基于適配體的納米金比色法快速檢測微囊藻毒素-LR研究

吳袁袁 馮俊麗,2,*

(1 浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2 浙江省水產品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012)

微囊藻毒素(microcystins，MCs)是由銅綠微囊藻、念珠藻、魚腥藻等產生的一類單環(huán)七肽結構的天然毒素，常存在于藍藻水華污染嚴重、富營養(yǎng)化的水體中[1-3]。目前發(fā)現(xiàn)MCs存在90多種異構體，其中微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是水體環(huán)境中最常見、毒性最強、危害最大的一類肝毒素，其化學性質穩(wěn)定、耐強酸強堿，在高溫300℃條件下仍能長時間保持不被分解[1-3]。MC-LR毒性主要作用于肝臟細胞，可專一抑制蛋白磷酸酶的活性，使得肝細胞發(fā)生形變壞死，從而造成肝臟出血，肝功能喪失[2]。腎臟是MC-LR另一個重要的靶器官[4]。有研究表明連續(xù)8周向大鼠腹腔注射MC-LR，大鼠腎小球出現(xiàn)病理性變化，如塌陷、基底膜增厚等，腎損傷現(xiàn)象明顯[4-6]。同時MC-LR還具有強促癌活性，飲水中的MC-LR被認為是導致原發(fā)性肝癌的一個重要因素[7]。MC-LR除了可通過飲水途徑攝入體內，還可在水生生物體內富集，從而通過食物鏈富集到人體內[8-10]。因此，世界衛(wèi)生組織及我國飲用水標準[11]均規(guī)定MC-LR的含量不得超過1 μg·L-1。

MCs影響環(huán)境生態(tài)的同時也嚴重威脅著人類健康，越來越受到國內外學者的廣泛關注，如何快速檢測和高效環(huán)保降解MC-LR成為當下的研究熱點[12-14]。國內外檢測MC-LR的方法主要有生物化學測定法、儀器分析法和免疫分析法以及新興的傳感器分析法[15-17]。早期使用的生物化學測定法主要有蛋白磷酸酶抑制法和細胞毒性法，前者酶活性易受到干擾物質的影響，因此常用作定性檢測；后者只能檢測出毒理作用相似的毒素總量[15]。儀器分析法是目前運用最廣泛的方法，較常用的有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜和質譜(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)聯(lián)用等[18]。王剛等[19]采用超高效液相色譜/串聯(lián)質譜法檢測水體中的MC-LR，其檢出限最低為0.05 μg·L-1，精確度高、靈敏性強、重現(xiàn)性好，但存在儀器昂貴、操作復雜、技術要求高等問題[2,20]。免疫分析法具有靈敏度高、檢測速度快、高通量等優(yōu)點，但是所用試劑價格昂貴，容易出現(xiàn)假陽性[21]。因此，亟需建立一個快速、靈敏、可視化的現(xiàn)場檢測方法[22-24]。

相較于傳統(tǒng)的檢測方法，適配體傳感器檢測更加高效、方便和靈敏。適配體是體外篩選得到的一段寡核苷酸片段，可作為一種新型的識別元件與靶標以高親和力特異性結合，具有穩(wěn)定、易修飾、易于合成等優(yōu)點[25-27]。適配體傳感器可結合電化學、熒光和比色等傳感技術構建出不同類型的傳感器[28]。其中，電化學適配體傳感器的應用最為廣泛，檢測效率高，檢出限低，但大多數(shù)采用金電極，成本高[29-30]。熒光傳感器檢測MC-LR具有一定的優(yōu)勢，但是操作相對繁瑣、熒光染料穩(wěn)定性不高[31]。

