海藻希瓦氏菌及其特異性脂多糖對結直腸腺瘤的影響及機制

周俊瀟 李俊彥 劉凱杰 梁顏笑 王紅，

1華南理工大學醫(yī)學院（廣州 510006）；華南理工大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院2消化內(nèi)科，3病理科（廣州 510120）

當腸上皮細胞的DNA修復和增殖機制改變時，異常增殖的細胞由隱窩基底向管腔延伸，形成散落的腺瘤［1］。從結直腸腺瘤（colorectal adenoma，CRA）到結直腸腺癌（colorectal cancer，CRC）通常需要很多年，包括異常的細胞增殖、侵襲和轉移［2］。近年來，人們越來越關注炎癥-腺瘤-腺癌序列中不同階段的腸道菌群變化，但關于CRA癌前病變的生物標記物卻知之甚少。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在CRA人群的腸道細菌中，海藻希瓦氏菌（Shewanella algae，S.algae）的豐度明顯上調(diào)［3］。并將S.algae對APCmin/+小鼠進行灌胃，發(fā)現(xiàn)S.algae可以通過改變APCmin/+小鼠腸道炎性微環(huán)境促進CRA的發(fā)展。目前已經(jīng)從腸黏膜、傷口、糞便、尿液、結膜、膽汁、腹水、胸膜液和血液中分離出 S.algae［4］。據(jù)報道，韓國首爾的一家醫(yī)院暴發(fā)了海藻希瓦氏菌屬的感染，導致了31例腹部、肝膽感染和菌血癥病例，說明該類細菌可能成為醫(yī)院內(nèi)潛在的嚴重人類病原體，并可能被納入醫(yī)院感染監(jiān)測系統(tǒng)［5］。后續(xù)實驗在APCmin/+小鼠腺瘤組織中發(fā)現(xiàn)了大量的巨噬細胞和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）水平的升高。LPS又叫內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組成部分。不同細菌的LPS活性并不相同，大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）LPS被認為是Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）的天然激動劑，而Bartonella quintana LPS卻是TLR4的天然抑制劑［6］。目前E.coli LPS的作用機制已被廣泛研究，然而本課題組發(fā)現(xiàn)的S.algae特異性LPS的作用機制尚不明確。已知E.coli LPS在體內(nèi)并不直接攻擊細胞或器官，而是通過激活免疫器官，尤其是刺激巨噬細胞。巨噬細胞高度表達CD11b，可以根據(jù)環(huán)境刺激，極化為M1和M2不同的表型，分別高表達CD86、CD80和CD163、CD206，可用于評估巨噬細胞的含量［7-8］。

本研究采用T-sol法提取S.algae特異性LPS，將S.algae及其LPS對C57BL/6J雌性小鼠以灌胃的形式，觀察S.algae特異性LPS對早期CRA的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及動物 S.algae，ATCC 51192，購自北京北納研究院。THP-1、Caco-2和HT29細胞均購自ATCC細胞庫。SPF級8～12周齡雌性C57BL/6J小鼠24只，購買于廣東省動物中心。飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，12 h：12 h晝夜間斷照明。每3 d更換動物墊料，所有的飲用水、水瓶、鼠籠都經(jīng)高溫高壓滅菌消毒。

1.2 主要試劑 氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM），佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）和E.coli O55：B5 LPS均購自Sigma公司，右旋糖酐硫酸酯鈉（Dextran sodium sulfate，DSS）購自 Mpbio公司，TLR4和p-IKKβ抗體購自Abcam公司，p-IkBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65抗體購自Cell signaling公司。

