 ku、30～40 ku、40～50 ku、50～60 ku的范圍內(nèi)，占總蛋白的73.43%，其中有78.27% 被鑒定的蛋白有3個(gè)及以上的肽段(圖1(a)和(b))。對(duì)鑒定到的405個(gè)唾液蛋白進(jìn)行蛋白聚類(lèi)分析，其中PE、E和AE 3個(gè)階段共有蛋白數(shù)量為149個(gè)，PE和E，PE和AE，E和AE階段共有蛋白的數(shù)量分別為8、79和9個(gè)，PE、E和AE分別有54、25和81個(gè)特異蛋白(圖2和3)。

(a)不同分子量的肽段數(shù)量；(b)可識(shí)別不同肽段的蛋白質(zhì)數(shù)量(a)The number of peptides with different molecular weight;(b)The number of proteins recognizing different peptides圖1 發(fā)情周期唾液蛋白質(zhì)鑒定與分析Fig.1 Identification and analysis of salivary proteins during the estrus cycle

圖2 發(fā)情周期唾液蛋白聚類(lèi)熱圖Fig.2 Heat map of salivary protein clustering during estrus cycle

圖3 發(fā)情周期唾液蛋白鑒定韋恩圖Fig.3 Quantitative Wayne diagram of salivary protein during estrus cycle

表1 發(fā)情周期不同階段唾液蛋白統(tǒng)計(jì)與分析Table 1 Statistics and analysis of salivary protein in different stages of estrous cycle

2.2 大白母豬發(fā)情周期唾液差異蛋白的篩選與分析

對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行差異顯著性分析，共得到45個(gè)差異蛋白質(zhì)，如圖4所示，在E vs PE 組，有18個(gè)蛋白差異達(dá)到顯著水平，包括6個(gè)上調(diào)和12個(gè)下調(diào)蛋白(P<0.05)；E vs AE組，有17個(gè)差異顯著蛋白，包括8個(gè)上調(diào)和9個(gè)下調(diào)蛋白(P<0.05)；在PE vs AE組中，共有10個(gè)蛋白差異達(dá)到顯著水平，其中包括9個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)蛋白(P<0.05)。

圖4 發(fā)情周期唾液差異蛋白聚類(lèi)熱圖Fig.4 Heat map of salivary differential proteins in estrus cycle

2.3 大白母豬發(fā)情周期唾液差異蛋白GO和KEGG富集分析

對(duì)篩選出的45個(gè)差異顯著蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，其參與富集顯著的GO條目主要涉及分子功能和細(xì)胞過(guò)程，包括小分子結(jié)合、急性時(shí)相反應(yīng)、內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控、DNA損傷后內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控等；參與的細(xì)胞組分有胞外區(qū)，胞外區(qū)包含垂體促性腺激素復(fù)合物等(P<0.05)，KEGG通路主要包括胰高血糖素信號(hào)通路、丙酸代謝、丙酮酸代謝、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)和光轉(zhuǎn)導(dǎo)等(P<0.05)，結(jié)果如表2和3所示。

表2 發(fā)情周期唾液差異蛋白GO富集分析Table 2 Go enrichment analysis of salivary differential protein during estrus cycle

表2(續(xù))

表2(續(xù))

2.4 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步揭示篩選到的差異蛋白功能，利用Cytoscape軟件對(duì)富集的差異和特異蛋白進(jìn)行蛋白互作分析，結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)1SFI7與P79263、Q29549、F1SS24、Q9GMA6，Q9GMA6與Q2EN74、Q29549、F1SS24，F(xiàn)1SS24與Q29549間均存在互作關(guān)系，其中F1SFI7和 Q9GMA6蛋白間互作最強(qiáng)。

