海藻糖對轉(zhuǎn)C4型PEPC水稻種子萌發(fā)耐旱性的影響

李佳馨 謝寅峰 李 霞,3,* 王 凈

(1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國家水稻改良中心南京分中心/國際水稻所-江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合實驗室,江蘇 南京 210014；2 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210037；3 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

近年來全球水稻(Oryzasativa)的主糧產(chǎn)區(qū)頻繁遭受以干旱為主的自然災(zāi)害，嚴(yán)重威脅世界糧食安全[1]。在高光強、干旱和低氮等逆境下，C4植物較水稻等C3植物具有明顯的光合、生長及產(chǎn)量優(yōu)勢[2]。與未轉(zhuǎn)基因野生型水稻(WT)相比，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得的高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4型PEPC基因水稻[3](以下簡稱PC)，不僅光合能力增強、產(chǎn)量提高，而且表現(xiàn)出較高的耐高光強[4]、耐光氧化[5]、耐旱[6]及耐低氮[7]等特性。因此，深入研究該材料在不同生長階段的耐旱機制，將為減輕水稻干旱脅迫提供理論依據(jù)。

水稻種子在田間萌發(fā)過程中常遭遇干旱，導(dǎo)致其發(fā)芽率下降，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量，已成為目前直播稻田迫切需要解決的生產(chǎn)問題[8-9]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)是參與C4植物光合作用的關(guān)鍵酶，也參與調(diào)控種子萌發(fā)和幼苗建成[10]。目前對PC水稻苗期耐旱機制的研究發(fā)現(xiàn)，干旱會使PC觸發(fā)第二信使，如過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)[11]、一氧化氮(nitric oxide，NO)[12]、鈣離子(calcium ion，Ca2+)[13-14]和磷脂酸(phosphatidic acid，PA)[15]等，通過調(diào)控鈣依賴和糖信號[16]激酶相關(guān)基因，如CPK4和CPK9[17]以及蔗糖非發(fā)酵1(sucrose nonfermenting-1，SNF1)相關(guān)蛋白激酶(sucrose nonfermenting-1-related protein kinase，SnRKs)亞家族中SnRKs基因[18]等激活級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)C4-PEPC的轉(zhuǎn)錄與翻譯，促進(jìn)花青素合成，維持穩(wěn)定的光合能力，表現(xiàn)耐旱[19-20]。最近的研究發(fā)現(xiàn)PC在萌發(fā)期對干旱的耐性也強于WT，這與蔗糖和表觀遺傳機制相關(guān)糖信號基因的差異表達(dá)有關(guān)[21-22]，提示糖信號可能在PC水稻萌發(fā)期的耐旱機制中也發(fā)揮重要作用。

海藻糖(trehalose，Tre)是重要的糖信號分子，由海藻糖-6-磷酸酶(trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)磷酸化海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosphate，T6P)生成[23]。已知海藻糖可通過參與T6P/SnRK1s介導(dǎo)的糖信號級聯(lián)放大，調(diào)節(jié)葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蔗糖代謝以及淀粉合成[24-25]。外施海藻糖可增強植物對環(huán)境脅迫的耐受性[26-28]。敲除OsTPP1的水稻突變體發(fā)芽速度降低，但可通過外施海藻糖恢復(fù)[29]。目前關(guān)于海藻糖對逆境脅迫下植物種子萌發(fā)影響的研究主要集中在最適濃度篩選[30]、種子生根緩解效應(yīng)[31]以及抗氧化能力變化[32-33]等方面，而對參與其早期響應(yīng)脅迫糖代謝相關(guān)生理和分子機制的研究尚不深入。此外，海藻糖代謝是激活PEPC酶活性的潛在途徑之一[34]。因此，本研究以PC和WT為試驗材料，在12%(m/v)聚乙二醇(polyethylene glycol-6000，PEG-6000)和海藻糖單獨或聯(lián)合處理下，觀察水稻種子萌發(fā)、內(nèi)源可溶性糖及糖組分、脯氨酸含量、α-淀粉酶活性及相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，旨在明確海藻糖對水稻萌發(fā)期干旱耐性的生物學(xué)功能以及品種差異的生理機制，豐富糖代謝在水稻萌發(fā)期干旱響應(yīng)的相關(guān)信息，并為“C4稻”的創(chuàng)制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用水稻是由Ku等[3]以Kitaake為受體，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，將完整的玉米C4-PEPC基因?qū)胨?，產(chǎn)生的高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4-PEPC基因水稻(PC)，其中導(dǎo)入的玉米PEPC基因包含所有外顯子、內(nèi)含子、啟動子(從-1212)和約2.5 kb的終止子，基因片段全長8.8 kb[35]，以未轉(zhuǎn)基因原種(WT)為對照。

