電針對(duì)帕金森模型小鼠GLP-1R介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路的調(diào)控作用

李含章 祁羚 張小蕾 陳祥林 郭磊 郭淑琴 馬駿

湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（武漢 430060）

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種好發(fā)于中老年人的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，PD發(fā)病主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、體位障礙等運(yùn)動(dòng)功能障礙［1］。目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)于PD的發(fā)病原因和機(jī)制尚未完全闡明。研究［2］發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是機(jī)體胃腸道L細(xì)胞釋放的一種胃腸道激素，可穿過血-腦脊液屏障，通過與胰高血糖素樣肽1受體（glucagonlike peptide-1 receptor，GLP-1R）結(jié)合發(fā)揮多種生物效應(yīng)，在PD、阿爾茨海默病、外周神經(jīng)病變、腦卒中等疾病中具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。由此可見，GLR-1R信號(hào)通路在PD發(fā)生、發(fā)展過程中介導(dǎo)了重要的調(diào)節(jié)機(jī)制，為治療PD提供了潛在的治療靶點(diǎn)。前期研究［3-6］已證實(shí)，針刺能夠通過釋放興奮性氨基酸、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)控泛素一蛋白酶體系統(tǒng)、促進(jìn)線粒體功能恢復(fù)等機(jī)制改善行為學(xué)癥狀，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但電針通過GLP-1R介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinosiyol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）信號(hào)通路改善PD運(yùn)動(dòng)功能障礙的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究擬從黑質(zhì)（substantia nigra，SN）GLP-1R介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路角度，探討電針對(duì)PD小鼠的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用電針治療帕金森提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 本研究采用48只SPF級(jí)C57/BL6雄性小鼠（7～8周齡，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購進(jìn)，動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK（鄂）2017-0067），喂養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，室溫22～25℃，濕度45%～55%，小鼠可自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（normal control group，NC）、模型組（model group，M）、電針組（electroacupuncture group，EA）、抑制劑組（DPP-inhibitor group，DI），每組12只。

1.2 主要試劑與儀器 魚藤酮、羧甲基纖維素、DPP-4抑制劑利格列?。ò⒗≡噭┯邢薰荆?，TH（博士德生物工程有限公司），兔多抗p-PI3K、p-GSK-3β、小鼠單抗GSK-3β（abcam公司），兔多抗PI3K、p-AKT、AKT（江蘇親科生物研究中心有限公司），兔單抗GLP-1R（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司），敞箱實(shí)驗(yàn)裝置（武漢一泓科技有限公司），0.25 mm×15 mm針灸針（北京中研太和），SDZ-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 模型制備方法 采用魚藤酮連續(xù)灌胃制備PD小鼠模型［7］：將魚藤酮溶于4%羧甲基纖維素和1.25%氯仿溶液的混合液中，按體質(zhì)量10 mg/kg給藥，每日1次，連續(xù)灌胃4周。正常組以同體積生理鹽水灌胃，1次/日，共4周。

1.4 干預(yù)方法 NC組：予以同體積生理鹽水灌胃4周后，使用同規(guī)格的固定臺(tái)捆綁，30 min/次，1次/日，共2周。M組：予魚藤酮連續(xù)灌胃4周后，使用同規(guī)格的固定臺(tái)捆綁，30 min/次，每日1次，共2周。EA組：予魚藤酮連續(xù)灌胃4周后，進(jìn)行電針干預(yù)治療。將小鼠捆綁于固定臺(tái)后，參照《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位定位圖譜》選取“風(fēng)府”、“足三里”（雙側(cè)）、“太沖”（雙側(cè)），使用0.25 mm×15 mm一次性針灸針，于“風(fēng)府”“太沖”直刺3 ～ 5 mm、“足三里”直刺6 ～ 8 mm，針柄連接SDZ-Ⅱ型電子針療儀，正極接“風(fēng)府”穴，負(fù)極接“太沖”穴，連續(xù)波，電壓1.6 V，強(qiáng)度1 mA，頻率2 Hz，以穴位出現(xiàn)局部顫動(dòng)為佳，30 min/次，1次/日，共治療2周?！帮L(fēng)府”為固定用穴，“太沖”、“足三里”隔日左右交替使用。DI組：予魚藤酮連續(xù)灌胃4周后，采用二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）抑制劑利格列?。?］［10 mg/（kg·d）］連續(xù)灌胃2周，同時(shí)使用同規(guī)格的固定臺(tái)捆綁，30 min/次，每日1次，共2周。

