熱輔助超聲波處理對獼猴桃濁汁的殺菌效果及品質(zhì)影響研究

葉 青 趙武奇 白斯可 張濟英 聶聰怡 錢 蕊 伍小丫

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119)

獼猴桃(Actinidiachinensis)富含氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]，與清汁、復配汁相比，獼猴桃濁汁能更多地保留獼猴桃原有的營養(yǎng)成分，具有原料利用率高，香氣及口感純正等優(yōu)點，受到越來越多消費者的青睞[2]。但新鮮的濁汁易受微生物和酶的影響，導致品質(zhì)變差，因此，殺菌滅酶是果汁生產(chǎn)中的關(guān)鍵工序[3]。目前，濁汁殺菌主要采用高溫短時殺菌和超高壓殺菌。高溫短時殺菌存在熱敏性營養(yǎng)物質(zhì)損失嚴重、色澤變暗及穩(wěn)定性降低的缺點[4]；超高壓殺菌存在設備投入大及密封性要求嚴格的缺點[5]。熱輔助超聲波處理是一種聲熱結(jié)合的殺菌技術(shù)[6]，具有安全性高、殺菌效果好、營養(yǎng)物質(zhì)損失少的優(yōu)點[7]，已在蘋果汁[8]、甘蔗汁[9]、南瓜汁[10]、楊梅汁[11]、草莓汁[12]等果蔬汁加工中取得了一定的效果，將其應用于獼猴桃濁汁的殺菌對于提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。本試驗在研究不同熱輔助超聲波處理工藝參數(shù)對獼猴桃濁汁理化特性的影響及殺菌效果的基礎上，優(yōu)化得出最佳工藝參數(shù)，以期為熱輔助超聲波技術(shù)應用于獼猴桃濁汁的加工過程提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦美獼猴桃，于2019年9月采自陜西省西安市周至縣佰瑞獼猴桃種植基地。選取成熟度基本一致、大小均勻、未軟化、無病蟲害、無機械損傷的獼猴桃。試驗前將獼猴桃置于0±0.5℃條件下貯藏。

抗壞血酸，成都市科龍化工試劑廠；平板計數(shù)瓊脂，北京市奧博星生物技術(shù)有限公司；碳酸氫鈉，西安化學試劑廠；草酸、蒽酮、碳酸鈣、蔗糖、石英砂、氫氧化鈉、氯化鈉，天津天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AB104-N電子天平，上海第二天平儀器廠；NS色差儀，深圳三恩馳科技有限公司；UV-1800紫外分光光度計，日本島津公司；8101手持式阿貝斯折光儀，大連先超科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；XO-SM50超聲波微波協(xié)同反應工作站，南京先歐儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 獼猴桃濁汁樣品的制備 獼猴桃清洗→去皮→切塊→榨汁→過濾(300目)→獼猴桃濁汁。

1.3.2 獼猴桃濁汁殺菌試驗 取50 mL獼猴桃濁汁樣品，密封包裝，以超聲功率、溫度、超聲時間為影響因素，進行Box-Behnken三因素三水平響應面試驗，其中超聲工作模式為：超聲工作2 s后停1 s。每個試驗重復3次，取平均值。響應面試驗因子與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因子與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.3 試驗指標的測定與計算

1.3.3.1 濁度的測定 將樣品搖勻后置于比色杯中，使用色差儀在總透射(total transmission,TTRAN)模式下測定濁度，使用前用蒸餾水校正[13]。

1.3.3.2 顏色、褐變度的測定 果汁顏色測定：通過色差儀直接測定L*、a*、b*值，按照公式計算色差值(△E)：

(1)

式中，L0、a0、b0為初始樣品的測定值；L*、a*、b*為殺菌后樣品測定值。

褐變度的測定[14]：使用分光光度計，以蒸餾水為空白，用420 nm波長下的吸光度表示褐變度。

1.3.3.3 營養(yǎng)組分的測定 參考《GB/T 10468-1989水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》[15]測定酸堿度(potential of hydrogen,pH)；用酸堿滴定法測定可滴定酸(titratable acid,TA)含量，以檸檬酸計，參照《GB/T 12456-2008食品中總酸的測定》[16]；采用蒽酮試劑法測定可溶性糖含量[17]；抗壞血酸(vitamin C,Vc)含量測定采用2,6-二氯靛酚滴定法，參照《GB 5009.86-2016食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》[18]；用紫外分光光度計測定總酚含量[19]；葉綠素含量用比色法測定[20]；用手持式糖度儀測定可溶性固形物(total soluble solids,TSS)含量[21]。