3 討 論

母豬發(fā)情周期除受到溫度、光照和營(yíng)養(yǎng)水平等外因的影響外，也與神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等內(nèi)因密切相關(guān)。眾所周知，雌激素、孕激素、促黃體生成素、促卵泡素等均與發(fā)情有關(guān)。激素在體內(nèi)通常以與受體蛋白結(jié)合的形式發(fā)揮作用。在發(fā)情周期的不同階段，參與激素調(diào)控的蛋白不同，在生物體中，蛋白質(zhì)并不是獨(dú)立存在的，不同蛋白質(zhì)通過(guò)彼此間相互作用共同行使功能，因此對(duì)激素相關(guān)蛋白質(zhì)間互作及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，對(duì)于揭示發(fā)情周期調(diào)節(jié)機(jī)理具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)大白母豬發(fā)情周期前后唾液蛋白組進(jìn)行測(cè)序和分析，共篩選到45個(gè)顯著差異蛋白和160個(gè)特異蛋白，通過(guò)功能注釋與分析篩選出F1SFI7、P79263、Q29549、F1SS24、Q9GMA6、Q2EN74和P00336 7個(gè)潛在的與發(fā)情過(guò)程密切相關(guān)的唾液激素蛋白，其中Q9GMA6和F1SS24為PE期的特異蛋白質(zhì)，Q2EN74為E期的特異蛋白質(zhì)，F(xiàn)1SFI7、P00336和Q29549為E期顯著上調(diào)的差異蛋白，P79263為PE期顯著上調(diào)的差異蛋白。

α-2-HS-糖蛋白(F1SFI7)，別名胎球蛋白由AHSG編碼，它的主要功能是參與骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。在Qiu等[27]的研究中指出雌激素通過(guò)與c-Jun/c-Fos異二聚體間接結(jié)合ERα與-1488/-1482 AP-1結(jié)合元件激活A(yù)HSG的轉(zhuǎn)錄；Eichner等[28]研究了不同等位基因AHSG對(duì)定量雌激素、雌酮和雌二醇的影響，結(jié)果表明AHSG的2個(gè)主要等位基因?qū)е?種表型，不同表型導(dǎo)致不同的雌二醇和雌酮含量，這些研究表明AHSG與雌激素濃度顯著相關(guān)。簇蛋白(Q29549)由CLU編碼，它的主要功能是作為細(xì)胞外伴侶，防止非天然蛋白質(zhì)聚集。Cappelletti等[29]和Toffanin等[30]研究證明CLU的沉默或下調(diào)可以使乳腺癌細(xì)胞恢復(fù)對(duì)托瑞米芬(抗雌激素)的敏感性，雌激素受體做為一種蛋白質(zhì)分子，比較多的存在于靶器官的細(xì)胞內(nèi)，如卵巢和子宮，雌激素與雌激素受體發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而使雌激素發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，蛋白互作分析顯示AHSG和CLU間存在互作關(guān)系，蛋白定量結(jié)果表明其表達(dá)模式也相同，均在E期顯著性上調(diào)(P<0.05)，推測(cè)AHSG和CLU相互作用影響雌激素濃度或雌激素受體的敏感性。鈣調(diào)蛋白(F2Z5G3)由STPG4編碼，其與鈣介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，在Lu等[31]研究中指出，F(xiàn)2Z5G3是cAMP信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路的信號(hào)分子，其下調(diào)會(huì)抑制P4(孕酮)的分泌，同時(shí)上調(diào)雌二醇的合成，雌二醇與孕酮是由卵巢、胎盤(pán)與腎上腺分泌的激素，在特定生理階段具有拮抗作用，因此推測(cè)F2Z5G3可能通過(guò)cAMP信號(hào)通路調(diào)控雌二醇和孕酮的表達(dá)從而影響發(fā)情表現(xiàn)。

