納布啡通過調(diào)控miR-4301/BRD4抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制研究

范清麗，張敏，吳楠，肖維萍

肝癌是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，手術(shù)仍是其主要治療方式［1］。近年來研究表明，麻醉可能與腫瘤病人術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)［2-3］。納布啡是一種嗎啡喃類半合成激動(dòng)-拮抗鎮(zhèn)痛藥，臨床常用于麻醉和疼痛治療，有研究發(fā)現(xiàn)納布啡可改善術(shù)后非小細(xì)胞肺癌病人機(jī)體免疫功能［4］。微小RNA（miRNA）參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為過程，如微小RNA-4301（miR-4301）在肝癌組織中下調(diào)表達(dá)［5-6］。然而納布啡和miR-4301對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚未清楚。因此，本研究旨在研究納布啡是否通過調(diào)控miR-4301影肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究時(shí)間為2019年1—7月。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑肝癌細(xì)胞株Huh7（美國ATCC）；納布啡（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)H20130128）；DMEM培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、蛋白裂解液（美國Sigma）；Transwell小室、基質(zhì)膠（美國BD）；總RNA提取試劑盒、熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（美國AAT Bioquest）；miR-4301模擬物（miR-4301）及模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-4301抑制表達(dá)載體（anti-miR-4301）及陰性對照（anti-miRNC）、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4野生型熒光素酶載體（WTBRD4）、溴結(jié)構(gòu)域蛋白4突變型熒光素酶載體（MUTBRD4）（北京源生思創(chuàng)生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)處理與分組肝癌細(xì)胞株Huh7常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期Huh7，用濃度分別為50 μmol、100 μmol、200 μmol的納布啡處理記為不同濃度納布啡處理組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組；將miR-NC、miR-4301分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞Huh7中，分別記為miR-NC組、miR-4301組；將antimiR-NC、anti-miR-4301分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞Huh7中再用200 μmol的納布啡處理記為納布啡+anti-miR-NC組、納布啡+anti-miR-4301組。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，檢測各孔吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell上室接種200 μL無血清細(xì)胞懸液，培養(yǎng)48 h，將多聚甲醛固以及結(jié)晶紫染色，最后用顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：用基質(zhì)膠包被Transwell小室的上室，然后同遷移實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)提取各組Huh7細(xì)胞總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，然后加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，顯影，成像，分析蛋白條帶的吸光度。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-4301和BRD4 mRNA表達(dá)水平提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-4301和BRD4分別以U6和GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR，相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-4301和BRD4的靶向關(guān)系將BRD4野生型及突變型熒光素 酶 載 體（WT-BRD4、MUT-BRD4）分 別 與miR-4301、miR-NC共轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞，按照說明書操作，檢測Huh7細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響與對照組相比，不同濃度納布啡處理可提高Huh7細(xì)胞抑制率和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）表達(dá)水平，降低遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)，降低細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)水平，且呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖1，表1。

表1 納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響∕±s

表1 納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響∕±s

注：Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，p21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。①與對照組比較，P＜0.05。②與納布啡50 μmol組比較，P＜0.05。③與納布啡100 μmol組比較，P＜0.05。

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圖1 肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.2 納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞中miR-4301/BRD4表達(dá)的影響與對照組相比，不同濃度納布啡組miR-4301表達(dá)水平升高，BRD4 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖2，表2。

圖2 肝癌Huh7細(xì)胞BRD4蛋白的表達(dá)

表2 納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞miR-4301∕BRD4表達(dá)的影響∕±s

表2 納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞miR-4301∕BRD4表達(dá)的影響∕±s

注：miR-4301為微小RNA-4301，BRD4 mRNA為溴結(jié)構(gòu)域蛋白4信使RNA，BRD4為溴結(jié)構(gòu)域蛋白4。①與對照組比較，P＜0.05。②與納布啡50 μmol組比較，P＜0.05。③與納布啡100 μmol組比較，P＜0.05。

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2.3 miR-4301靶向調(diào)控BRD4的表達(dá)Starbase預(yù)測發(fā)現(xiàn)BRD4與miR-4301有結(jié)合位點(diǎn)。miR-4301與WTBRD4共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Huh7熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而miR-4301與MUT-BRD4共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞Huh7的熒光素酶活性差異不顯著。miR-4301組BRD4表達(dá)水平低于miR-NC組（0.22±0.02）比（0.57±0.05）；antimiR-4301組BRD4表達(dá) 水平 高于anti-miR-NC組（0.96±0.08）比（0.55±0.04）（P＜0.05），見圖3，表3。

表3 肝癌Huh7細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)∕±s

表3 肝癌Huh7細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)∕±s

注：miR-NC組為miR-4301模擬物陰性對照，miR-4301為miR-4301模擬物，WT-BRD4為BRD4野生型熒光素酶載體，MUT-BRD4為BRD4突變型熒光素酶載體。