1.2 試驗設(shè)計

參照張金飛等[18]的方法，選擇大小一致、顆粒飽滿的供試種子，經(jīng)75%酒精消毒5 min，去離子水充分沖洗后，用5%的次氯酸鈉消毒10 min，再用去離子水沖洗干凈。先放入裝有40 mL清水的培養(yǎng)皿中，30℃黑暗下浸種24 h后將其均勻放置在鋪有3層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿100粒，在RTOP-100Y人工氣候培養(yǎng)箱(托普云農(nóng)，杭州)中30℃黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗。設(shè)置如下4個處理：蒸餾水處理(CK)、12%PEG-6000模擬干旱處理(PEG)，12%PEG-6000+0.5 mmol·L-1海藻糖處理(PEG+T1)、12%PEG-6000+10 mmol·L-1海藻糖處理(PEG+T2)。取不同處理時間的水稻發(fā)芽種子液氮速凍后，置于-80℃冰箱凍存，用于測定生理指標(biāo)和基因表達(dá)量。并用鈣離子螯合劑乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA)，設(shè)置PEG+T1+EGTA(10 mmol·L-1EGTA)的聯(lián)合處理，觀察其對水稻第120 h發(fā)芽的影響。每處理至少3次重復(fù)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 種子萌發(fā)測定 本研究中發(fā)芽率自120 h以后不再發(fā)生變化，因此記錄0～120 h的發(fā)芽率、根長和芽長。于120 h時取部分處理樣品經(jīng)105℃殺青30 min，80℃烘干至恒量后，稱重。每處理取18粒種子，3次重復(fù)。發(fā)芽率(發(fā)芽以胚根長度>1 mm為標(biāo)準(zhǔn))每隔24 h計錄一次，直至完全萌發(fā)。根據(jù)公式計算發(fā)芽參數(shù)[29,36]：

發(fā)芽率=120 h內(nèi)正常幼苗數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)=ΣGt/Dt (Gt為時間t的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))

(2)

活力指數(shù)=GI×S (S為單株幼苗干重質(zhì)量，g)

(3)。

1.3.2 脯氨酸含量測定 采用酸性茚三酮法測定[37]。

1.3.3 可溶性總糖含量測定 采用蒽酮比色法測定[38]。

1.3.4 糖組分含量測定 蔗糖、葡萄糖和果糖含量測定參照文獻(xiàn)[39]的方法；海藻糖含量測定參照Ilhan等[40]的方法。

1.3.5 α-淀粉酶活性測定 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定[41]。

1.3.6 總RNA提取和實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄分別采用Mini BEST Plant RNA Extraction Kit (Cat No.9769，TaKaRa，大連)和Prime Script RT Master Mix Perfect Real Time(Cat No.RR036Q，TaKaRa，大連)試劑盒說明書進(jìn)行。用TB Green Premix Ex TaqII ROX plus(Cat No.RR82LR，TaKaRa，大連)試劑盒，在Applied Biosystems Step One實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：TB GreenPremixExTag II(Tii RNaseH Plus)10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各 0.8 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL，DNA模板 2 μL，滅菌水 6 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性 30 s，55℃退火40 s，60℃延伸1 min，共32次循環(huán)。3次重復(fù)。采用Primer 3設(shè)計引物，以水稻組成性表達(dá)的Act基因作為內(nèi)部參照，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的基因和引物Table 1 Genes and primers for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析。使用Oringin 9.0繪圖。使用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子萌發(fā)的影響