1.3 主要方法

1.3.1 LPS提取 采用T-sol法［9］提取并純化S.algae特異性LPS，凍干機凍干稱重，4℃密封保存。

1.3.2 小鼠造模與干預 小鼠適應性喂養(yǎng)至體質量為20～25 g。隨機分為Control組和3組實驗組：AOM/DSS組、AOM/DSS+LPS組、AOM/DSS+S.algae組，每組6只。實驗組給予腹腔注射AOM 10 mg/kg，對照組注射等量生理鹽水。休息一周后，實驗組小鼠根據(jù)體質量重新分組，飲用2.5%的DSS 5 d［10］，每3天稱一次體質量。后改用無菌水兩周，在實驗終點第26天處死小鼠。給予DSS當日開始LPS和S.algae灌胃干預，每兩天灌胃一次，對照組予等量PBS溶液灌胃。LPS和S.algae灌胃濃度為0.1 mg/kg，S.algae灌胃濃度為1×106CFU/mL。

1.3.3 標本留取與HE染色 麻醉小鼠后暴露胸腔，注射器抽出心臟血液。暴露小鼠腹部，分離肛門處到回盲部的腸管，測量其長度，縱向剪開后收集糞便，冰PBS沖洗腸道后，于光學顯微鏡下，記錄結直腸息肉數(shù)量、位置和大小，剪下息肉組織在10%福爾馬林溶液中固定24 h，行HE染色，觀察小鼠結直腸有無腺瘤形成。

1.3.4 實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR） 用Trizol提取腺瘤組織中的總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進行qRT-PCR，各引物序列均由上海生工公司設計。

1.3.5 免疫組化及評分標準 將小鼠腫瘤組織制成蠟塊標本，行免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）檢測，每組至少3只。每張切片隨機選取3個高倍鏡視野，進行打分。陽性細胞評分標準：≤25%（1分），26% ～50%（2分），51% ～75%（3分），≥75%（4分）。著色強度評分標準：無色（0分），淡黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分），最后將兩者分數(shù)相加［11］。

1.3.6 Western blot法 用常規(guī)方法對蛋白提取液進行電泳及轉膜［12］。結束后用Image J檢測及定量條帶強度。實驗所用抗體：TLR4、p-IKKβ、p-IKBα、NF-κB、p-NF-κB。

1.3.7 細胞培養(yǎng) 100 ng/mL的PMA刺激THP-1細胞24 h，PBS洗滌兩次，加入RPMI-1640培養(yǎng)基24 h，穩(wěn)定細胞狀態(tài)，即為M0巨噬細胞，再加入0.5 μg/mL的S.algae特異性LPS進行孵育48 h，將M0巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞。共培養(yǎng)實驗中，將THP-1細胞在Transwell小室的上層誘導并極化為M0巨噬細胞，在小室下層鋪滿Caco-2或HT29細胞，待貼壁后與M0巨噬細胞共培養(yǎng)，加入0.5 μg/mL E.coli LPS、S.algae LPS和等量PBS，共培養(yǎng)48 h。

1.3.8 流式檢測巨噬細胞表型和細胞周期 用THP-1和S.algae LPS誘導出M0和M1巨噬細胞后，用CD11b、CD86和CD163抗體避光孵育30 min后，流式機上機檢測。使用Cell Cycle Staining Kit測定細胞周期，流式細胞儀檢測。

1.3.9 細胞增殖實驗 細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞增殖能力。各組重復3次，分別添加10%CCK-8。2.5 h后，用酶標儀450 nm吸光度值測定光密度。

1.3.10 劃痕實驗 Transwell小室下層鋪滿單層的Caco-2和HT29后，用槍頭筆直畫一條直線，用PBS緩沖液洗滌3次。加入無血清培養(yǎng)基和LPS溶液，48 h后記錄細胞遷移圖像。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料若符合正態(tài)分布，則采用均數(shù)±標準差表示。采用獨立樣本t檢驗進行兩兩比較，采用單因素方差分析進行多組間比較，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。雙變量之間的相關性采用Spearman相關性分析。

