海洋生物中肝素類物質(zhì)的提取純化技術(shù)研究進(jìn)展

陳 思，張小軍，龍 舉，嚴(yán)忠雍，李佩佩，方 益　(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100)

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海洋生物中肝素類物質(zhì)的提取純化技術(shù)研究進(jìn)展

陳 思，張小軍*，龍 舉，嚴(yán)忠雍，李佩佩，方 益(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316100)

肝素是一種酸性黏多糖(糖胺聚糖)，自首次作為凝血?jiǎng)?yīng)用于臨床至今已有60多年，但由于較大的出血副作用而限制了其臨床應(yīng)用。由于近年來瘋牛病在歐美地區(qū)流行，造成了牛肺肝素的應(yīng)用受到限制[1]。受全世界生豬出欄數(shù)量的限制，豬小腸來源緊張也成為肝素鈉生產(chǎn)鏈的一大障礙。近年來，發(fā)生的肝素污染事件也迫使人們尋找新的肝素類候選藥物。

陸源動(dòng)、植物一直是新藥篩選的首選原料，對(duì)海洋生物中活性物質(zhì)的開發(fā)和利用在近年來才逐漸得到發(fā)展。海洋獨(dú)特的環(huán)境造就了眾多具有特異功能的活性物質(zhì)，從海洋生物中篩選出的新結(jié)構(gòu)化合物普遍具有顯著的藥理作用[2]。以這些非哺乳動(dòng)物為來源制備治療性藥物，可以減少病原體污染的危險(xiǎn)性，因此來自海洋的天然酸性多糖可作為肝素類候選藥物的重要來源。

目前肝素的高效提取純化工藝技術(shù)的研究，對(duì)于改善我國肝素的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。筆者對(duì)近年來國內(nèi)外海洋生物中肝素提取純化的工藝技術(shù)進(jìn)行了綜述，旨在為今后開發(fā)利用海洋生物肝素提供參考和幫助。

1肝素和低分子肝素

肝素的主要組成部分是三硫酸雙糖單位，即肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸IdoA和D-葡萄糖醛酸GlcA)和己糖胺(ɑ-D-葡糖胺，GlcN)以及它們的衍生物(乙酰化、硫酸化)形成的雙糖單位連接而成的不均一多糖[3]。海洋生物中提取的低分子肝素(Low molecular weight heparin，LMWH)與肝素結(jié)構(gòu)一樣，呈一種不均一狀態(tài)，糖鏈中糖單位上硫酸化的數(shù)目和位置不均一，糖鏈的長(zhǎng)短不均一。肝素的分子量為3 000~40 000 D，LMWH是分子量為5 000 D(3 000~8 000 D)的小分子。肝素與LMWH抗凝活性的作用機(jī)制主要通過活化抗凝血酶Ⅲ(Antithrombin Ⅲ，AT Ⅲ)而發(fā)揮作用的，肝素鏈中存在的獨(dú)特五糖序列能誘導(dǎo)AT Ⅲ構(gòu)象改變，從而激活A(yù)T Ⅲ[4]。

雖然肝素迄今仍然是使用最為廣泛的有效凝劑之一，但其在臨床應(yīng)用中也暴露出很多缺點(diǎn)，如停藥后血栓易復(fù)發(fā)、自發(fā)性出血傾向、劑量個(gè)體差異大等[5]，這些因素都限制了肝素的使用。近年來，LMWH有逐步取代肝素的趨勢(shì)，LMWH具有選擇性強(qiáng)、抗血栓作用顯著增強(qiáng)、臨床療效確切、使用安全、對(duì)血小板副作用小等優(yōu)點(diǎn)[6]，從海洋生物中分離提取低分子量肝素是目前的主要研究方向。

2肝素的提取

肝素的提取主要以動(dòng)物內(nèi)臟為原料，常用的有豬小腸和牛肺。肝素主要以糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式分布于動(dòng)物組織的肥大細(xì)胞中。因此，在肝素的提取中應(yīng)首先打斷肝素與蛋白的結(jié)合，再通過鹽析或酶水解等方法去除蛋白質(zhì)，從而得到粗品肝素[7]。

2.1鹽析提取法鹽析提取法是海洋生物中最為常用的肝素提取方法，該方法利用的是蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度降低而沉淀的特性。其主要操作工藝是在堿性環(huán)境下用鹽將肝素從肝素-蛋白復(fù)合物中分離出來，經(jīng)吸附、洗脫、乙醇沉淀、干燥一系列的處理后得到肝素粗品。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單和成本低廉，而缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)不能完全除去[7]。Saravanan等[1]以硫酸鈉為鹽析劑熱水浸提，以硫酸鋁為凝結(jié)劑除去蛋白質(zhì)，并通過季銨鹽(西吡氯胺，CPC)絡(luò)合沉淀，從海洋雙殼類軟體動(dòng)物Amussiumpleuronectus中提取出了1種LMWH粗品。Balamurugan等[8]利用相似的方法在樂譜芋螺中提取出了類肝素物質(zhì)，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。Arumugam等[9]也從長(zhǎng)硨磲和翡翠貽貝的體液組織中分離到肝素。

