Hippo信號通路調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)行為的研究進(jìn)展

王鈺靜，王惠寧，2

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周科，浙江 溫州325027

牙周炎是口腔常見病之一，發(fā)病率高達(dá)80%以上，可導(dǎo)致牙周附著喪失、牙槽骨吸收、牙齒松動等，已成為成人牙齒脫落的主要原因，同時，其作為心腦血管疾病、糖尿病等全身性疾病的影響因素，危害全身健康[1-2]。此外，修復(fù)治療和正畸矯治過程中的不良因素亦可導(dǎo)致牙槽骨吸收、牙齦退縮等牙周組織完整性破壞現(xiàn)象[3-4]。目前臨床上以去除病因、牙周潔治術(shù)、刮治術(shù)及口腔衛(wèi)生指導(dǎo)等基礎(chǔ)治療作為牙周疾病的主要治療方法，但對于重度牙周炎患者牙周支持組織的過度喪失尚缺乏有效的治療手段。

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）是存在于牙周組織中一種具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞，具有成骨、成脂、成纖維、成牙骨質(zhì)等多向分化的潛能[5-6]。此外，其具有增殖與分化能力，近年來已成為牙周組織重建、再生和骨組織工程的潛在種子細(xì)胞[6]。因此，探討PDLSCs增殖、凋亡、衰老、分化等生物學(xué)功能及其影響因素和具體機(jī)制可豐富牙周再生臨床應(yīng)用的理論基礎(chǔ)，為牙周疾病所致牙周支持組織破壞的治療提供新思路。

1 Hippo信號通路

Hippo信號通路最初是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一條對組織器官生長有重要調(diào)控作用的激酶鏈，因其關(guān)鍵基因hpo突變所致的河馬樣器官增大的表型而得名[7]。科學(xué)研究陸續(xù)證實(shí)，果蠅中該通路的核心分子具有進(jìn)化保守的調(diào)控功能，在哺乳動物體內(nèi)表現(xiàn)為功能相似的同源物[8-10]。Hippo信號通路由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成，其中哺乳動物體內(nèi)該通路的核心蛋白激酶包括：①M(fèi)ST1/2（mammalian sterile 20-like 1/2 kinases）或STK4/3（serine/threonine kinase 4），通過磷酸化其下游的蛋白激酶發(fā)揮作用；②SAV1（Salvador 1），通過與MST1/2形成復(fù)合物促進(jìn)其下游蛋白磷酸化；③LATS1/2（large tumor suppressor homolog 1/2），通過磷酸化和抑制下游效應(yīng)因子發(fā)揮作用；④MOB1A/B（MOB kinase activator 1A/B），與LATS1/2形成復(fù)合物促進(jìn)下游效應(yīng)因子磷酸化。轉(zhuǎn)錄因子則主要包括：①YAP/TAZ，為果蠅中Yki的同源基因，是Hippo通路下游關(guān)鍵效應(yīng)因子。YAP在哺乳動物中表現(xiàn)為YAP1和YAP2兩種亞型，其中YAP1為細(xì)胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，通過基因的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)在促進(jìn)組織再生、維持干細(xì)胞更新等各種生物效能中發(fā)揮作用[11-13]。TAZ則為具有PDZ基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子；②TEAD1-4（TEA domain family transcription factors 1-4），其中TEAD-2位于細(xì)胞核內(nèi)，可通過與YAP形成復(fù)合物，共同激活參與促進(jìn)增殖及抑制凋亡的基因表達(dá)。

Hippo信號通路以其調(diào)節(jié)器官大小的功能而聞名，研究證實(shí)Hippo激酶級聯(lián)或上游調(diào)節(jié)因子的失活導(dǎo)致各種器官的過度生長[14]。隨著研究逐步深入，不少關(guān)于Hippo信號通路在組織再生、干細(xì)胞功能等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用的報(bào)道引起了廣泛關(guān)注[15]。越來越多的證據(jù)表明，Hippo信號通路廣泛表達(dá)于各類干細(xì)胞譜系中，且在牙周膜細(xì)胞中也存在特異性表達(dá)。PDLSCs作為上述兩類細(xì)胞的“交集”，在其增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程中Hippo也扮演了重要角色（見表1）。生理狀態(tài)下，Hippo信號沉默時，細(xì)胞內(nèi)YAP處于激活狀態(tài)，可進(jìn)入細(xì)胞核與核因子TEAD結(jié)合共同激活細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。而來自細(xì)胞微環(huán)境中的機(jī)械信號、氧化應(yīng)激、其他調(diào)節(jié)因子等各類應(yīng)激狀態(tài)可條件性激活MST1/2，進(jìn)而募集SAV1逐級磷酸化LATS1/2及MOB1A/B，形成復(fù)合體最終在轉(zhuǎn)錄水平上多位點(diǎn)磷酸化下游效應(yīng)因子YAP/TAZ，進(jìn)而使其局限在細(xì)胞質(zhì)中泛素化降解（見圖1），從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細(xì)胞增殖及成骨相關(guān)基因表達(dá)、抑制成脂基因表達(dá)[16-18]。