2 結果

2.1 體質量及息肉情況 與對照組相比，實驗組小鼠在飲用DSS溶液后體質量均下降，AOM/DSS組和AOM/DSS+S.algae組小鼠在第14天體質量出現(xiàn)最低值，體質量分別降低約6.61%和9.08%。AOM/DSS+LPS組小鼠體質量出現(xiàn)更明顯且更持續(xù)地降低，在第17天體質量出現(xiàn)最低值，體質量約降低16.98%（圖1A）。與AOM/DSS組相比，LPS和S.algae干預的小鼠結直腸長度縮短（P＜0.01；P＞0.05）（圖1B-C），息肉數(shù)量明顯增加（P＜0.000 1；P＜0.05）（圖1D-E，表1），且 ＞0.5 mm的息肉比例增加（圖1F，表1）。

圖1 小鼠體質量、結直腸長度及息肉情況Fig.1 Body weight，colorectal length，polyps of mice

表1 各組小鼠結直腸息肉的計數(shù)情況Tab.1 Count of colorectal polyps in each group of mice

2.2 HE染色 對照組小鼠腸上皮粘膜完整，腺體排列整齊，細胞核位于基底部，隱窩完整。其余各組小鼠腸上皮腺體結構紊亂，隱窩增大，胞核拉長，出現(xiàn)輕至重度不典型增生。固有層見大量中性粒細胞浸潤。其中，AOM/DSS組小鼠結直腸上皮呈現(xiàn)輕度不典型增生，S.algae及其特異性LPS干預后結直腸上皮腺體結構更為紊亂，細胞異型性更為明顯，呈現(xiàn)重度不典型增生（圖2）。

圖2 各組小鼠結直腸息肉的HE染色圖（放大倍數(shù)為100×，200×）Fig.2 The HE staining of colorectal polyps in mice of each group（100×，200× magnification）

2.3 巨噬細胞水平改變 qRT PCR結果顯示（圖3），與AOM/DSS組相比，LPS和S.algae干預后CD11b和CD86 mRNA表達均升高（P＜0.000 1；P＜0.000 1；P＜0.000 1；P＜0.01）。CD163在各組小鼠中均有少量表達，未見明顯改變。IHC結果顯示，與AOM/DSS組相比，LPS和S.algae干預后CD11b和CD86表達均升高（P＜0.000 1，圖3）。說明S.algae及其LPS灌胃可以增加M1巨噬細胞，但M2巨噬細胞改變不明顯。

圖3 各組小鼠CD11b、CD86、CD163的mRNA及蛋白質水平Fig.3 The mRNA and protein levels of CD11b，CD86，and CD163 in mice of each group

2.4 增殖和周期情況 IHC結果顯示（圖4），與AOM/DSS組相比，LPS和S.algae干預后，Ki-67、PCNA、Cyclin D1蛋白的表達量均明顯升高（P＜0.000 1）。說明S.algae及其LPS均可以促進小鼠腺瘤細胞的增殖和周期蛋白表達。

圖4 各組小鼠Ki-67、PCNA和Cyclin D1的蛋白質水平Fig.4 The mRNA and protein levels of Ki-67，PCNA and Cyclin D1 in mice of each group

2.5 相關性分析 將IHC評分結果與各組小鼠息肉數(shù)量做Spearman相關性分析（表2）。結果顯示，CD11b、CD86、Ki-67、PCNA、Cyclin D1和小鼠結直腸息肉數(shù)量呈正相關（P=0.008；P=0.018；P=0.028；P=0.003；P=0.024），CD163與小鼠結直腸息肉數(shù)量未見明顯相關性（P=0.198）。

表2 免疫組化指標與息肉數(shù)量的相關性分析Tab.2 Spearman correlation analysis of immunohistochemical indexes and the number of polyps

2.6 炎癥微環(huán)境的改變 ELISA結果顯示，與AOM/DSS組相比，LPS和S.algae干預后，觀察到血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高（P＜0.05），LPS也升高（P＜0.001，圖5A-D）。

qRT PCR結果顯示，與AOM/DSS組相比，LPS干預后IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA水平升高（P＜0.0001），IL-6、IL-23 mRNA水平均升高（P＜0.001；P＜0.01）（圖5E-I）。S.algae干預后IL-1β、TNF-α mRNA水平升高（P＜0.0001）、IL-6、IL-23 mRNA水平升高（P＜0.05；P＜0.01），iNOS mRNA水平未見明顯改變（圖5E-I）。