按照公式計算糖酸比、Vc保存率、葉綠素保存率：

(2)

(3)

(4)。

1.3.3.4 抗氧化物酶活性測定 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、過氧化物酶(peroxidase,POD)活性的測定分別采用鄰苯二酚比色法和愈創(chuàng)木酚比色法[22]。

1.3.3.5 菌落總數(shù)的測定 測定方法參照《GB 4789.2-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[23]。根據(jù)公式計算殺菌率[24]：

殺菌率=

(5)。

1.3.4 特征指標的篩選及最優(yōu)工藝參數(shù)的確定 將響應面試驗數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，在此基礎上利用主成分分析(principal component analysis,PCA)提取獼猴桃濁汁的理化特征指標，建立理化特征指標和殺菌率的二次方程回歸模型，分析影響各指標的主次因素及因素間的交互作用[25]。通過綜合優(yōu)化得出熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁的最佳工藝參數(shù)，其中各指標綜合的權(quán)重計算采用熵權(quán)法[26]確定。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件進行相關(guān)分析及PCA；使用Design Expert 10設計三因素三水平響應面試驗、進行數(shù)據(jù)分析、建立回歸方程，顯著水平設置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應面試驗結(jié)果

獼猴桃濁汁殺菌試驗的設計與試驗結(jié)果見表2。表中1～17號是響應面設計的17組殺菌條件所得樣品的測定值，18號是未處理樣品測定值。

2.2 獼猴桃濁汁理化特征指標提取

殺菌是果汁加工生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，因此選取殺菌率作為優(yōu)化工藝參數(shù)的主要指標之一。對表2，表3中的pH、濁度(nephelometric turbidity unit,NTU)、TA含量、L*、a*、b*、△E、褐變度(degree of browning,DB)、Vc保存率、糖酸比、TSS含量、總酚含量、可溶性糖含量、葉綠素保存率、POD活性、PPO活性16個指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。

表2 獼猴桃濁汁殺菌試驗設計與結(jié)果Table 2 Experimental design and result of sterilization of cloudy kiwi juice

表3 獼猴桃濁汁殺菌試驗設計與結(jié)果Table 3 Experimental design and result of sterilization of cloudy kiwi juice

由表4可知，16個指標的相關(guān)性較高，可利用變量相關(guān)性合理分組的主成分分析法減少變量個數(shù)，提取理化特征指標，其中PPO和POD活性與獼猴桃果汁的外觀品質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)性高，因此，可將這兩種酶與其他理化指標一起進行特征提取。

表4 16項指標的相關(guān)性分析Table 4 Correlation coefficient of 16 indices

圖1為對16個評價指標進行主成分分析時的成分特征值貢獻碎石圖，圖中越陡峭的線段對應的成分對變異貢獻率越大，反之則越小?？梢钥闯觯?個成分曲線陡峭，第5個成分之后曲線斜率明顯增大。表5為主成分分析解釋總變量，前4個成分的累計方差貢獻率達到78.787%，表明這4個成分表達了獼猴桃濁汁理化指標的絕大多數(shù)信息。因此，可以將評價獼猴桃濁汁的理化指標壓縮為4個主成分。

表5 成分分析解釋總變量Table 5 Total variance explained of component analysis

由表6可知，成分1中代表性指標有葉綠素保存率、POD活性、pH、TA、Vc保存率，體現(xiàn)了獼猴桃汁的熱敏性成分保存率和酸味特征，其中葉綠素保存率的權(quán)重最大(0.881)，葉綠素保存率與pH、POD活性、Vc保存率之間呈顯著相關(guān)，因此可選取葉綠素保存率作為成分1的特征指標；成分2中代表性指標有PPO活力、DB、NTU、a*值，體現(xiàn)了獼猴桃汁的外觀特征和貯藏品質(zhì)，其中PPO活性權(quán)重最高(0.928)，PPO活性與NTU、DB之間呈極顯著相關(guān)，可選取PPO活性作為成分2的特征指標；成分3中代表性指標有△E值與b*、L*，體現(xiàn)了獼猴桃汁的色澤特征，其中△E值權(quán)重最高(0.958)，△E值與b*值、L*值均呈極顯著負相關(guān)，可選取△E為成分3的特征指標；成分4的代表性指標有TSS、可溶性糖含量、總酚含量、糖酸比，體現(xiàn)了獼猴桃濁汁的風味特征，雖然TSS的權(quán)重最高(0.886)，但考慮到糖酸比能更好地反映獼猴桃濁汁的風味特征，且糖酸比與TSS、可溶性糖含量均呈極顯著正相關(guān)，因此選擇糖酸比作為成分4的特征指標。綜上所述，篩選出的評價獼猴桃濁汁的理化特征指標為葉綠素保存率、PPO活性、△E值及糖酸比。