表1 Hippo信號通路相關(guān)組分參與牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控

圖1 經(jīng)典Hippo信號通路作用機(jī)制簡圖

2 Hippo信號通路與PDLSCs增殖-凋亡平衡

研究證實(shí)，PDLSCs在體內(nèi)外均有一定的增殖能力，且其體外克隆增殖能力較牙髓干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更強(qiáng)[19]。已有證據(jù)表明其增殖能力與多種因素相關(guān)，主要包括機(jī)械負(fù)荷、白細(xì)胞介素10（interleukin-10, IL-10）及白細(xì)胞介素11（interleukin-11, IL-11）、缺氧、生長因子的參與等[20-23]。近年研究顯示Hippo信號通路中多種組分的沉默和激活在其中參與了各類干細(xì)胞增殖活性的調(diào)節(jié)[24]，包括MST1/2、LATS1/2、MOB1等。然而，目前對于PDLSCs的研究則集中于轉(zhuǎn)錄因子YAP/TAZ。

WEN等[25]通過構(gòu)建增強(qiáng)綠色熒光蛋白慢病毒載體下調(diào)人PDLSCs中YAP的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明YAP的下調(diào)可使細(xì)胞滯留于G1期從而抑制人PDLSCs的增殖活性。同時，JIA等[26]通過激活人PDLSCs中YAP過表達(dá)，證實(shí)過表達(dá)YAP可使細(xì)胞增殖活力提高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示YAP在人PDLSCs的增殖-凋亡平衡中具有調(diào)控作用。此外，YAP的下調(diào)抑制Erk、Bcl-2信號通路相關(guān)因子表達(dá)，而其上調(diào)則對上述通路有促進(jìn)作用。已有研究證實(shí)Erk及Bcl-2信號通路參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[27]，提示二者可與Hippo信號通路互相作用共同調(diào)節(jié)人PDLSCs的增殖，但具體機(jī)制尚未見相關(guān)研究闡述。此前，HüLTER-HASSLER等[28]對生物力學(xué)應(yīng)變下的人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖進(jìn)行了研究，證實(shí)該進(jìn)程中YAP核向轉(zhuǎn)移，且抑制Erk1/2所致YAP活性下調(diào)的現(xiàn)象亦揭示了YAP是一種通過MAPK非依賴性途徑調(diào)節(jié)增殖的因子。以上研究提示YAP的表達(dá)可能受到包括Hippo信號通路在內(nèi)的多種信號通路的共同調(diào)節(jié)。

此外，MST1/2已被證明是促凋亡激酶，可在凋亡信號下活化，通過參與細(xì)胞氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]，但目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道其在PDLSCs中的調(diào)節(jié)作用。

3 Hippo信號通路與PDLSCs衰老

目前Hippo在PDLSCs衰老方面的研究多為表型研究，WEN等[25]下調(diào)人PDLSCs中YAP表達(dá)水平后，衰老特異性染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)其衰老程度加重。為增加人PDLSCs的利用來源，已有研究就其永生化細(xì)胞系的建立和機(jī)制進(jìn)行了探索。CHEN等[30]通過轉(zhuǎn)染含有端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因（telomerase reverse transcriptase, TERT）的慢病毒建立了可多次傳代的人牙周膜永生化干細(xì)胞系（TERT-hPDLSCs），同時對YAP在其中的作用進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)加入抑制YAP與TEAD結(jié)合的抑制劑Verteporfin時，TERThPDLSCs的增殖率減少，凋亡率和衰老率明顯增加，提示YAP在介導(dǎo)永生化PDLSCs中可能發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚缺乏進(jìn)一步探究。

4 Hippo信號通路與PDLSCs多向分化

在生理?xiàng)l件下，PDLSCs處于靜息狀態(tài)，以維持牙周膜細(xì)胞的更替和穩(wěn)定的功能，當(dāng)牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)等牙周支持組織發(fā)生破壞和喪失時，PDLSCs可分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等參與缺損修復(fù)，其分化方向受到多種轉(zhuǎn)錄因子、信號通路及干細(xì)胞巢微環(huán)境的調(diào)控。目前研究顯示，Hippo信號通路主要通過調(diào)節(jié)成骨分化和成脂分化參與PDLSCs的分化過程，在成纖維及成牙骨質(zhì)方向尚未見相關(guān)研究。