金納米粒子由于其良好的光學性質和生物相容性,常作為比色法傳感器中信號傳導的理想材料。與其他檢測方法相比，基于適配體和納米金所構建的比色傳感器檢測技術較為簡單，具有成本低、靈敏度高、檢測結果可視化等優(yōu)點[32]，已被廣泛應用于致病菌、農獸藥殘留、腫瘤標志物等小分子的檢測[33-34]。但目前對適配體和靶標分子的結合作用機制還不明確，在一定程度上限制了適配體生物傳感器的進一步發(fā)展。本研究首先基于已報道的MC-LR原始適配體Apt-1序列，建立MC-LR適配體-納米金檢測體系。其次，通過對Apt-1進行定點突變得到二級結構發(fā)生明顯改變的Apt-3，分析比較Apt-1和Apt-3對MC-LR的親和力差異，以期為進一步探究適配體的二級結構和靶分子結合的關系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MC-LR適配體-1(MC-LR Apt-1)共60個堿基，引用自文獻[35]，序列為：5′-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′(上海生工生物合成)，MC-LR適配體-3(MC-LRApt-3)共60個堿基，為本研究設計突變適配體，序列為：5′-GGGGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′(上海生工生物合成)，雙蒸餾水溶解，4℃冰箱保存；微囊藻毒素-LR由浙江工商大學海洋食品研究院提供，-20℃冰箱冷凍保存；氯化鈉、四氯金酸、檸檬酸三鈉均為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司；四螨嗪標準品、阿特拉津標準品、草甘膦標準品，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 主要儀器與設備

MRIEX-5型漩渦振蕩器，江蘇海門其林貝兒儀器制造有限公司；EVOLUTION 60S 型紫外可見分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司；

1.3 序列優(yōu)化

對MC-LR適配體-1(Apt-1)進行定點突變，將5′端開始的第3位胞嘧啶替換成鳥嘌呤，命名為適配體-3(Apt-3)。利用Mfold軟件，在鹽濃度為1 mol·L-1條件下，擬合分析Apt-1和Apt-3的結構，得到2個結構完全不同的適配體。圖1-A為Apt-1的二級結構，圖1-B為Apt-3的二級結構，并比較二者吉布斯自由能(ΔG)。

圖1 MC-LR適配體-1(A)和MC-LR適配體-3(B)的二級結構Fig.1 Secondary structure of MC-LR Apt-1(A)and MC-LR Apt-3(B)

1.4 納米金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金[36]。制備中所需燒杯等器皿置于王酸[HNO3∶HCl=1∶3(v∶v)]中浸泡24 h，用超純水洗凈，烘箱烘干待用。量取100 mL 0.01%(w∶v)的氯金酸于燒杯中，在磁力攪拌條件下加熱煮沸，沸騰后立即加入3.5 mL 1%檸檬酸三鈉水溶液。待溶液變酒紅色后繼續(xù)加熱煮沸15 min，直至溶液呈紅色、澄清透明狀。加熱停止，以500 r·min-1的轉速繼續(xù)攪拌15 min，待冷卻至室溫后，過0.2 μm 聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)濾膜，于4℃保存。制得的納米金溶液利用紫外可見分光光度計在400～750 nm波長范圍內全掃描。

1.5 納米金比色法檢測MC-LR原理

檢測原理如圖2，納米金顆粒表面帶有大量磷酸根離子，呈負電。當沒有電介質存在時，離子間的靜電斥力使得粒子處于穩(wěn)定狀態(tài)，分散均一，裸AuNPs溶液呈現(xiàn)酒紅色。當加入鹽溶液后，Na+離子能夠中和AuNPs表面的電子，靜電引力使得粒子聚集，溶液由紅色變?yōu)樗{色，吸收峰右移[26]。當適配體以一定的濃度加入到溶液中時，可憑借范德華靜電作用等分子間作用力吸附在AuNPs表面保護AuNPs免受鹽誘導，AuNPs溶液依然保持分散、穩(wěn)定的狀態(tài)。當在受適配體保護的納米金溶液中存在靶標分子MC-LR時，適配體會與MC-LR特異性結合形成具有規(guī)則三維結構的復合物，此時納米金顆粒失去保護，在鹽誘導下呈聚集態(tài)，溶液顏色逐漸變?yōu)樽纤{色，在一定范圍內顏色變化與MC-LR的濃度具有比例關系[37]。因此通過肉眼觀察顏色變化便可初步判斷MC-LR的濃度[32]。

圖2 納米金比色法檢測MC-LR的原理圖Fig.2 The principle of MC-LR detection by nanogold colorimetric method