已知種子發(fā)芽72 h的發(fā)芽率又稱發(fā)芽勢，是種子在萌發(fā)和成苗期間活力的綜合表現(xiàn)[42]。如圖1所示，PEG處理均顯著降低了PC和WT種子的發(fā)芽勢(72 h)、發(fā)芽率(120 h)(圖1-A)、發(fā)芽指數(shù)(圖1-B)以及活力指數(shù)(圖1-C)，表明干旱脅迫對2種水稻種子的萌發(fā)均產(chǎn)生了抑制作用，但對PC的影響相對較小。外源海藻糖處理可不同程度地緩解干旱脅迫對2種水稻種子萌發(fā)的抑制作用，其中PEG+T1(PEG+0.5 mmol·L-1海藻糖)對PC的緩解效應(yīng)明顯好于WT，而PEG+T2(PEG+10 mmol·L-1海藻糖)對WT的緩解效果好于PC，這與發(fā)芽表型的結(jié)果一致(圖1-D)。表明，外施海藻糖對供試水稻干旱條件下種子萌發(fā)均具有緩解作用，其中低濃度的海藻糖即可對PC發(fā)揮明顯的緩解效果。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。標(biāo)尺=1 cm。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.Bars=1 cm.The same as following.圖1 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of trehalose on seed germination of rice under drought stress

2.2 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子根和芽生長的影響

由圖2可知，PEG處理均抑制了PC和WT種子根(圖2-A、B)和芽(圖2-C、D)的生長，其中對PC的抑制作用較??；外源海藻糖處理則可以緩解干旱對供試水稻根和芽生長的抑制(圖2-F)，其中PC的緩解有效濃度(0.5 mmol·L-1海藻糖)較WT(10 mmol·L-1海藻糖)更低。如圖2-E所示，各處理PC與WT的根芽比均在發(fā)芽72 h達(dá)至峰值，其中PEG處理下的根芽比顯著高于CK，且PC顯著高于WT；外源海藻糖處理(PEG+T1、PEG+T2)在發(fā)芽24 h時種子的根芽比顯著高于PEG處理，96～120 h時種子根芽比恢復(fù)至正常水平?？梢?，海藻糖處理使供試水稻種子在萌發(fā)過程中可以迅速響應(yīng)干旱脅迫，促進(jìn)種子生根，緩解芽的生長抑制；相比WT，較低濃度的海藻糖對PC種子的效果更顯著。

2.3 不同濃度海藻糖處理激活干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)PEPC相關(guān)基因的表達(dá)

PC中內(nèi)源的C3型PEPC基因(Osppc2a)和外源導(dǎo)入的C4型PEPC基因(C4-PEPC)表達(dá)結(jié)果如 圖3所示。外施海藻糖可誘導(dǎo)干旱脅迫下PC和WT種子內(nèi)Osppc2a的基因表達(dá)，但兩品種在響應(yīng)干旱時的差異表現(xiàn)主要歸因于PC中外源導(dǎo)入的C4-PEPC基因表達(dá)量大幅提高。

2.4 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)可溶性糖和脯氨酸含量的影響

由表2可知，在WT中，不同處理種子的總可溶性糖和脯氨酸含量在發(fā)芽期間均呈先增后減的趨勢，均在發(fā)芽48 h達(dá)到峰值；而在PC中，除CK與WT變化一致，其他各處理在發(fā)芽72 h仍可以維持較高的水平，且此時PEG+T1處理下總可溶性糖和脯氨酸的含量也高于同一處理下48 h的。此外，PEG+T1在發(fā)芽72 h的總可溶性糖含量和脯氨酸含量也高于同時間的WT?？梢姡^低濃度海藻糖(0.5 mmol·L-1)即可以促進(jìn)干旱脅迫下PC種子內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，而且相比WT維持的時間更長。