LIN等[31]通過構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染α-降鈣素基因相關(guān)肽（α-calcitonin gene related peptide,α-CGRP）在人PDLSCs中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其成骨表型ALP、Col-1及RUNX2的上調(diào)趨勢與YAP相一致，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞成骨。此前已有研究[32-34]證實(shí)α-CGRP可刺激成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化和成熟，且Hippo信號通路在CGRP過表達(dá)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中起作用，提示CGRP可能通過Hippo-YAP信號介導(dǎo)人PDLSCs的成骨分化，但具體調(diào)控水平和機(jī)制尚待研究。TAO等[35]通過建立TNF-α誘導(dǎo)的牙周炎模型并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YAP1的過表達(dá)可改善TNF-α誘導(dǎo)的人PDLSCs凋亡，并促進(jìn)PDLSCs的分化，尤其是成骨分化，提示YAP可能是牙周炎治療的潛在靶點(diǎn)。JIA等[36]對YAP調(diào)節(jié)人PDLSCs的多向分化能力機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)YAP可能通過調(diào)節(jié)LRP6和DVL3等Wnt信號通路上游蛋白促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，同時抑制成脂分化。此前，Wnt/β-catenin信號通路已被證實(shí)可增強(qiáng)干細(xì)胞的成骨分化，抑制干細(xì)胞的成脂分化，其潛在蛋白結(jié)合位點(diǎn)為MOB1[37-38]，提示YAP在調(diào)控PDLSCs的分化方向過程中受多種機(jī)制的調(diào)節(jié)作用。

此外，目前也有部分研究證實(shí)Hippo信號通路在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的PDLSCs成骨分化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，為正畸矯治過程中的生物學(xué)基礎(chǔ)及導(dǎo)致的牙周損傷提供了新的見解。近期，WU等[39]通過高通量測序檢測PDLSCs受拉伸應(yīng)力組和非拉伸應(yīng)力組牙周膜細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜，預(yù)測Hippo信號通路中YAP1、TEAD2、LATS1、TEAD1等為差異表達(dá)的miRNAs的靶基因。SUN等[40]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)正畸移動牙齒14 d后，大鼠骨細(xì)胞、骨基質(zhì)及PDLSCs中可見YAP和TAZ，其表達(dá)量與正畸力呈正比，且通過雙標(biāo)記熒光染色發(fā)現(xiàn)TAZ可通過RUNX2調(diào)節(jié)骨組織重塑，提示Hippo-TAZ-RUNX2在牙槽骨改建中可能發(fā)揮重要作用[41-42]。YANG等[43]通過施加循環(huán)拉伸應(yīng)力模仿正畸力處理牙周膜細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)YAP核易位明顯增加，且敲除YAP基因及加入YAP抑制劑均可抑制成骨作用，提示YAP在拉伸應(yīng)力過程中被激活且調(diào)控PDLSCs的成骨分化。同時，研究通過體外建立小鼠正畸牙齒移動模型證明YAP在張力側(cè)牙周膜細(xì)胞中上調(diào)，表明Hippo-YAP信號通路可能在牙周膜重建中發(fā)揮重要作用。此外，有研究表明，miR-135b-5p可通過控制Hippo信號通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子LATS1和MOB1B的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，從而導(dǎo)致Hippo信號通路的激活[44]，但在PDLSCs中的作用尚待進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

目前臨床上在牙周疾病的治療過程中，對于嚴(yán)重的上皮附著喪失、牙槽骨吸收的病例尚缺乏有效的治療手段，被逐步破壞的牙周組織將對患者生活質(zhì)量、全身健康造成影響。因此，探索一種能夠修復(fù)和重建損失的牙周組織的治療手段應(yīng)為目前值得關(guān)注的研究方向。PDLSCs作為牙周膜細(xì)胞中少量能夠分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞的成體干細(xì)胞，對于牙周組織的再生具有重要意義，但調(diào)控其增殖、凋亡及多向分化的機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未被完全闡明，且體外傳代培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)量受到衰老的限制，目前在臨床應(yīng)用方面具有一定限制。

雖然存在挑戰(zhàn)，但Hippo信號通路關(guān)鍵蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子在其中的應(yīng)用和研究具有廣闊的發(fā)展前景，已有研究表明Hippo信號通路在促進(jìn)PDLSCs的成骨分化及增殖中發(fā)揮重要調(diào)控作用，且體外研究證實(shí)Hippo-YAP的表達(dá)可改善牙周炎誘導(dǎo)的大量細(xì)胞凋亡。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)Hippo信號通路對PDLSCs生物學(xué)功能的研究可在細(xì)胞和組織層面為修復(fù)缺損牙周結(jié)締組織和骨組織的治療提供新的思路和理論依據(jù)。