1.6 條件優(yōu)化

最適鹽濃度的確定。反應體系為200 μL，移取190 μL恢復至室溫的納米金溶液于試管中，分別加入10 μL不同濃度的氯化鈉溶液，使得其混合液中鹽的終濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.045、0.05、0.06、0.08 μmol·L-1，混合均勻，靜置反應2 min，觀察溶液顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，每個濃度設置3組平行。

最佳適配體濃度的確定。孵育體系為120 μL，在含有117.6 μL中的納米金中加2.4 μL不同濃度的Apt-1溶液，使得Apt-1體系終濃度分別為0.00、0.03、0.05、0.08、0.12、0.15 μmol·L-1，混合均勻，常溫下避光孵育24 h。孵育后分別加入2 mol·L-1的NaCl溶液，搖勻靜置反應2 min后，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，重復3次。

與上述Apt-1孵育體系相同，在117.6 μL的納米金溶液加入2.4 μL不同濃度的Apt-3溶液，使得Apt-3體系終濃度分別為0.00、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 μmol·L-1，混勻，常溫下避光孵育24 h，孵育后分別加入2 mol·L-1的NaCl溶液，搖勻靜置反應2 min，觀察溶液顏色變化，于400～800 nm波長下進行全掃描，設置3組平行。

1.7 MC-LR的檢測

Apt-1：按照1.6所確定的最優(yōu)反應條件和體系，加入MC-LR溶液，使MC-LR的體系終濃度分別為0、40、70、100、120、150 ng·mL-1，充分混勻，避光反應15 min后，加入NaCl溶液，靜置2 min，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，空白組以相同體積的超純水替代Apt-1，設定3組平行。

Apt-3：同理，按照1.6所確定的最優(yōu)反應條件和體系，加入MC-LR溶液，使MC-LR的體系終濃度分別為0、10、30、50、70、100、120 ng·mL-1，充分混勻，避光反應15 min后，加入NaCl溶液，靜置2 min，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描，空白組以相同體積的超純水替代Apt-3，設定3組平行。

1.8 納米金(AuNPs)比色法的特異性

將Apt-1和Apt-3，以1.6所確定的最優(yōu)反應條件和體系，分別加入等量的MC-LR溶液、四螨嗪標準品、阿特拉津標準品以及草甘膦標準品，各毒素的反應終濃度為100 ng·mL-1，避光孵育15 min后，加入NaCl溶液，靜置2 min，觀察顏色變化，在400～800 nm波長下進行全掃描。

2 結果與分析

2.1 AuNPs的特性

AuNPs在510～550 nm的可見光光譜范圍內具有單一吸收峰，其溶液顏色也隨粒徑大小的不同而不同[38]。由圖3可知，檸檬酸鈉還原法制得的AuNPs溶液在520 nm處有1個特征吸收峰?；?20 nm處的吸光度值和消光系數(shù)2.70×108L·mol-1·cm-1，求得AuNPs的濃度為3.50 nmol·L-1。

圖3 納米金的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectrum of the AuNPs

2.2 最適鹽濃度

由圖4-A可知，隨著體系鹽濃度的增大，520 nm處的吸收峰逐漸下降，發(fā)生紅移。由圖4-B可知，當體系的鹽濃度低于0.04 mol·L-1時，溶液保持紅色不變；0.045 mol·L-1時顏色發(fā)生變化，由紅色開始轉紫色；且當鹽濃度為0.05 mol·L-1時，溶液為藍色，濃度繼續(xù)增大，藍色加深不明顯，吸收峰變化差異不大，表明體系中的AuNPs已經完全聚集。由于鹽濃度過高會干擾體系的檢測，使其靈敏度下降，因此選擇最適鹽濃度為0.05 mol·L-1。該結果與陳思銳等[39]對體系中鹽濃度優(yōu)化的結果相同。

注：氯化鈉濃度：1：0.00 mol·L-1；2：0.02 mol·L-1；3：0.04 mol·L-1；4：0.045 mol·L-1；5：0.05 mol·L-1；6：0.06 mol·L-1；7：0.08 mol·L-1。Note：Sodium chloride concentration.1:0.00 mol·L-1.2:0.02 mol·L-1.3:0.04 mol·L-1.4:0.045 mol·L-1.5:0.05 mol·L-1.6:0.06 mol·L-1.7:0.08 mol·L-1.圖4 不同氯化鈉濃度下AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜(A)和顏色變化(B)Fig.4 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Sodium Chloride concentrations

