驅(qū)動(dòng)基因陰性非小細(xì)胞肺癌患者新輔助免疫治療手術(shù)后預(yù)后的影響因素

姚磊 顏巍 閆宇博 郭元杰 徐世東

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1胸外科肺部病區(qū)，2消毒供應(yīng)中心（哈爾濱 150081）；3阿勒泰地區(qū)人民醫(yī)院胸外科（新疆阿勒泰 836500）

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是在腫瘤組織中存在的一群具有抗腫瘤作用的淋巴細(xì)胞群體，其中CD8+T細(xì)胞被認(rèn)為是抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮主要作用的淋巴細(xì)胞［1-2］?，F(xiàn)階段研究認(rèn)為，免疫抑制劑anti-PD-1、anti-PD-L1和anti-CTLA4可以增強(qiáng)TIL的抗腫瘤作用，而腫瘤組織中的CD8+T細(xì)胞的多寡可以在一定程度上反應(yīng)免疫治療的效果。生理情況下PDL1/PD-1通路可以維持機(jī)體的免疫耐受，避免免疫反應(yīng)對(duì)正常組織造成過(guò)度傷害，而腫瘤細(xì)胞則會(huì)利用該通路產(chǎn)生抑制性的腫瘤微環(huán)境從而達(dá)到免疫逃逸，目前篩選免疫治療獲益人群的生物標(biāo)記物非常有限，主要為PD-L1。TMB是預(yù)測(cè)是否使用免疫抑制劑的生物標(biāo)志物之一，越來(lái)越多的臨床研究開(kāi)始關(guān)注TMB在非小細(xì)胞肺癌［3-5］、胃癌［6］和黑色素瘤［7-9］免疫治療中的作用。因此TMB作為免疫治療效果的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，開(kāi)始被眾多臨床研究納入檢測(cè)范圍。我國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率均較高，為了更好的對(duì)肺癌進(jìn)行治療，如何選擇理想的預(yù)測(cè)療效的生物標(biāo)記物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 患者納入標(biāo)準(zhǔn) 收集并回顧性分析2015年1月至2020年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院術(shù)前接受過(guò)新輔助免疫治療，且驅(qū)動(dòng)基因?yàn)殛幮缘腎IIa和部分IIIb非小細(xì)胞肺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡：18 ～ 80歲，男女不限；（2）經(jīng)病理學(xué)確診為IIIa或IIIb期NSCLC，未接受過(guò)抗腫瘤治療；（3）依據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)，患者至少具有1個(gè)可測(cè)量或評(píng)估的腫瘤病灶；（4）可進(jìn)行手術(shù)切除；（5）組織樣本經(jīng)驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)為陰性；（6）擬應(yīng)用新輔助免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)病理學(xué)證據(jù)；（2）驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性；（3）評(píng)判為無(wú)法切除；（4）曾接受過(guò)抗腫瘤治療，如化療、放療、靶向治療等；（5）混合癌或合并其他惡性腫瘤；合并重癥肺炎或肺結(jié)核；（6）基礎(chǔ)狀況差，以下其一：ECOG PS評(píng)分＞1，KPS評(píng)分＜70，心功能不全（Ⅲ-Ⅳ級(jí)），肝功能不全（Child-Pugh C級(jí)），腎功能不全（4～5期）。對(duì)所有的患者信息進(jìn)行整理并統(tǒng)計(jì)，患者一般情況見(jiàn)表1。