表2 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)總可溶性糖含量和脯氨酸含量的影響Table 2 Effects of different concentrations of trehalose on the content of total soluble sugar and proline of rice under drought stress

2.5 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)可溶性糖組分含量的影響

由表3可知，可溶性糖組分(蔗糖、果糖、葡萄糖和海藻糖)的結(jié)果顯示，各處理PC和WT種子內(nèi)蔗糖與葡萄糖含量在萌發(fā)期間均呈先增加后降低的趨勢，峰值均出現(xiàn)在2 h，海藻糖含量的峰值也出現(xiàn)在2 h，此時不同處理間的差異最大；而果糖含量在萌發(fā)期間變幅不大。表明，外施海藻糖可以促進(jìn)內(nèi)源海藻糖、蔗糖和葡萄糖的合成，有利于其響應(yīng)干旱脅迫。

表3 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)可溶型糖組分含量的影響Table 3 Effects of different concentrations of trehalose on sugar components content of rice under drought stress /(mmol·L-1)

2.6 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)α-淀粉酶及海藻糖合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

OsAmy3/8是水稻種子內(nèi)編碼α-淀粉酶的關(guān)鍵基因[43-44]；MYBS1/2是通過感受糖和能量變化，調(diào)控α-淀粉酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[45]。由圖4-A、B、C可知，PEG處理可以上調(diào)PC中OsAmy3、OsAmy8和OsMYBS1的表達(dá)，下調(diào)WT中3個基因的表達(dá)；外源海藻糖處理(PEG+T1、PEG+T2)均促進(jìn)了供試水稻中3個基因的表達(dá)，其中3個基因的表達(dá)水平在T1中兩材料間差異最大。OsMYBS2的表達(dá)水平變化則與OsMYBS1相反(圖4-D)。

圖4 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)α-淀粉酶及海藻糖合成相關(guān)基因的影響Fig.4 Effects of different concentrations of trehalose on α-amylase and trehalose related gene expression of rice under drought stress

OsTPP1/OsTPP7是海藻糖合成的關(guān)鍵基因，也參與調(diào)控種子萌發(fā)過程中T6P/SnRK1s介導(dǎo)的糖代謝[46-47]。由圖4-E、F可知，與CK相比，PEG處理顯著上調(diào)了兩種供試水稻中OsTPP1的表達(dá)水平，但OsTPP7僅在PC內(nèi)上調(diào)，且PC的2個基因表達(dá)水平均顯著高于WT；同時，PEG+T1進(jìn)一步上調(diào)了PC內(nèi)OsTPP1/OsTPP7的表達(dá)，且在該海藻糖處理濃度下兩材料基因表達(dá)水平差異最大。綜上可知，干旱脅迫下，外施低濃度海藻糖可通過誘導(dǎo)PC內(nèi)源海藻糖代謝和調(diào)控α-淀粉酶的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)而響應(yīng)干旱。

2.7 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)SnRKs家族相關(guān)基因的表達(dá)影響

植物中SnRKs分為3個亞族(SnRK1s、SnRK2s和SnRK3s)，是聯(lián)系糖信號與脅迫響應(yīng)的的關(guān)鍵樞紐[48-49]。由圖5可知，相比CK，PEG處理上調(diào)了PC和WT內(nèi)SAPK8/SAPK9的表達(dá)，且PC顯著高于WT，而OsK/a和OsK24相關(guān)基因則在PC中上調(diào)，在WT中被下調(diào)，且PC顯著高于WT。相比PEG，PEG+T1顯著提高了PC中SAPK8和SAPK9相關(guān)基因的表達(dá)，PC顯著高于WT。此外，OsK1a、OsK24、OsSnRK3.1、OsSnRK3.23部分基因的轉(zhuǎn)錄水平變化與OsTPP1、OsTPP7、OsMYBS1以及OsAmy3/8的變化表現(xiàn)同步?？梢?，干旱脅迫下，外施低濃度海藻糖可通過誘導(dǎo)水稻芽期內(nèi)源海藻糖合成，激活OsK1a-OsMYBS1-OsAmy3/8途徑，促進(jìn)種子萌發(fā)，并上調(diào)SAPK8、SAPK9、OsSnRK3.1和OsSnRK3.23相關(guān)基因響應(yīng)脅迫，緩解干旱抑制，其中對PC的緩解效果更強。