2.3 適配體濃度的優(yōu)化

圖5-A為不同濃度Apt-1孵育下的AuNPs溶液加鹽后在400～800 nm范圍的吸收光譜圖。當加入一定濃度鹽溶液后，裸AuNPs溶液變藍色(圖5-B)，且520 nm處的吸收峰下降，在700 nm左右開始出現(xiàn)新的吸收峰，說明此時金納米顆粒已發(fā)生聚集。隨著適配體濃度的升高，吸附在納米金表面的分子越多，對納米金顆粒的保護作用越強，表現(xiàn)在520 nm處的峰值逐漸增高，700 nm左右的峰值逐漸降低。當濃度為0.03 μmol·L-1和0.05 μmol·L-1時，保護作用初顯，表現(xiàn)為淡紫色和紫紅色；當適配體濃度為0.08 μmol·L-1時，顏色變?yōu)榧t色，說明適配體對AuNPs的保護充分；適配體濃度繼續(xù)加大，顏色變化不明顯，520 nm處的吸收峰差別不大，考慮到檢測的靈敏度，選擇0.08 μmol·L-1作為Apt-1的最佳孵育濃度。

注：適配體-1濃度：1:0.00 μmol·L-1；2:0.03 μmol·L-1；3:0.05 μmol·L-1；4:0.08 μmol·L-1；5:0.12 μmol·L-1；6:0.15 μmol·L-1。Note:Apt-1 concentration:1:0.00 μmol·L-1.2:0.03 μmol·L-1.3:0.05 μmol·L-1.4:0.08 μmol·L-1.5:0.12 μmol·L-1.6:0.15 μmol·L-1.圖5 不同Apt-1濃度下AuNPs溶液的紫外可見吸收光譜(A)和顏色變化(B)Fig.5 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Apt-1 concentrations

Apt-3的結構與Apt-1完全不同，與納米金的結合能力也有所差異。由圖6-A可知，隨著Apt-3的濃度增大，520 nm處的吸收峰逐漸升高；顏色如圖6-B所示，當Apt-3濃度為0.00 μmol·L-1時，納米金受鹽誘導發(fā)生聚集，變?yōu)樗{色。當加入0.03 μmol·L-1的Apt-3溶液時，部分納米金發(fā)生聚集，顏色為紫色；孵育Apt-3體系濃度達到0.06 μmol·L-1時，溶液呈現(xiàn)為紅色，對AuNPs的保護作用顯著，Apt-3濃度升高，溶液顏色保持為紅色，其穩(wěn)定性也不會隨著濃度的增大而變化[36]。確定最終的Apt-3孵育濃度為0.06 μmol·L-1。

注：適配體-3濃度：1:0.00 μmol·L-1；2:0.03 μmol·L-1；3:0.06 μmol·L-1；4:0.09 μmol·L-1；5:0.12 μmol·L-1；6:0.15 μmol·L-1。Note:Apt-3 concentration:1:0.00 μmol·L-1.2:0.03 μmol·L-1.3:0.06 μmol·L-1.4:0.09 μmol·L-1.5:0.12 μmol·L-1.6:0.15 μmol·L-1.圖6 不同Apt-3濃度下AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜(A)和顏色變化(B)Fig.6 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Apt-3 concentrations

2.4 Apt-AuNPs比色法檢測MC-LR

由圖7可知，裸AuNPs在加入鹽溶液后發(fā)生聚集，變成灰藍色。隨著MC-LR的濃度升高，適配體優(yōu)先與MC-LR特異性結合形成特殊構象，AuNPs逐漸失去外層的保護作用，在高鹽濃度下，越來越多的AuNPs發(fā)生聚集變色，藍色加深。當體系的MC-LR濃度為0 ng·mL-1時，反應液為紫紅色，當體系的MC-LR濃度達到70 ng·mL-1時，反應液呈現(xiàn)灰紫色，并且隨著MC-LR濃度的升高顏色逐漸加深(圖7-A)。當體系中MC-LR達到30 ng·mL-1時，反應液呈現(xiàn)灰紫色，隨著MC-LR濃度的增大，顏色加深為灰藍色(圖7-B)。

