裸花紫珠乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

范麗穎，趙偉，曾進(jìn)

西安市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，陜西 西安 710000

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)較為常見的惡性腫瘤，近年來不健康的飲食模式導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)病率位居惡性腫瘤第4位，病死率位居第5位[1-3]。目前研究發(fā)現(xiàn)中藥提取物可對抗腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[4]。裸花紫珠（Callicarpa nudiflora，CN）提取物可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力[5]。CN乙酸乙酯提取物可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗銀屑病的作用[6]，但其提取物對結(jié)腸癌的研究還未見報道。10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）在結(jié)腸癌組織中下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)水平與結(jié)腸癌組織的分化程度密切相關(guān)[7]，周密等[8]研究證明PTEN基因的沉默能夠明顯增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。但目前關(guān)于CN乙酸乙酯提取物與PTEN的關(guān)系，CN是否通過PTEN在結(jié)腸癌中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)研究CN是否通過調(diào)控PTEN的表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）來自美國GIBCO公司，二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）來自美國Sigma公司，Trizol來自美國Ambion公司，蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液來自羅氏公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑來自美國Invitrogen公司，BCA蛋白檢測試劑盒來自碧云天生物技術(shù)研究所，慢病毒載體pGCL來自上海吉凱基因有限公司，PTEN、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p21單克隆抗體來自美國CST公司，beta-Actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（HRP）來自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 CN乙酸乙酯提取物的制備裸花紫珠采自海南，經(jīng)中國科學(xué)院胡安娜植物園華南植物鑒定中心鑒定為CN。其提取物的制備：CN干燥葉4 kg，80%乙醇加熱回流3次，提取液過濾合并，減壓蒸餾至膏狀，冷凍干燥，保存干粉。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞采用含有10%胎牛血清和雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL）的改良伊格爾（DMEM）高糖培養(yǎng)基在5%CO2、37℃條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況調(diào)整人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞濃度為5×103個/mL接種于96孔板中，每孔細(xì)胞懸液100μL，在5%CO2、37℃條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，對照組加入0.1%二甲基亞砜（DMSO），用藥各組加入終濃度為100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL的裸花紫珠，每孔設(shè)置3個重復(fù)，分別于24 h、48 h、72 h進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測實驗；細(xì)胞檢測時棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞，每孔加入50μL噻唑藍(lán)（MTT），室溫孵育2 h；然后每孔加入100μL DMSO孵育15 min，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處吸光值（OD值）。

1.3.3 Western blot法檢測蛋白表達(dá)情況不同濃度CN處理的SW480細(xì)胞提取提取總蛋白，測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳跑膠，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；脫脂奶封閉1 h；一抗稀釋4℃孵育過夜，洗滌3次；等滲緩沖鹽溶液（TBST）稀釋二抗孵育1 h，洗滌2次；超敏化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影液發(fā)光，Image Quant LAS4010凝膠成像儀觀察目的蛋白條帶，采集圖片；以β-Actin為內(nèi)參計算蛋白灰度值。

1.3.4 載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建si-PTEN質(zhì)粒，調(diào)整細(xì)胞濃度，以3×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育過夜；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%時，準(zhǔn)備包裝慢病毒，加入無血清培養(yǎng)基孵育6 h，LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后4～6 h更換新鮮培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，獲得穩(wěn)定低表達(dá)PTEN的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株。后續(xù)功能試驗中，轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞系為轉(zhuǎn)染si-PTEN的對照組。

1.3.5 Transwell實驗檢測結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力（1）遷移實驗：以每孔104個細(xì)胞加入Transwells上室，下室加入含有5%血清的DMEM，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)20～24 h；取出Transwells，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，棉簽擦去Transwells膜上未穿過的細(xì)胞，90%乙醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min，PBS清洗2次；計數(shù)200倍視野下細(xì)胞，隨機(jī)選5個低倍鏡觀察，計算穿膜細(xì)胞數(shù)。（2）侵襲實驗：實驗前提前將Matrigel膠在冰上解凍，按照1∶2的體積比與無血清DMEM培養(yǎng)基混勻制備Matrigel基質(zhì)膠；Matrigel基質(zhì)膠加入Transwells小室，以每孔104個細(xì)胞加入Transwells上室，其余操作步驟同遷移實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響與對照組比較，48 h、72 h CN乙酸乙酯提取物各劑量組結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的OD值顯著降低，且隨著濃度的增加細(xì)胞活力、Cyclin D1蛋白水平逐漸降低，而p21蛋白水平逐漸升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。選擇實驗最優(yōu)濃度200 mg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗，見圖1和表1。

表1 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響（±s，n=3）

表1 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與CN乙酸乙酯100 mg/L組比較，bP＜0.05；與CN乙酸乙酯150 mg/L組比較，cP＜0.05。

組別對照組CN乙酸乙酯100 mg/L組CN乙酸乙酯150 mg/L組CN乙酸乙酯200 mg/L組F值P值24 h 0.38±0.03 0.38±0.03 0.37±0.03 0.36±0.03 0.406 0.753 48 h 0.88±0.05 0.66±0.06a 0.56±0.05ab 0.44±0.04abc 40.902 0.001 72 h 1.58±0.06 1.23±0.06a 1.03±0.07ab 0.61±0.05abc 134.705 0.001 Cyclin D1 0.63±0.04 0.49±0.03a 0.30±0.02ab 0.13±0.01abc 191.033 0.001 p21 0.31±0.02 0.43±0.03a 0.59±0.05ab 0.83±0.05abc 198.961 0.001 OD值

圖1 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖蛋白表達(dá)的影響

2.2 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的影響與對照組比較，CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL組結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲數(shù)目減少；E-cadherin蛋白水平增加，N-cadherin蛋白水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2和表2。