1.5 標(biāo)本采集 各組小鼠在敞箱實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻取材。每組任取6只小鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用4%多聚甲醛灌注固定后取出中腦組織，另6只麻醉后冰上取出新鮮腦組織，留取中腦黑質(zhì)區(qū)域組織塊，置于-80℃冰箱中保存。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 敞箱實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠自主運(yùn)動(dòng)的變化情況 各組小鼠于治療結(jié)束后次日進(jìn)行敞箱實(shí)驗(yàn)。設(shè)置測試總時(shí)間為5 min，將小鼠置于反應(yīng)箱適應(yīng)5 min后開始計(jì)時(shí)，觀察各組小鼠自主運(yùn)動(dòng)的總路程、總時(shí)間、平均速度的變化情況。

1.6.2 免疫組化法測定中腦黑質(zhì)中酪氨酸輕化酶（tyrosine hydroxylase，TH） 表達(dá)中腦黑質(zhì)組織采用4%多聚甲醛中固定后，制備厚度為4 μm的石蠟切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，山羊血清室溫封閉30 min，TH抗體（1∶200）孵育過夜，二抗孵育20 min，再經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、封片后，采集圖像。每張切片選取3個(gè)400倍的圖像，采用Image pro plus 6.0軟件計(jì)算平均吸光度。

1.6.3 Western blot測定 GLP-1R、PI3K，AKT，GSK-3β蛋白表達(dá)水平 取中腦黑質(zhì)組織20 mg，加入200 μL RIPA裂解液勻漿、裂解后離心（12 000 g，4℃，10 min），取上清液，BCA法測定所提取總蛋白濃度后，將蛋白上清與5×Loading buffer混合，煮沸10 min進(jìn)行蛋白變性。每組取40 μg總蛋白于PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉（磷酸化蛋白用1%的BSA封閉）后，加入GLP-1R（1∶500），p-PI3K（1∶1 000），PI3K（1∶500），p-Akt（1∶500），Akt（1∶500），p-GSK-3β（1∶500），GSK-3β（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。洗去一抗，加酶標(biāo)二抗（1∶50 000）37℃孵育2 h，加入ECL顯色，采用IPP分析進(jìn)行相對(duì)定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)值采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化 第4周，與NC組比較，M、EA和DI組魚藤酮造模后小鼠體質(zhì)量顯著降低（均P＜0.05）。第6周，M、EA和DI三組組間比較體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1 體質(zhì)量變化Fig.1 Changes of body weight in each group

2.2 各組小鼠自主運(yùn)動(dòng)能力比較 與NC組比較，M組小鼠自主運(yùn)動(dòng)的總路程縮短、總時(shí)間縮短、平均速度降低（均P＜0.01）。與M組比較，EA和DI組小鼠自主運(yùn)動(dòng)的總路程延長（均P＜0.01）、總時(shí)間延長（P＜0.01，P＜0.05）、平均速度升高（均P＜0.01），且與DI組比較，EA組小鼠的總路程延長和運(yùn)動(dòng)總時(shí)間延長（均P＜0.01）。見圖2、3。

圖2 小鼠的自主運(yùn)動(dòng)軌跡圖像Fig.2 Autonomous motion track image of mice

圖3 各組小鼠自主運(yùn)動(dòng)的總路程、總時(shí)間、平均速度比較Fig.3 Comparison of total distance,total time and average speed of autonomous movement of mice in each group