圖5 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)SnRKs相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of trehalose on SnRKs related gene expression of rice under drought stress

2.8 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子內(nèi)α-淀粉酶活性的影響

由表4可知，種子萌發(fā)6 h時，在CK、PEG和PEG+T1處理下PC和WT兩材料內(nèi)的α-淀粉酶活性均開始有不同表現(xiàn)，其中PEG處理抑制了供試材料的α-淀粉酶活性，且對WT的抑制作用更強；與PEG+T1和PEG+T2的發(fā)芽率表現(xiàn)一致，較低濃度的海藻糖就可以上調(diào)PC內(nèi)α-淀粉酶的活性；低濃度海藻糖處理在72 h仍可維持PC內(nèi)較高的α-淀粉酶治性，這也與其在可溶性糖中的表現(xiàn)相同。

表4 不同濃度海藻糖處理對干旱脅迫下供試水稻種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性的影響Table 4 Effects of different concentrations of trehalose on α-amylase activity of rice under drought stress

注：Bars=1 cm。圖6 Ca2+對低濃度海藻糖緩解干旱脅迫下供試水稻種子萌發(fā)的影響Fig.6 Effect of Ca2 + on the germination of rice under drought stress to low concentration trehalose

2.9 Ca2+對低濃度海藻糖緩解干旱脅迫下供試水稻種子萌發(fā)的影響

植物中SnRK3s(也稱CIPKs)相關(guān)基因需與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin B-like，CBL)相互作用共同轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣信號，進(jìn)而調(diào)控逆境脅迫中植物的生長[50-51]。由圖6-A可知，PEG處理上調(diào)了PC內(nèi)CBL1的表達(dá)水平，但下調(diào)了WT內(nèi)CBL1的表達(dá)水平；相比PEG處理，PEG+T1進(jìn)一步上調(diào)了PC中的CBL1，PEG+T2則對WT中CBL1表達(dá)的促進(jìn)效果更強；且在較低海藻糖處理濃度下PC與WT之間差異更明顯，PC顯著高于WT；同時，CBL1在兩材料各處理下的表達(dá)水平變化均與相應(yīng)的OsSnRK3.1、OsSnRK3.23(圖5-E、F)趨勢類似。引入了鈣離子螯合劑EGTA(圖6-B、C)后，PC種子的發(fā)芽率較PEG+T1顯著降低，但仍略高于PEG處理，提示Ca2+參與海藻糖對PC水稻萌發(fā)期耐旱性的增強機制。

3 討論

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在植物的生長和響應(yīng)非生物脅迫中均發(fā)揮重要作用[9]。前期對具有耐旱特性的PC水稻已有系列研究[52]，明確了干旱會使PC觸發(fā)其內(nèi)源H2O2[10]、NO[11]、Ca2+[12-13]、PA[14]和糖[15]等信號分子，并通過調(diào)控鈣依賴和糖信號激酶相關(guān)基因，如CPK4、CPK9[16]以及SnRKs基因等激活級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)外源C4-PEPC的轉(zhuǎn)錄與翻譯，促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，并維持穩(wěn)定的光合作用，表現(xiàn)耐旱[17-19]。且近期研究表明，PC在芽期對干旱的耐性也好于WT，并與其蔗糖[21]、DNA甲基化和可變剪接[22]水平的差異有關(guān)。本研究進(jìn)一步表明，外施低濃度海藻糖(0.5 mmol·L-1和10 mmol·L-1)可以緩解干旱脅迫對水稻種子萌發(fā)的抑制；相比WT，較低濃度(0.5 mmol·L-1)的海藻糖即可對PC顯示較明顯的緩解效果，通過顯著增強其種子的α-淀粉酶活性而表現(xiàn)較強的耐旱性，而這些表現(xiàn)與其內(nèi)源海藻糖代謝、糖信號(SnRK1s和SnRK2s)、鈣信號(CBLs和SnRK3s)及PEPC相關(guān)基因的表達(dá)差異有關(guān)。