注：微囊藻毒素-LR濃度：A1：裸納米金；A2：0 ng·mL-1(未加鹽)；A3：0 ng·mL-1；A4：40 ng·mL-1；A5：70 ng·mL-1；A6：100 ng·mL-1；A7：120 ng·mL-1；A8：150 ng·mL-1。B1：裸納米金；B2：0 ng·mL-1(未加鹽)；B3：0 ng·mL-1；B4：10 ng·mL-1；B5：30 ng·mL-1；B6：50 ng·mL-1；B7：70 ng·mL-1；B8：100 ng·mL-1；B9:120 ng·mL-1。Note：MC-LR concentration.A1:Pure AuNPs.A2:0 ng·mL-1(no Sodium Chloride).A3:0 ng·mL-1.A4:40 ng·mL-1.A5:70 ng·mL-1.A6:100 ng·mL-1.A7:120 ng·mL-1.A8:150 ng·mL-1.B1:pure AuNPs.B2:0 ng·mL-1(no sodium chloride).B3:0 ng·mL-1.B4:10 ng·mL-1.B5:30 ng·mL-1.B6:50 ng·mL-1.B7:70 ng·mL-1.B8:100 ng·mL-1.B9:120 ng·mL-1.圖7 對不同濃度微囊藻毒素-LR檢測下(Apt-1)-AuNPs(A)和(Apt-3)-AuNPs(B)反應液顏色變化Fig.7 Visual color changes of the (Apt-1)-AuNPs(A)and (Apt-3)-AuNPs(B)solutions for detection of MC-LR with different concentrations

2.5 納米金定量檢測MC-LR

由圖8可知，隨著MC-LR的濃度加大，520 nm的吸收峰逐漸降低，最大吸收峰由520 nm右移至700 nm左右處。由圖9可知，當MC-LR濃度范圍為0～120 ng·mL-1時，(Apt-3)-AuNPs體系檢測MC-LR的A673/A520比值與MC-LR的濃度呈線性關系，其線性回歸方程為y=0.007x+0.564(R2=0.988 5)，線性關系良好，根據(jù)LOD=3×SD/K(SD為空白標準偏差，K為標準曲線斜率)，求得其理論最低檢測限為7.08 ng·mL-1。

圖8 不同濃度的微囊藻毒素-LR溶液下(Apt-3)-AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜Fig.8 UV-vis absorption spectra of the (Apt-3)-AuNPs solution with different MC-LR concentrations

圖9 微囊藻毒素-LR濃度與 (Apt-3)-AuNPs溶液A673/A520的關系Fig.9 Correlation between MC-LR concentration and A673/A520of (Apt-3)-AuNPs solution

2.6 AuNPs比色法檢測MC-LR的特異性

為了分析基于Apt-1和Apt-3所建立的AuNPs比色法的特異性，選取了3種可能與MC-LR共存于污染水體的干擾物質：四螨嗪、阿特拉津以及草甘膦。由圖10-A、B可知，在最優(yōu)反應條件下，當MC-LR和其他干擾物均為100 ng·mL-1時，(Apt-1)-AuNPs和(Apt-3)-AuNPs兩個檢測體系僅在MC-LR存在時出現(xiàn)明顯的凝集反應，吸收峰發(fā)生明顯的紅移。而四螨嗪、阿特拉津以及草甘膦由于無法使適配體從AuNPs上脫離，加入鹽溶液后仍然表現(xiàn)為紅色，并且反應混合液在520 nm處出現(xiàn)了特征峰，說明基于Apt-1和Apt-3所建立的AuNPs檢測方法特異性良好。

注：A,C：Apt-3;B,D：Apt-1；1-6：Apt-AuNPs solution、裸AuNPs、MC-LR、四螨嗪、阿特拉津、草甘膦。Note:A，C:Apt-3.B,D:Apt-1.1-6:Apt-AuNPs solution,pure AuNPs,MC-LR,clofentezine,atrazine,glyphosate.圖10 AuNPs比色法的特異性評價Fig.10 Evaluation of the specificity of the AuNPs assay