2.3 各組小鼠中腦黑質(zhì)TH表達(dá)水平比較 圖中箭頭所指為中腦黑質(zhì)典型的TH陽性神經(jīng)元，陽性著色為棕黃或棕褐色。與NC組比較，M組小鼠中腦黑質(zhì)TH平均吸光度顯著降低（P＜0.01）；與M組比較，EA和DI組小中腦黑質(zhì)TH平均吸光度均顯著升高（均P＜0.01）。EA組與DI組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠中腦黑質(zhì)TH陽性表達(dá)比較（×400）Fig.4 Comparison of TH positive expression in SN of mice in each group（× 400）

2.4 各組小鼠GLP-1R、PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達(dá)水平比較 與NC組比較，M組小鼠中腦黑質(zhì) GLP-1R，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT，p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）。與M組比較，EA和DI組GLP-1R，p-PI3K/PI3K，p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.01），p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。EA組與DI組比較，上述各個(gè)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖5。

圖5 各組小鼠GLP-1R、PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of protein expression levels of GLP-1R,PI3K,Akt and GSK-3β in each group

3 討論

GLP-1R是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)［9-10］。相關(guān)研究表明，GLP-1R激動(dòng)劑在神經(jīng)退行性疾病和糖尿病的動(dòng)物模型中通過激活參與細(xì)胞增殖、生長、存活和修復(fù)的通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［11-12］。研究證實(shí)，GLP-1R可激活PI3K/AKT通路發(fā)揮抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等重要作用［13］。PI3K通過磷酸化AKT蛋白Ser473位點(diǎn)使AKT活化，而活化后的AKT通過p-GSK-3β的Ser9位點(diǎn)抑制GSK-3β活性，避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生［14］。在本研究中，魚藤酮造模后，小鼠黑質(zhì)中GLP-1R、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平顯著下降，GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著上升。DPP-4抑制劑通過抑制DPP-4酶的活性，提高體內(nèi)GLP-1濃度。本研究采用DPP-4抑制劑利格列汀對(duì)PD小鼠進(jìn)行連續(xù)2周灌胃的治療。經(jīng)治療，利格列汀可以有效提高GLP-1R、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平，并顯著降低GSK-3β蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，電針亦可上調(diào)GLP-1R、PI3K、AKT及下調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)水平，其干預(yù)效果與利格列汀無顯著差異，提示電針和利格列汀對(duì)GLP-1R介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK-3β通路均具有一定的調(diào)節(jié)作用，二者的效應(yīng)機(jī)制可能相同。

PD的病理改變主要表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺神經(jīng)元變性壞死，TH水平能反映出腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的合成量［15-17］，從而可反映PD的病理改變和損傷的程度。研究［18］表明，針刺可明顯改善帕金森病患者黑質(zhì)致密帶。在本研究中，魚藤酮造模后，小鼠中腦黑質(zhì)TH表達(dá)水平均顯著降低，表明PD模型制備成功。經(jīng)電針和DPP-4抑制劑干預(yù)后，中腦黑質(zhì)TH水平均顯著升高，表明電針和DPP-4抑制劑可有效提高PD小鼠的中腦黑質(zhì)TH表達(dá)水平。同時(shí)，各組小鼠自主運(yùn)動(dòng)能力的變化趨勢與TH基本相一致。電針和DPP-4抑制劑可改善PD小鼠的各項(xiàng)行為學(xué)表現(xiàn)指標(biāo)，且電針的干預(yù)效果更優(yōu)。

近來研究顯示，GLP-1R的調(diào)控還存在多種途徑，如小鼠的神經(jīng)營養(yǎng)通路被激活，凋亡信號(hào)被抑制［19］。此外，GLP-1/GLP-1R還通過激活環(huán)磷酸腺苷、蛋白激酶C，證明了在各種組織中增強(qiáng)抗氧化能力的效果［20］，PI3K/AKT/GSK-3β 通路僅是其中一個(gè)分支，各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間常有交叉。綜上所述，電針治療PD的作用機(jī)制可能與GLP-1R介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK-3β通路有關(guān)，具體機(jī)制有待更深入的探究。