糖是影響植物種子萌發(fā)和早期幼苗建成的主要信號分子，也可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御脅迫[53]。在種子萌芽期間，蔗糖為胚芽的生長提供能量[54]。海藻糖作為信號分子，將生長與糖代謝聯(lián)系起來，并在植物的不同發(fā)育階段調(diào)控葡萄糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蔗糖代謝和淀粉分解等過程[55]。本研究結(jié)果表明，外施海藻糖調(diào)控干旱脅迫下PC種子萌發(fā)的機制由內(nèi)源海藻糖信號觸發(fā)，并與其他糖信號密切聯(lián)系。α-淀粉酶是促進(jìn)種子萌發(fā)的關(guān)鍵酶，可通過提高細(xì)胞中的糖水平，滿足植株生長所需的能量和碳需求，而這個過程受糖信號的調(diào)節(jié)[43]。MYBS1和MYBS2是與α-淀粉酶啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，MYBS1可在脅迫或能量虧缺時誘導(dǎo)淀粉蛋白啟動子活化，MYBS2則會抑制這一效應(yīng)[45]。有趣的是，海藻糖可以激活14-3-3蛋白去螯合MYBS2，進(jìn)而阻止其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮競爭性抑制作用[56]。本研究結(jié)果也顯示，PC較WT在干旱脅迫下表現(xiàn)更高的α-淀粉酶活性及OsAmy3、OsAmy8轉(zhuǎn)錄水平，而OsMYBS1表達(dá)水平上調(diào)，OsMYBS2下調(diào)，并且PC高于WT。推測外源海藻糖可能通過阻止OsMYBS2進(jìn)入細(xì)胞核，使OsMYBS1與更多的OsAmy3、OsAmy8啟動子結(jié)合，有利于激活α-淀粉酶，從而表現(xiàn)耐旱。

植物中SnRKs(SnRK1s/2s/3s)是聯(lián)系糖信號與脅迫信號的關(guān)鍵因子[57]。在逆境條件下，植物中糖類化合物的重分配會導(dǎo)致能量失衡，SnRK1s蛋白激酶則被激活[49]。SnRK1s基因包括OsK1a、OsK24和OsK35，其中OsK1a位于OsMYBS1和OsAmy3基因的上游，通過提高OsMYBS1啟動子的活性，促進(jìn)淀粉代謝[58]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是TPP基因的激活劑，當(dāng)能量較少時，OsTPP1和OsTPP7編碼的TPP活性增強，進(jìn)而促進(jìn)海藻糖合成，并通過降低其合成前體T6P對OsK1a抑制效應(yīng)的方式，激活淀粉酶，調(diào)控源庫能量平衡[59-60]。本研究結(jié)果表明，各處理下PC中OsTPP1、OsTPP7、SnRK1a與MYBS1基因表達(dá)水平的變化與其對應(yīng)的OsAmy3、OsAmy8表達(dá)量以及內(nèi)源海藻糖和蔗糖含量(2 h)變化表現(xiàn)一致，提示外源海藻糖通過促進(jìn)干旱脅迫下PC內(nèi)源海藻糖代謝，激活OsK1a-OsMYBS1-OsAmy3/8系統(tǒng)，并通過蔗糖-T6P/SnRK1s途徑調(diào)節(jié)糖代謝平衡，造成PC與WT種子萌發(fā)過程中的糖水平差異而表現(xiàn)不同的耐旱性，但具體機制仍需深入研究。SnRK2s(SAPK1-10)不僅可以響應(yīng)非生物脅迫，而且在調(diào)節(jié)種子萌發(fā)中也起關(guān)鍵作用[61]。例如，SAPK8、SAPK9和SAPK10可以開啟脫落酸(abscisic acid,ABA)信號通路模式，增強植株的脅迫耐受性[61]。qSE3可通過提高鹽脅迫下水稻種子中SAPK9和SAPK10的表達(dá)水平，促進(jìn)種子萌發(fā)[62]。本研究結(jié)果顯示，相比WT，較低濃度海藻糖處理可明顯促進(jìn)干旱脅迫下PC中SAPK8和SAPK9的表達(dá)，提示外施海藻糖可能也通過增強SnRK2s部分基因的轉(zhuǎn)錄水平來提高PC萌發(fā)期的耐旱性。