3 討論

隨著篩選技術的成熟，越來越多的靶標分子的核酸適配體被篩選出來，并應用到快速檢測、傳感器開發(fā)、靶向藥物研究等方面[34]。在篩選得到原始適配體后，一般都要求對其進行截短、修飾或者堿基突變等序列優(yōu)化以滿足不同領域的需要[40-41]。核酸適配體對靶標的特異性識別是基于其自身多樣性的二級結構諸如發(fā)夾、假結、莖、環(huán)、G-四聚體等，在遇到靶標時會發(fā)生自適應性的構象變化，形成特殊的三維結構，通過范德華力和氫鍵等作用達到力的平衡，形成穩(wěn)定的復合物[41-42]。陳思銳等[39]通過對Apt-1兩端分別依次剪裁2個堿基得到新適配體序列56MC-LR、52MC-LR、48MC-LR等，發(fā)現(xiàn)除了56MC-LR，其他截短的適配體活均性有所下降，推測這可能與Apt-1的5′始端唯一的環(huán)部結構被破壞有關。

由于富含G的序列更容易形成分子間或分子內G-四聚體等穩(wěn)定構象[42]，因此將5′端第3個堿基C突變?yōu)镚，突變后得到的Apt-3的二級結構發(fā)生了明顯改變。將Apt-1和Apt-3分別與納米金溶液孵育后，(Apt-1)-AuNPs體系在MC-LR濃度為70 ng·mL-1時可觀測到顏色變化，而經突變后的(Apt-3)-AuNPs體系在MC-LR濃度為30 ng·mL-1即可表現(xiàn)出明顯的顏色差異。這說明Apt-1、Apt-3與MC-LR具有良好的親和力，而Apt-3表現(xiàn)出更強的親和力。

結果表明，將第3位堿基C突變?yōu)镚并沒有影響適配體與靶標分子的有效結合，推測該位點并不是適配體與MC-LR作用的結合位點[34]。由于適配體結構變化可使其與靶標結合的空間距離發(fā)生改變，從而影響對靶標的親和力。有研究認為適配體環(huán)狀部位為其主要的結合區(qū)域，由莖部結構作為“雙臂”支撐來保持其穩(wěn)定性[43]。據(jù)此推測Apt-3親和力增加可能是由于其形成了更復雜的莖環(huán)結構，吉布斯自由能更小，穩(wěn)定性增加以及其與靶標分子的空間距離改變。

(Apt-3)-AuNPs對MC-LR的理論最低檢測限為7.08 ng·mL-1，線性檢測范圍為0～120 ng·L-1，說明檢測效果良好。Hu等[44]研究了檢測MCs的SPR免疫傳感器，線性范圍達到1～100 μg·L-1，Chen等[45]構建的SPR免疫傳感器檢測MC-LR，檢出限為0.55 ng·mL-1，但是SPR免疫傳感器的制作成本高，難以推廣使用。本試驗所用的適配體和納米金成本低，操作簡便，靈敏度較高，優(yōu)化序列后獲得比Apt-1親和力更高的Apt-3，能在一定程度上滿足可視化的現(xiàn)場檢測需求。

適配體非必需堿基的存在可影響其與靶標的結合[40]，接下來還需要對Apt-3進行裁剪優(yōu)化，以探究與靶標MC-LR的核心結合區(qū)域，獲得親和性更高的適配體，通過進一步優(yōu)化反應時間、體系pH值、修飾適配體等途徑提高檢測體系的靈敏度，實現(xiàn)實時、快速、簡便、可視化的現(xiàn)場檢測。

4 結論

本研究通過定點突變獲得Apt-3，在(Apt-3)-AuNPs孵育體系中加入靶標MC-LR，AuNPs在高鹽濃度下可發(fā)生不同程度的聚集，出現(xiàn)顏色變化。發(fā)現(xiàn)突變后的Apt-3依然保持高特異性，與Apt-1相比，Apt-3與MC-LR的親和力更高，推測該突變位點不是靶標的活性作用位點，突變后的Apt-3擁有更復雜的莖環(huán)結構，有利于與小分子MC-LR的結合。建立的(Apt-3)-AuNPs體系實現(xiàn)了對MC-LR的定量、快速、簡便靈敏的檢測。本研究結果為后續(xù)探究靶標分子識別與結合機制，開發(fā)更高靈敏度的傳感器提供了依據(jù)。