2.2酶解提取法肝素多糖以共價(jià)鍵的形式與蛋白結(jié)合形成復(fù)合物存在于動(dòng)物組織中，蛋白酶可將肝素和蛋白質(zhì)的結(jié)合部位切斷，使肝素從肝素蛋白質(zhì)復(fù)合物中解離出來，同時(shí)將雜蛋白降解為小分子肽。通過調(diào)節(jié)pH、熱變性和鹽析法可除去蛋白酶和被降解的蛋白質(zhì)制得肝素。目前，海洋生物中肝素提取常用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶等[7]。該方法條件溫和，簡(jiǎn)化了后續(xù)的脫蛋白工藝，肝素粗品的得率較高，但試驗(yàn)穩(wěn)定性要求高。Gandra等[10]利用木瓜酶解提取法比較了類肝素物質(zhì)在皺瘤海鞘各組織(腸、心臟、咽和外套膜)中的分布情況，結(jié)果表明類肝素聚合物在海鞘腸中含量最高，在海鞘心臟和外套膜中含量居中，而在海鞘咽中含量最低。Brito等[11]和Dreyfuss等[12]研究表明采用superase酶解蝦頭下腳料，并經(jīng)離子交換樹脂吸附、洗脫和醇沉處理后得到的肝素類似物具有顯著的抗炎和抗血管生成活性，可用作老年性黃斑病變的潛在藥物。Ticar等[13]報(bào)道了從方斑獅子魚卵中制備肝素的工藝條件，其最佳工藝條件為：Protamex酶解溫度47.40 ℃，酶水解時(shí)間26.50 h，pH6.60，料液比1.34%(w/w)，條件優(yōu)化后肝素產(chǎn)率可達(dá)2.10%(w/w)，可以有效提取魚卵中的肝素類物質(zhì)。

2.3超聲波提取法超聲波提取法是利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)、空化作用和熱效應(yīng)等對(duì)細(xì)胞組織的破碎作用，提高糖類物質(zhì)在提取液中的溶解度和浸出率，從而達(dá)到快速提取的目的[14]。作為海洋生物中肝素類物質(zhì)的新型提取方法，超聲波提取有不需加熱、提取率高、對(duì)生物活性的影響小、溶劑用量少等特點(diǎn)。Fidelis等[15]研究表明比較超聲波結(jié)合水提法和單獨(dú)水提法，可食性海藻中硫酸化多糖的總產(chǎn)量并無明顯差異；若輔以酶解處理，超聲波水提下目標(biāo)物的總產(chǎn)量顯著提高；在堿性環(huán)境中，超聲波結(jié)合酶解法的多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到413 mg/kg。Achour等[16]報(bào)道采用超聲波輔助過氧化氫降解法制成的LMWH的抗凝血能力與商用低分子肝素一樣，且抗Xa與抗Ⅱa活性更高。

3肝素的分離與純化

粗品肝素中往往含有其他黏多糖，也含有大量未除盡的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)，嚴(yán)重影響肝素的最終品質(zhì)。需要利用不同黏多糖電荷密度或溶解度的差異進(jìn)行分離，從而得到單一種類的黏多糖。目前，海洋生物中肝素類物質(zhì)分離與純化的主要方法包括有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法和親和層析法。

3.1有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法是純化生物大分子物質(zhì)的一種最簡(jiǎn)便常見的方法，可用于黏多糖的分離。該方法利用不同黏多糖在不同溶劑中的溶解度不同而使黏多糖得到分離，雖然原理簡(jiǎn)單，但往往存在交叉沉淀，常常需要通過分步沉淀對(duì)比沉淀產(chǎn)物，以得到純度較高的產(chǎn)品。Jeske等[17]研究發(fā)現(xiàn)在石斑魚皮、鯰魚皮、鱒魚皮、鱈魚皮和金槍魚皮等多種海洋資源中，由金槍魚皮制備的黏多糖粗品抗凝活性最高。利用丙酮對(duì)金槍魚皮中提取的肝素粗品進(jìn)行連續(xù)沉淀，結(jié)果表明當(dāng)加入的丙酮體積為溶液體積的0.55倍~0.65倍時(shí)，可以得到純度大于90%的肝素。Medeiros等[18]選取13門23種海洋生物作為原料，將醇沉復(fù)溶的樣液用0.5倍體積的丙酮沉淀時(shí)可以得到類肝素物質(zhì)，結(jié)果表明，肝素類物質(zhì)普遍存在于海洋生物中，由海膽和蟹制備的類肝素純品抗凝活性分別為60和52 IU/mg。Gomes等[19]采用70%的乙醇沉淀法，從雙殼類軟體動(dòng)物中制備硫酸乙酰肝素物質(zhì)，其產(chǎn)量可達(dá)0.5~0.6 mg/g干組織。