α-淀粉酶是一種含Ca2+的金屬酶，其表達(dá)和分泌均需要Ca2+的參與，因此Ca2+對種子萌發(fā)時α-淀粉酶的基因表達(dá)以及酶活性的發(fā)揮至關(guān)重要[63]。例如，Ca2+阻斷劑處理水稻植株通過抑制感知Ca2+信號的CBL4-OsSnRK3.1表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié)OsAmy3的轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制種子萌發(fā)[64]。此外，Ca2+作為信號分子，可以刺激植物中海藻糖等滲透物質(zhì)的積累，以響應(yīng)脅迫[65]。本研究觀察到外施海藻糖可顯著上調(diào)干旱脅迫下PC內(nèi)CBL1-OsSnRK3.1/OsSnRK3.23的表達(dá)，這與海藻糖含量、α-淀粉酶活性和發(fā)芽率的表現(xiàn)一致，Ca2+螯合劑(EGTA)引入試驗進(jìn)一步證實了鈣離子的重要作用，提示海藻糖可能以Ca2+依賴的方式激活CBL1-OsSnRK3.1/OsSnRK3.23，正調(diào)節(jié)PC種子的萌發(fā)。值得關(guān)注的是，與WT相比，PC的發(fā)芽率并沒有被EGTA完全抑制，提示可能還存在其他機制參與海藻糖生物學(xué)功能的發(fā)揮。本研究結(jié)果表明，海藻糖處理大幅誘導(dǎo)了干旱脅迫下PC水稻中外源導(dǎo)入的C4-PEPC的表達(dá)，且各處理下C4-PEPC與淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)量的變化趨勢同步，提示兩材料萌發(fā)期響應(yīng)干旱的差異表現(xiàn)可能與C4-PEPC密切相關(guān)。然而，關(guān)于海藻糖是如何誘導(dǎo)PC萌發(fā)期C4-PEPC的表達(dá)，又是如何與Ca2+互作，還有待深入研究。本研究從海藻糖信號角度為PC萌發(fā)期獨特的耐旱生理機制提供了新線索，將有助于豐富多元糖信號在植物逆境響應(yīng)的相關(guān)信息。

4 結(jié)論

綜上，干旱條件下，外施海藻糖處理，可通過誘導(dǎo)依賴鈣信號的CBL1-SnRK3s，激活OsK1a-OsMYBS1/2-OsAmy3/8途徑，加劇淀粉的降解，上調(diào)蔗糖和葡萄糖的含量，促進(jìn)水稻種子萌發(fā)。相比WT，PC種子內(nèi)源海藻糖代謝更活躍，通過調(diào)節(jié)蔗糖-T6P/SnRK1s系統(tǒng)，促進(jìn)糖代謝，進(jìn)一步增強淀粉酶活性并提高可溶性總糖含量，同時顯著上調(diào)SAPK8/SAPK9，增強其萌發(fā)期的耐旱性。