表1 患者臨床病理特征Tab.1 The clinicopathologic characteristics of patients 例

1.2 患者樣本檢測(cè) 最終本研究共納入51例肺癌患者，所有患者的腫瘤樣本（蠟塊中腫瘤組織＞0.5 cm3，或大標(biāo)本8～10片，小標(biāo)本15～30片）及血液（10 mL）進(jìn)行448基因TMB檢測(cè)，免疫組化檢測(cè) CD8（ThermoFisher，MA5-13473）和 PD-L1（ThermoFisher，14-5982-82）表達(dá)情況。所有患者均簽署了知情同意書，并且本次實(shí)驗(yàn)得到了醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 結(jié)果評(píng)價(jià) 448基因TMB檢測(cè)測(cè)序平臺(tái)為illumina，把TMB數(shù)量≥25 mut/Mb定義為高突變組，其余為低突變組。對(duì)于病理結(jié)果的評(píng)價(jià)，邀請(qǐng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。采用半定量結(jié)果判定，分別對(duì)鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分。每張切片上觀察5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%計(jì)為0分，5%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，76%～100%計(jì)為4分。陽(yáng)性著色強(qiáng)度：無(wú)色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分。兩計(jì)分結(jié)果相乘即為最終評(píng)分。0～4分計(jì)為陰性（-），5～12分計(jì)為陽(yáng)性（+）。若兩醫(yī)生評(píng)判結(jié)果出現(xiàn)不同，則由兩人同時(shí)商議決定。

1.4 患者隨訪 患者隨訪主要以電話隨訪為主，手術(shù)后的1年內(nèi)，每3個(gè)月隨訪一次，之后每6個(gè)月隨訪一次。隨訪工作嚴(yán)格按照我院的隨訪工作制度進(jìn)行，隨訪之后詳細(xì)記錄患者的生存情況和無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free-survival，PFS）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，生存分析使用Kaplan-Meier法作圖，log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各指標(biāo)亞組患者無(wú)進(jìn)展生存期比較 根據(jù)患者的TMB和CD8、PD-L1免疫組化分析結(jié)果，結(jié)合患者的無(wú)進(jìn)展生存期，對(duì)各指標(biāo)亞組患者無(wú)進(jìn)展生存期進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。PD-L1陽(yáng)性組（PD-L1+）和PD-L1陰性組（PD-L1-）患者的無(wú)進(jìn)展生存期無(wú)明顯差別（P=0.461 1，圖1A）。TMB高突變組（TMB）無(wú)進(jìn)展生存期比TMB低突變組（TMB-）更長(zhǎng)（P=0.004 7，圖 1B），CD8陽(yáng)性組（CD8+）無(wú)進(jìn)展生存期比CD8陰性組（CD8-）更長(zhǎng)（P=0.001 4，圖1C），兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 PD-L1、TMB和CD8各亞組患者無(wú)進(jìn)展生存期比較Fig.1 Comparison of PFS in PD-L1，TMB and CD8 subgroups

2.2 多因素亞組分層后患者無(wú)進(jìn)展生存期比較 綜合患者的TMB、CD8和PD-L1表達(dá)情況，將患者分為PD-L1陽(yáng)性/TMB高突變組（PD-L1+/TMB+）和其他（others），PD-L1陰性/TMB高突變組（PD-L1-/TMB+）和其他（others），CD8陽(yáng)性/TMB高突變組（CD8+/TMB+）和其他（others），CD8陽(yáng)性/PD-L1陽(yáng)性組（CD8+/PD-L1+）和其他（others）。結(jié)合患者的無(wú)進(jìn)展生存期，對(duì)各亞組患者無(wú)進(jìn)展生存期進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。PD-L1+/TMB+患者較其他患者無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)（P=0.001 9，圖2A），PD-L1-/TMB+患者和其他患者無(wú)進(jìn)展生存期無(wú)明顯差異（P=0.361 1，圖2B），CD8+/TMB+患者較其他患者無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)（P=0.036 9，圖2C），CD8+/PDL1+患者較其他患者無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)（P=0.016 1，圖2D）。本實(shí)驗(yàn)還將TMB高突變/CD8陽(yáng)性/PD-L1陽(yáng)性（TMB+/CD8+/PD-L1+）患者和其他（others）患者進(jìn)行生存分析比較，TMB+/CD8+/PD-L1+患者較其他患者無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)（P=0.037 7，圖2E）。

圖2 多因素亞組分層后患者無(wú)進(jìn)展生存期比較Fig.2 Comparison of PFS between multifactorial subgroups

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界病死率最高、發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，在我國(guó)約75%的肺癌患者在診斷時(shí)已屬晚期，并且肺癌患者的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性比率高［10］。按照現(xiàn)行治療指南，對(duì)驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性患者進(jìn)行靶向治療，患者受益更加明顯。但目前并沒(méi)有針對(duì)驅(qū)動(dòng)基因陰性患者的靶向藥，主要還是以鉑類為基礎(chǔ)的新輔助化療以及免疫治療為主，可是有效率也只有30%左右，而且化療所產(chǎn)生的毒副作用，以及易產(chǎn)生耐藥性而限制了其應(yīng)用。免疫治療的迅速發(fā)展，為驅(qū)動(dòng)基因陰性患者的治療提供了新的治療方向。