抗胰凝乳蛋白酶(Q9GMA6)由SERINA3-2編碼，SERPINs(絲氨酸蛋白酶抑制劑家族)參與調(diào)節(jié)蛋白酶的活性，賈銀海等[32]和Fu等[33]研究表明SERPINs家族中的SERPINA14和SERPINA3-1等參與調(diào)節(jié)卵泡細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和卵泡的發(fā)育，因此,推測(cè)SERPINA3-2可能與卵泡的發(fā)育有關(guān)。α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(P79263)由ITIH4編碼，它的主要功能是參與創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)，Patil等[34]研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)多囊卵巢綜合征(PCOS)的蛋白組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，ITIH4在多囊卵巢綜合征患者的卵泡液中呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，其在血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定中起作用，對(duì)卵泡成熟至關(guān)重要。本研究蛋白互作分析結(jié)果顯示ITIH4和SERINA家族與AHSG之間存在互作關(guān)系，并且SERINA家族和AHSG之間相互作用關(guān)系最強(qiáng)，前者影響卵泡發(fā)育，后者與雌激素濃度顯著相關(guān)，蛋白定量結(jié)果表明SERPINA3-2為PE期的特異蛋白質(zhì)，ITIH4在PE期顯著性上調(diào)并且AHSG在E期顯著上調(diào)(P<0.05)，因此，推測(cè)這些蛋白在卵泡發(fā)育過(guò)程中可能通過(guò)影響雌激素合成從而影響母豬的發(fā)情。乳酸脫氫酶(P00336)由LDHB編碼，其主要功能是將丙酮酸發(fā)酵為乳酸，除了已被證實(shí)在調(diào)節(jié)糖酵解方面有作用以外，Marianna等[35]通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者的卵泡液代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LDHB的表達(dá)與卵母細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)，Poulsen等[36]對(duì)人體排卵過(guò)程中卵泡液成分蛋白組學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)LDHB在整個(gè)排卵期的表達(dá)具有顯著變化，并在排卵12～17 h后達(dá)到高峰，蛋白定量結(jié)果表明LDHB在E期顯著上調(diào)(P<0.05)，這與Poulsen等的研究相符。卵泡液主要由卵泡細(xì)胞分泌，促卵泡激素可直接促進(jìn)竇前卵泡和竇狀卵泡顆粒細(xì)胞的增殖與分化，使卵泡液分泌增加進(jìn)而維持卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，促卵泡素和促黃體生成素發(fā)揮重要作用，其中促黃體生成素可以促進(jìn)雄激素分泌，雄激素可為雌激素的合成提供底物，促進(jìn)卵母細(xì)胞的排出，因此推測(cè)LDHB與促黃體素和雌激素的生成有關(guān)，從而影響發(fā)情。

綜上所述，通過(guò)對(duì)發(fā)情周期不同階段唾液蛋白進(jìn)行分析，其中AHSG、CLU和LDHB在E期顯著性上調(diào)，SERPINA3-2為PE期的特異蛋白并且ITIH4在PE期顯著上調(diào)，推測(cè)AHSG和CLU相互作用影響雌激素生成或雌激素受體的敏感性，LDHB與促黃體素和雌激素的生成有關(guān)，ITIH4和SERPINA3-2可通過(guò)影響卵泡的發(fā)育和成熟從而調(diào)控發(fā)情，還需要后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證，下一步將針對(duì)篩選出的候選蛋白進(jìn)行抗原抗體制備和配對(duì)檢測(cè)，ELISA試劑盒檢測(cè)方法構(gòu)建，試紙條檢測(cè)和分析等實(shí)驗(yàn)，對(duì)篩選到的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，為開(kāi)發(fā)發(fā)情鑒定試劑盒并在生產(chǎn)中推廣和應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究采用Lable-free定量蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)經(jīng)產(chǎn)大白母豬發(fā)情期及發(fā)情前后3個(gè)階段的唾液蛋白組進(jìn)行測(cè)序與分析，篩選到F1SFI7、Q29549、Q2EN74、Q9GMA6、P00336、P79263和F2Z5G3 7個(gè)蛋白作為指示發(fā)情的潛在候選蛋白，為下一步發(fā)情鑒定試劑盒/試紙條的開(kāi)發(fā)提供借鑒。