圖5 小鼠腺瘤組織中炎癥因子和LPS的表達情況Fig.5 Expression of inflammatory factors and LPS in adenoma tissues of mice in each group

2.7 TLR4/NF-κB通路蛋白的表達情況 Western Blot結果顯示，與AOM/DSS組相比，LPS干預后小鼠TLR4、p-IKKβ、p-IkBα和p-NF-κB蛋白的表達量明顯增加（P＜0.01；P＜0.05；P＜0.01；P＜0.05），NF-κB的蛋白表達量未見明顯改變（圖6）。S.algae干預后小鼠TLR4、p-IKKβ、p-IkBα和p-NF-κB蛋白的表達量明顯增加（P＜0.05），NF-κB的蛋白表達量未見明顯改變（圖6）。

圖6 小鼠腺瘤組織中TLR4/NF-κB通路蛋白表達情況Fig.6 Expression of TLR4/NF-κB pathway proteins in adenomas tissue of mice

2.8 THP-1誘導為M1巨噬細胞 分別用不同濃度的S.algae LPS刺激M0巨噬細胞48 h，然后采用qRT-PCR檢測不同濃度刺激下，IL-6和iNOS的mRNA水平，以評估S.algae LPS誘導巨噬細胞炎癥的最適濃度。見圖7，當S.algae LPS濃度為0.5μg/mL時，促炎因子IL-6和iNOS mRNA的表達量最高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；P＜0.01）。采用0.5 μg/mL S.algae LPS誘導極化后，M1巨噬細胞比例由7.00%到41.40%，差異有統(tǒng)計學意義，M2巨噬細胞比例由2.30%到2.39%，差異無統(tǒng)計學意義。說明該方案誘導后，M1型巨噬細胞的比例明顯增加，M2巨噬細胞比例未見明顯改變（圖8）。

圖7 S.algae LPS的最適濃度Fig.7 Optimal concentration of S.algae LPS

圖8 細胞流式分析結果Fig.8 Results of cell flow analysis

2.9 S.algae LPS對M0巨噬細胞增殖的影響 用0.5 μg/mL的 S.algae LPS和 E.coli LPS刺激 M0巨噬細胞，用等量PBS緩沖液做陰性對照，48 h后CCK-8法顯示S.algae LPS可以明顯促進M0巨噬細胞的增殖（圖9A）。

2.10 S.algae LPS和M0巨噬細胞對結直腸腫瘤細胞增殖和周期的影響 Caco-2或HT-29與M0巨噬細胞共培養(yǎng)后，其增殖能力增加（圖9B-C）。與PBS組相比，用S.algae LPS和E.coli LPS刺激可以更明顯地促進結腸腫瘤細胞的增殖和遷移（圖9B-C，表3），且G1期細胞百分比降低，S期升高，G2期較穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯變化（圖9D-E、表3）。提示S.algae LPS可能促進細胞從G1期進入S期，從而促進細胞增殖。

表3 劃痕實驗顯示各組細胞在不同干預下48 h后的遷移率Tab.3 The migration rate of cells under different interventions after 48h in each group was shown by scratch experiment ±s

表3 劃痕實驗顯示各組細胞在不同干預下48 h后的遷移率Tab.3 The migration rate of cells under different interventions after 48h in each group was shown by scratch experiment ±s

注：*表示與Caco-2組相比的P值；#表示與HT29組相比的P值；***P＜0.001；****P＜0.0001；###P＜0.05；####P＜0.0001

PBS（%）E.coli LPS（%）S.algae LPS（%）Caco-2 17.853±1.397 30.478±1.033 30.819±1.565 Caco-2+M0 29.078±0.657***49.396±1.997***64.201±0.892****HT29 5.437±1.726 13.543±0.400 20.325±2.005 HT29+M0 20.692±0.532###32.414±1.723####42.109±1.317####