表6 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 6 Rotated component matrix of factor analysis

2.3 響應面回歸模型的建立與分析

采用Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型，可分別得到獼猴桃濁汁的葉綠素保存率(Y1)、PPO活性(Y2)、△E值(Y3)、糖酸比(Y4)和殺菌率(Y5)與熱輔助超聲波處理工藝條件之間的多項式模型，其中A、B、C為編碼自變量：

Y1=26.79-2.36A-14.86B-4.48C+7.08AB+4.25AC-0.94BC-11.98A2+15.85B2+10.19C2

(10)

Y2=37.18+0.14A-6.47B+1.10C+14.27AB+15.78AC+2.24BC+37.53A2-13.26B2+0.08C2(11)

Y3=2.85-0.65A+1.04B-0.14C+0.21AB+2.02AC-1.36BC+1.99A2+2.27B2-0.004C2

(12)

Y4=6.38-0.11A-0.19B+0.21C+0.49AB+0.06AC-0.38BC

(13)

Y5=81.47+6.28A+28.50B+9.73C-3.69AB-0.81AC-4.14BC-6.17A2-11.60B2-6.47C2

(14)

由表7可知，各指標失擬項均不顯著，建立的模型均顯著，表明回歸方程可信度高，可用于試驗結(jié)果的預測。各參數(shù)對葉綠素保存率的影響大小順序依次是B>C>A，B和B2對葉綠素保存率影響極顯著，A2和C2影響顯著；對PPO活性的影響大小順序依次是B>C>A，A2對PPO活性影響極顯著，AB、AC和B2對PPO活性影響顯著；對ΔE值影響的大小順序依次是A>C>B，B2和C2對ΔE值的影響極顯著，A和A2影響顯著；對糖酸比影響的大小順序依次是C>B>A，AB對糖酸比影響極顯著，C、BC和B2影響顯著；對殺菌率影響的大小次序依次是B>C>A，B、C和B2對殺菌率影響極顯著，A影響顯著。

表7 葉綠素保存率、PPO活性、△E值、糖酸比、殺菌率的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 7 Test of significance for regression equation coefficients of ratio of preservation rate of chlorophyll,activity of PPO,ΔE value,the ratio of sugar to acid,antibacterial rate

2.4 參數(shù)間交互作用分析

采用Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)分析，響應曲面圖可以直觀表現(xiàn)出各參數(shù)之間交互作用，拋物面越明顯，則參數(shù)之間的交互作用越強；反之則越弱。

圖2是超聲時間為17.5 min時，PPO活性與超聲功率和溫度的交互作用曲面圖。隨著超聲功率的增大，PPO活性呈先減小后增大的趨勢。這是由于當超聲功率小于450 W時，隨著超聲功率的增加，空化作用、熱效應和機械作用增強，滅酶效果增強，當超聲功率過高時，高強度超聲波易在超聲波探頭周圍形成稠密的空化云，阻礙了能量的傳播，滅酶效果反而越差[27]。

圖2 超聲功率與溫度交互作用對PPO活性的響應面圖Fig.2 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and temperature on activity of PPO

圖3是溫度為42.5℃時，PPO活性與超聲功率和超聲時間的交互作用曲面圖。當選用較低超聲功率及固定溫度時，隨著超聲時間的延長，空化作用時間延長，使得空化效果及滅酶效果更佳，PPO活性呈現(xiàn)減小的趨勢；當選用較高超聲功率時，由于空化效果較強，隨著超聲時間的延長空化效果更強，導致PPO的分子結(jié)構(gòu)改變，提高了PPO活性，滅酶效果變差。