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圖3 miR-4301靶向調(diào)控肝癌Huh7細(xì)胞BRD4的表達(dá)：A為BRD4的3’UTR中含有與miR-4301互補(bǔ)的核苷酸序列；B為BRD4蛋白的表達(dá)

2.4 miR-4301過表達(dá)對肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響與miR-NC組相比，過表達(dá)miR-4301可降低BRD4表達(dá)水平，提高細(xì)胞抑制率和p21表達(dá)水平，降低Huh7細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)，降低增殖相關(guān)蛋白CyclinD1以及遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平（P＜0.05），見圖4，表4。

表4 miR-4301過表達(dá)對Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響∕±s

表4 miR-4301過表達(dá)對Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響∕±s

注：BRD4為溴結(jié)構(gòu)域蛋白4，Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，p21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9，miR-4301為miR-4301模擬物，miR-NC為miR-4301模擬物陰性對照。

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圖4 溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（BRD4）和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.5 抑制miR-4301表達(dá)逆轉(zhuǎn)了納布啡（200μmol）對肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用與納布啡+anti-miR-NC組相比，納布啡+anti-miR-4301可提高BRD4表達(dá)水平升高，降低細(xì)胞抑制率及p21表達(dá)水平，增加細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)，提高增殖向蛋白CyclinD1以及遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平（P＜0.05），見圖5，表5。

表5 抑制miR-4301表達(dá)逆轉(zhuǎn)了納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用∕±s

表5 抑制miR-4301表達(dá)逆轉(zhuǎn)了納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用∕±s

注：anti-miR-4301為miR-4301抑制表達(dá)載體，anti-miR-NC為miR-4301抑制表達(dá)載體陰性對照，miR-4301為微小RNA-4301，BRD4為溴結(jié)構(gòu)域蛋白4，Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，p21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。①與對照組比較，P＜0.05。②與納布啡+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

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圖5 溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（BRD4）和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

近年來，麻醉藥除了其本身具有麻醉作用外，還影響腫瘤病人的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與預(yù)后等［7-8］。納布啡是一種臨床麻醉鎮(zhèn)痛藥，有研究報(bào)道納布啡可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長［9］，說明納布啡具有抑癌作用。為研究納布啡是否對肝癌起作用，本研究用不同濃度納布啡處理肝癌細(xì)胞Huh7，結(jié)果顯示，不同濃度納布啡處理后，Huh7細(xì)胞抑制率逐漸升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，說明納布啡可能呈濃度依賴性抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

miRNA在肝癌的細(xì)胞增殖及凋亡中發(fā)揮著重要作用，miRNA可能通過不同的作用靶點(diǎn)及分子通路來促進(jìn)或抑制肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移［10-11］。有研究表明miR-4301可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］，miR-4301高表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］，過表達(dá)miR-4301可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［14］。以上研究均表明miR-4301具有抑癌作用，但其對肝癌細(xì)胞的影響還尚不清楚。本研究將miR-4301過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞Huh7中，結(jié)果顯示，miR-4301過表達(dá)可提高細(xì)胞抑制率，降低遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)；說明miR-4301過表達(dá)可抑制肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)納布啡處理的肝癌細(xì)胞Huh7中miR-4301表達(dá)水平顯著升高，為研究納布啡對肝癌細(xì)胞的影響是否與miR-4301有關(guān)，將miR-4301抑制表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞Huh7中的同時(shí)用納布啡處理，結(jié)果顯示，抑制miR-4301表達(dá)逆轉(zhuǎn)了納布啡對肝癌Huh7細(xì)胞的作用。

研究表明溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（BRD4）在多種腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤的進(jìn)展過程，其抑制劑應(yīng)用均顯現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用［15］。研究報(bào)道BRD4在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，顯著促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖，其抑制劑可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。有研究報(bào)道高表達(dá)BRD4的肝癌病人預(yù)后較差，抑制BRD4表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［17］，表明BRD4與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。同時(shí)，還有研究報(bào)道BRD4抑制劑可抑制唾液腺樣囊性癌的細(xì)胞生長，遷移和侵襲［18］，說明BRD4還與癌細(xì)胞的遷移、侵襲有關(guān)。而研究顯示miR-608通過靶向BRD4抑制人肝癌細(xì)胞的增殖［19］，表明miRNA可通過調(diào)控BRD4的表達(dá)影響癌細(xì)胞的生長。在本研究中，miR-4301可靶向調(diào)控BRD4的表達(dá)，且納布啡可提高miR-4301表達(dá)水平，降低BRD4的表達(dá)水平，提示納布啡可能通過上調(diào)miR-4301進(jìn)而下調(diào)BRD4。

綜上所述，納布啡可能通調(diào)控miR-4301∕BRD4軸抑制肝癌Huh7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。