圖9 S.algae特異性LPS和M0巨噬細胞對Caco-2和HT29細胞的增殖和周期影響Fig.9 The effects of S.algae specific LPS and M0 macrophages on proliferation and cycle of Caco-2 and HT29 cells

3 討論

有學者在小鼠結腸腔內(nèi)通過灌腸給予E.coli LPS，導致局部細胞炎癥因子發(fā)生改變，這表明結腸內(nèi)的E.coli LPS水平升高會引起腸道炎癥［13］。近年來，學者們在CRA和CRC患者的血液和腫瘤組織中都觀察到了LPS的升高［14］。高血清LPS水平的患者更有可能發(fā)展為CRA，且與結腸息肉的數(shù)量以及腸內(nèi)炎性細胞因子的水平都呈現(xiàn)正相關［15］。

本研究中通過S.algae LPS灌胃后，小鼠結直腸的息肉數(shù)量和＞0.5 mm的息肉比例明顯增加，并且加重腺瘤組織的不典型增生。通過qRT PCR和IHC，還檢測到S.algae LPS可以提高腺瘤中M1巨噬細胞的水平，且與小鼠息肉數(shù)量成正相關，但未改變M2巨噬細胞水平。這些結果說明本實驗中小鼠腺瘤組織中主要以M1巨噬細胞為主，這與CHANMEE、CHENG和GUTTING等［16-18］研究一致。S.algae LPS干預還可以改變小鼠的腫瘤炎性微環(huán)境，促使腫瘤細胞的增殖和周期蛋白的表達。通過Spearman相關性分析證實細胞的增殖和周期蛋白的表達與息肉數(shù)量呈正相關。在體外，選取高分化的結直腸腫瘤細胞Caco-2和中分化的HT29細胞進行驗證，發(fā)現(xiàn)S.algae LPS可以促進更多細胞從G1期進入S期，加快細胞周期，促進結直腸腫瘤細胞的增殖和遷移能力，使腺瘤向腺癌發(fā)生轉變。

本實驗中S.algae LPS對TLR4/NF-κB通路同樣具有激活作用。腸道中富含LPS的細菌過多可能會提供有利于慢性炎癥并增加促炎性細胞因子和活性氧產(chǎn)生的環(huán)境，這些細胞因子可以激活NF-κB途徑，并促進細胞增殖和DNA損傷，導致癌變［19］。LPS通過LPS結合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）運輸?shù)骄奘杉毎ど?，與mCD14結合［19］。LPS被解離成單體后，活性激活，暴露出內(nèi)部結構，可以使TLR4-MD-2復合物識別并結合。隨后該復合物發(fā)生的二聚化引起構象改變，將信號傳遞給下游的MyD88，進而IKK-β和IkB-α發(fā)生磷酸化，促使NF-κB磷酸化后易位到細胞核中［19］。

LPS性質極其穩(wěn)定，與細菌灌胃相比，采用LPS灌胃既可以減少人體消化液對細菌的損傷，又可以避免細菌對腸道菌群的直接干擾作用。以往學者們多將E.coli LPS以腹腔注射的形式，用于內(nèi)毒素血癥的研究［20］，而在本實驗中，通過比較S.algae及其LPS的灌胃處理，首次證明了S.algae LPS灌胃干預CRA的可行性，并且較S.algae灌胃有更大的優(yōu)勢。SONG等通過納米顆粒，特異性地阻斷了腫瘤組織內(nèi)的LPS，改善了腫瘤的免疫抑制微環(huán)境，甚至減輕了CRC的肝轉移［21］。但并非所有的革蘭氏陰性細菌均為人體有害菌，未來我們或許可以運用納米顆粒技術，靶向清除S.algae特異性LPS，進一步研究其對CRA產(chǎn)生的影響，或許可為CRA防治提供新思路。