隨著免疫治療研究的逐漸深入，腫瘤突變負(fù)荷等免疫相關(guān)概念逐步進(jìn)入腫瘤治療的應(yīng)用范疇。RIZIVI等［11］研究表明，腫瘤突變負(fù)荷高的病人在使用免疫制劑治療后，患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)。臨床Checkmate-026研究［12］中對(duì)應(yīng)用Nivolumab的NSCLC患者進(jìn)行回顧性分析，與化療組相比，高TMB組（≥24.3 mut/Mb）的客觀緩解率（Objective response rate，ORR）（46.8%vs.28.3%）和PFS（9.7 vs.5.8個(gè)月）均有所改善，并且病理緩解也與高TMB具有明顯的相關(guān)性。目前認(rèn)為在免疫治療中，除了TMB與PD-L1表達(dá)之外，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況與PFS相關(guān)，且具有預(yù)測(cè)抗PD-1免疫治療療效的作用。

CD8+T細(xì)胞可以作為預(yù)測(cè)癌癥患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，腫瘤中含有浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞的患者生存率更高，在口咽癌［13］、肺癌［14-16］、胃癌［17］等癌癥的研究中均得到了相同的結(jié)論。腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)和增殖，增加了細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并增強(qiáng)了細(xì)胞的溶解活性［18］。通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，在RNA水平上，PD-L1高表達(dá)/CD8高表達(dá)亞組與新抗原生成顯著相關(guān)［19］?；颊咴诮邮苊庖咭种苿┲委熀?，免疫系統(tǒng)會(huì)生成更多CD8+T細(xì)胞。PD-L1陽(yáng)性且CD8陽(yáng)性患者比單一PD-L1陽(yáng)性或CD8陽(yáng)性患者更能從免疫治療治療中獲益。在本實(shí)驗(yàn)中，未得到完全一致的結(jié)果，CD8陽(yáng)性/PD-L1陽(yáng)性組的P值小于單CD8陽(yáng)性組，除去樣本量較小的影響因素之外，可能是由于基于IHC方法檢測(cè)腫瘤組織CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的量化標(biāo)準(zhǔn)與RNA方法有一定差異性，但CD8作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以直接反應(yīng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度，能夠預(yù)測(cè)新輔助免疫治療后患者的無(wú)進(jìn)展生存期。

本研究發(fā)現(xiàn)，在使用新輔助免疫治療后，患者術(shù)后的無(wú)病生存期與TMB和CD8相關(guān)。腫瘤組織中TMB高突變患者，腫瘤部分有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，會(huì)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行殺傷，并會(huì)殺傷患者循環(huán)系統(tǒng)中游離的腫瘤細(xì)胞，使患者獲得較好的預(yù)后。而PD-L1陽(yáng)性組和PD-L1陰性組在使用免疫抑制劑后并沒(méi)有使患者獲益。在TMB高突變的情況下，PD-L1陽(yáng)性相較于PD-L1陰性，免疫治療能更好的發(fā)揮作用，患者受益更加明顯。當(dāng)CD8陽(yáng)性時(shí)，無(wú)論TMB或PD-L1表達(dá)情況如何，由于已發(fā)生免疫浸潤(rùn)，患者都能夠獲益，當(dāng)CD8陽(yáng)性/PD-L1陽(yáng)性/TMB高突變的情況下患者受益更加明顯。

綜上，與單純的PD-L1表達(dá)或CD8表達(dá)相比，免疫治療后，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度能夠直接反應(yīng)免疫治療效果，而綜合分析TMB和PD-L1雙因素的組合能夠更好的預(yù)測(cè)免疫治療效果，得到較好的預(yù)后。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)可手術(shù)切除的驅(qū)動(dòng)基因陰性的NSCLC患者的PD-1/PD-L1阻滯治療具有十分重要的指導(dǎo)意義。