圖3 超聲功率與超聲時間交互作用對PPO活性的響應面圖Fig.3 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and ultrasonic time on activity of PPO

圖4是超聲功率為450 W時，糖酸比與超聲時間和溫度的交互作用曲面圖。隨著溫度升高，超聲時間增加，獼猴濁汁糖酸比呈現(xiàn)增大的趨勢。這是由于超聲時間的延長對細胞破壞程度加大，細胞呼吸速率加快，一方面果實內(nèi)不溶性淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖；另一方面加速了有機酸的TAC循環(huán)和糖異生，使有機酸被轉(zhuǎn)化為糖或被氧化，致使TA含量減少[28]，這與張琪等[29]的研究結(jié)果一致。

圖4 超聲時間與溫度交互作用對糖酸比的響應面圖Fig.4 Response surface plots of the interaction of ultrasonic time and temperature on ratio of sugar to acid

圖5是超聲時間為17.5 min時，糖酸比與溫度和超聲功率的交互作用曲面圖。當超聲時間一定時，隨著溫度的升高，超聲功率的增大，糖酸比先減小后增大，這可能是由于溫度較低和超聲功率較小時，熱輔助超聲波處理對細胞破壞程度小，僅使得細胞內(nèi)有機酸釋放量增大，產(chǎn)生更多可滴定酸，而未能達到加速細胞呼吸的程度，可滴定酸消耗速率不變，整體表現(xiàn)為獼猴桃濁汁可滴定酸含量增大，糖酸比減?。划敎囟群统暪β试龃髸r，細胞呼吸作用顯著增強，有機酸被大量消耗，從而使糖酸比增大，其中可滴定酸的變化趨勢與曾祥媛等[30]的研究結(jié)果一致。

圖5 超聲功率與溫度交互作用對糖酸比的響應面圖Fig.5 Response surface plots of the interaction of ultrasonic power and temperature on ratio of sugar to acid

2.5 熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁最佳工藝參數(shù)的確定及驗證

將表2和表3中1～17組樣品的殺菌率及理化特征指標的數(shù)據(jù)進行標準化處理，根據(jù)標準化矩陣計算得出的信息熵和熵權(quán)如表8所示，可得出5個指標的權(quán)重比近似為2∶2∶4∶1∶2。

結(jié)果表明，葉綠素保存率越高，濁汁色澤越佳，外觀品質(zhì)越好，同時，葉綠素是熱敏性物質(zhì)，獼猴桃汁葉綠素保存率越高，其他熱敏性物質(zhì)的保存率也相對越高。PPO是催化果蔬酶促褐變的關(guān)鍵酶，PPO活性與果蔬褐變程度相關(guān)，PPO活性較低時，能有效抑制褐變的發(fā)生[31]。ΔE值越小說明處理后的濁汁與鮮樣色差越小，色澤保持度越高。糖酸比代表獼猴桃汁的風味特征，數(shù)值過大表示風味偏甜，味道單調(diào)，數(shù)值過小表示口感過酸，食用品質(zhì)差[32]。糖酸比為5～7的獼猴桃果汁酸甜可口[33]。

因此，以殺菌率最高、ΔE值最小、糖酸比為5～7、葉綠素保存率最高、PPO活力最小作為優(yōu)化目標，并根據(jù)指標權(quán)重比將5個指標的權(quán)重分別設為2、2、4、1、2，應用軟件的綜合優(yōu)化功能，對熱輔助超聲處理獼猴桃汁的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：超聲功率422.14 W、超聲時間30 min、溫度59.99℃?？紤]到實際條件，調(diào)整為：超聲功率420 W、超聲時間30 min、溫度60℃。在此工藝參數(shù)下處理的獼猴桃汁的試驗結(jié)果見表9。

表9 回歸方程預測效果表Table 9 Prediction effect of regression equation

由表9可知，在此工藝參數(shù)下理化特征指標和殺菌率的測定值與預測值的相對誤差均小于5%，表明建立的回歸模型可信度高，可用于熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁各項指標的預測。