3.2離子交換層析離子交換層析的原理是同類型的帶電離子間可自由地相互交換和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，近年來其用于海洋生物中肝素分離越來越普遍。肝素在低濃度鹽溶液中以聚陰離子的形式存在，與陰離子交換劑上的陰離子競(jìng)爭(zhēng)，發(fā)生離子交換后被吸附到交換劑上，然后可通過高鹽濃度溶液梯度洗脫完成對(duì)肝素的純化。該方法純化率和回收率高，在生產(chǎn)上有利于放大，成本較凝膠過濾和親和層析低。常用于純化肝素及其類似物的離子交換劑有Amberlite IRA 120/900、DEAE-Cellulose、Sephadex A-25，凝膠過濾劑有Sephadex-G 25/100/150[1，11，20-21]。Shobharani等[22]利用DEAE-Cellulose陰離子交換柱對(duì)馬尾藻發(fā)酵物的醇沉多糖進(jìn)行了分離與純化，結(jié)果表明洗脫所得第2餾分的效價(jià)為(6.70±0.22)IU/mg，其抗凝活性是粗多糖的2.6~3.9倍，可用作商業(yè)肝素的替代品。Saravanan等[1]報(bào)道了從雙殼軟體動(dòng)物中利用DEAE-Cellulose、Amberlite離子交換柱結(jié)合Sephadex G-100凝膠過濾柱純化低分子肝素的方法，純化到的低分子肝素效價(jià)分別為72、84和95 IU/mg。Brito等[23]利用離子交換樹脂吸附，鹽溶液洗脫，所得黏多糖用丙酮分級(jí)沉淀，最后由DEAE-Sephacel離子交換柱純化，從蝦頭酶解物中提取出一種肝素/硫酸乙酰肝素混合物，具有抗凝血能力強(qiáng)和無出血副作用等特點(diǎn)。

3.3親和層析親和層析法分離是將具有特異性親和力的分子制成固相吸附劑置于層析柱中，當(dāng)提取液通過層析柱時(shí)，與此吸附劑具有親和力的組分就會(huì)被吸附在層析柱上，從而實(shí)現(xiàn)肝素物質(zhì)的分離與純化。Schmer等[24]研發(fā)了魚精蛋白偶聯(lián)瓊脂糖作為親和吸附劑，以1.3~2.0 mol/L氯化鈉-咪唑緩沖液分步洗脫、純化高活性肝素的方法，分離到肝素的最高效價(jià)可達(dá)270～305 U/mg。H??k等[25]報(bào)道了利用溴化氰活化瓊脂糖并采用抗凝血酶通過氨基與之偶聯(lián)制備成固相吸附劑，用于分離高活性和低活性的肝素組分。Chavante等[26]從蝦頭中分離出一種具有顯著抗炎作用的肝素類黏多糖，利用親和層析原理對(duì)該肝素類物質(zhì)進(jìn)行了分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。

4小結(jié)

海洋生物中肝素類物質(zhì)是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的糖胺聚糖，其單糖組成和連接方式各異，如何解釋不同肝素間的特異性結(jié)構(gòu)與其對(duì)應(yīng)生物活性的關(guān)系一直是各國研究者的技術(shù)難題。目前，海洋生物中肝素的酶法提取，特別是對(duì)肝素的酶降解已成為研究熱點(diǎn)。在海洋生物中肝素的分離純化方面，離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各種新型分析方法和技術(shù)將有助于徹底了解肝素的生物活性和精確結(jié)構(gòu)，加速肝素類物質(zhì)的分離、純化及產(chǎn)業(yè)化研究，實(shí)現(xiàn)海洋生物資源中肝素類物質(zhì)的深入開發(fā)與利用。

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摘要肝素是一類結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜的糖胺聚糖混合物，因其具有多種生物學(xué)功能，其提取純化方法一直是各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)。綜述了肝素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物功能及提取純化技術(shù)進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)闡述了肝素及其類似物分離純化技術(shù)在海洋生物資源利用方面的最新研究進(jìn)展及趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞肝素；海洋；提?。环蛛x；純化

Research Progress in Extraction and Purification Technology of Heparin from Marine Sources

CHEN Si, ZHANG Xiao-jun*, LONG Ju et al(Key Laboratory of Marine Aquaculture, Zhejiang Institute of Marine Fisheries, Zhoushan, Zhejiang 316100)

AbstractHeparin is a class of glycosaminoglycans with very complex structures. Because of a variety of biological functions, its extraction and purification methods have been focused research area for the scholars all over the world. The structural characteristics and biological properties of heparin were summarized, extraction and purification technology of heparin were reviewed, focusing on research progress and trend of separation and purification for heparin and its heparin-like compounds in marine resources.

Key wordsHeparin; Marine; Extraction; Separation; Purification

收稿日期2015-10-14

作者簡(jiǎn)介陳思(1984-)，女，浙江杭州人，工程師，博士，從事水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全方面研究。*

通訊作者，工程師，博士，從事水產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全方面的研究。

基金項(xiàng)目浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2014C32087)。

中圖分類號(hào)S 986.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)32-082-03