表2 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的影響（±s，n=3）

表2 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的影響（±s，n=3）

組別對照組CN乙酸乙酯200 mg/L組t值P值遷移100.00±2.16 48.00±2.00 30.596 0.001侵襲81.00±2.16 39.00±3.00 19.679 0.001 E-cadherin 0.33±0.02 0.72±0.05 12.544 0.001 N-cadherin 0.73±0.06 0.28±0.02 12.324 0.001

圖2 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲及遷移侵襲蛋白表達(dá)的影響（×200）

2.3 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中PTEN表達(dá)的影響CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL組結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中的PTEN蛋白水平為0.75±0.05，明顯高于對照組的0.26±0.02，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.760，P＜0.05），見圖3。

圖3 CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中PTEN表達(dá)的影響

2.4 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的抑制作用與CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-NC組比較，CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-PTEN組細(xì)胞活力升高，PTEN、p21蛋白水平降低，Cyclin D1蛋白水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4和表3。

表3 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的抑制作用（±s，n=3）

表3 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的抑制作用（±s，n=3）

組別OD值Cyclin D1p21PTEN 24 h48 h72 h對照組0.38±0.030.88±0.051.58±0.060.63±0.040.31±0.020.24±0.02 CN乙酸乙酯200 mg/L組0.36±0.030.44±0.04a0.61±0.05a0.13±0.01a0.83±0.05a0.76±0.04a CN乙酸乙酯200 mg/L+si-NC組0.36±0.030.47±0.040.65±0.050.15±0.010.81±0.050.78±0.04 CN乙酸乙酯200 mg/L+si-PTEN組0.37±0.030.69±0.06b1.15±0.08b0.46±0.02b0.59±0.04b0.56±0.03b F值0.30654.796168.927324.864100.743167.678 P值0.821 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

圖4 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖蛋白表達(dá)的影響

2.5 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的抑制作用與CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-NC組比較，CN乙酸乙酯提取物200 mg/mL+si-PTEN組遷移、侵襲數(shù)目增加，E-cadherin蛋白水平降低，N-cadherin蛋白水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5和表4。

表4 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的抑制作用（±s，n=3）

表4 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲的抑制作用（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與CN乙酸乙酯200 mg/L+si-NC組比較，bP＜0.05。

組別 遷移 侵襲E-cadherinN-cadherin對照組CN乙酸乙酯200 mg/L組CN乙酸乙酯200 mg/L+si-NC組CN乙酸乙酯200 mg/L+si-PTEN組F值P值100.00±2.16 48.00±1.63a 48.33±1.89 74.33±1.70b 536.984 0.001 81.00±2.16 39.33±2.49a 39.67±2.62 63.67±2.05b 224.024 0.001 0.33±0.02 0.72±0.05a 0.70±0.05 0.51±0.03b 63.810 0.001 0.73±0.06 0.28±0.02a 0.29±0.02 0.59±0.04b 100.317 0.001

圖5 抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)CN乙酸乙酯提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲及遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響（×200）

3 討論

CN屬于馬鞭草科紫竹屬植物，近年來紫竹屬植物的抗腫瘤作用受到關(guān)注。高秀麗等[9]首先報道，體外實驗中紫竹屬杜虹花的果實提取物可抑制人喉癌細(xì)胞Hep-2的增殖。CN主要化學(xué)成分有黃酮類、二萜類、三萜類、酚酸類等[10]，其黃酮類化合物起關(guān)鍵作用，具有抗炎、止血、抑菌、血壓調(diào)節(jié)、提高免疫力、抑制癌癥的作用[11]。藥理研究表明，CN中的環(huán)烯醚萜苷衍生物對宮頸癌Hela細(xì)胞和卵巢癌HeyA8細(xì)胞具有不同程度的增殖抑制作用[12]。以上的研究結(jié)果均說明CN中的黃酮類化合物具有顯著的抑癌作用，但其對結(jié)腸癌的作用和其抑癌的機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，隨著CN乙酸乙酯提取物濃度的增加，結(jié)腸癌細(xì)胞活力降低，Cyclin D1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高。Cyclin D1與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物而正向調(diào)控細(xì)胞周期從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，而p21可抑制Cyclin D1與CDK4結(jié)合從而抑制細(xì)胞增殖[13]。本研究結(jié)果提示CN可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，CN 200 mg/mL組結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)目減少，E-cadherin蛋白水平升高，N-cadherin蛋白水平降低。E-cadherin屬于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）上皮細(xì)胞標(biāo)志物，當(dāng)E-cadherin表達(dá)下調(diào)時具有極性的上皮細(xì)胞失去極性轉(zhuǎn)化成間充質(zhì)細(xì)胞從而促使遷移及侵襲發(fā)生[14]。N-cadherin屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員并可降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果提示CN可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

PTEN位于10q23.3，是人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同原基因，屬于抑癌基因[16]。PTEN廣泛參與細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程，其主要通過調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抑癌作用[17]。本研究結(jié)果顯示，CN處理后，結(jié)腸癌細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平升高，提示CN可促進(jìn)PTEN的表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用。PTEN在正常大腸組織中表達(dá)水平較高，在大腸癌組織中的表達(dá)顯著降低[18]。食管鱗狀細(xì)胞癌中PTEN可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲[19]。敲除小鼠的PTEN基因可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[20]。進(jìn)一步研究CN是否通過PTEN發(fā)揮抑制增殖、遷移和侵襲作用，結(jié)果顯示，抑制PTEN的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)CN對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖、遷移和侵襲抑制作用。

綜上所述，CN可促進(jìn)PTEN在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)并抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制PTEN的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)CN對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。這一結(jié)果說明CN可能通過調(diào)控PTEN的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。