3 討論

3.1 熱輔助超聲技術(shù)對獼猴桃濁汁的殺菌效果

最佳工藝條件下熱輔助超聲波對獼猴桃濁汁的殺菌率為95.68%，這與Nayak等[34]的研究結(jié)果一致。最佳工藝參數(shù)下，獼猴桃濁汁的菌落總數(shù)為27.2 CFU·mL-1，符合國家飲料食品衛(wèi)生標準GB 4789.2-2016的要求 (≤100 CFU·mL-1)[23,35]。熱輔助超聲波技術(shù)具有“熱效應”和“非熱效應”雙重殺菌作用，殺菌效果顯著。超聲波主要通過的空化作用進行殺菌，大量氣泡在液體媒質(zhì)中產(chǎn)生，運動中產(chǎn)生較大剪切力，同時在氣泡破裂瞬間形成局部的高溫高壓，微生物的細胞結(jié)構(gòu)被破壞，導致細胞溶解[36]。熱輔助超聲波各參數(shù)對殺菌率的影響由大到小依次是溫度(B)>超聲時間(C)>超聲功率(A)，3個參數(shù)對殺菌率均有顯著影響。隨著溫度的升高，超聲殺菌效果增強，這可能是因為在溫度升高的過程中，細胞膜流動性增強，導致細胞膜更易破裂，殺菌效果增強。而超聲功率增大，超聲時間延長都會增強超聲波的空化效果，進而提高殺菌率。

3.2 熱輔助超聲技術(shù)對獼猴桃濁汁理化特征指標的影響

在果蔬汁中由于酶的作用，營養(yǎng)物質(zhì)被分解，外觀品質(zhì)變差。POD與果蔬褐變和異味產(chǎn)生密切相關(guān)，是果蔬成熟和衰老的生理指標。本研究結(jié)果表明，熱輔助超聲波處理后的獼猴桃濁汁POD活性與未處理樣品相比有所降低(表2、表3)，說明熱輔助超聲處理可以抑制POD活性。POD具有熱穩(wěn)定性，通常當溫度達到80℃，POD才會完全失活。本研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃濁汁POD活性與葉綠素保存率、Vc保存率呈顯著正相關(guān)(表4)。這可能是因為高溫會降低POD活性，但同時也會破壞葉綠素和Vc等熱敏性成分。因此為了避免因高溫引起的營養(yǎng)物質(zhì)及外觀品質(zhì)的變化，不能將POD徹底滅活。PPO在有氧條件下與酚類物質(zhì)發(fā)生反應，酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)，再通過一系列脫水-聚合反應，最終形成黑褐色物質(zhì)，發(fā)生酶促褐變[37]。熱輔助超聲波對酶的作用機理較復雜，主要通過空化作用改變酶的結(jié)構(gòu)從而抑制酶的活性[38]。

熱輔助超聲處理能夠較好地保持獼猴桃汁的風味物質(zhì)和外觀品質(zhì)。與未處理樣品相比，熱輔助超聲處理的獼猴桃汁糖酸比有不同程度地增大，但均在5～7之間，在最佳工藝條件下，糖酸比為6.17，果汁酸甜可口，風味口感好，熱輔助超聲波技術(shù)可用于獼猴桃濁汁的加工。在最佳參數(shù)下，獼猴桃濁汁△E值為4.43，葉綠素保存率為30.99%，與未處理樣品差異較大。葉綠素在pH值為3.3左右的濁汁中很不穩(wěn)定，且耐熱性差，高溫處理使得葉綠素分解，導致獼猴桃濁汁綠色變淺。

4 結(jié)論

獼猴桃濁汁的理化特征指標為葉綠素保存率、糖酸比、△E值、PPO活性，建立的獼猴桃濁汁的理化特征指標及殺菌率的回歸方程模型具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可用于分析和預測熱輔助超聲處理參數(shù)對獼猴桃濁汁理化特征指標及殺菌率的影響；熱輔助超聲處理獼猴桃濁汁的最佳工藝條件為：超聲功率420 W、超聲時間30 min、溫度60℃，在此工藝條件下對獼猴桃濁汁進行處理，獼猴桃汁的殺菌率為95.68%、△E值為4.43、糖酸比為6.17、葉綠素保存率為30.99%、PPO活性為19.48 U·mL-1。熱輔助超聲波處理獼猴桃濁汁具有污染少，安全性好，無毒副作用等優(yōu)點，處理后的獼猴桃濁汁殺菌率高，品質(zhì)較好，結(jié)果表明熱輔助超聲波技術(shù)可用于獼猴桃濁汁的加工。