中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)作用于哮喘的研究進(jìn)展

黃俊敏，趙紫嫣 綜述 王才春審校

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 ?？?571199

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細(xì)胞衍生的細(xì)胞外支架，通常由組蛋白和顆粒蛋白裝飾的解聚染色質(zhì)組成。最初被發(fā)現(xiàn)是研究中性粒細(xì)胞針對(duì)病原體的宿主防御機(jī)制。有許多的疾患與NETs的形成有關(guān)，例如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、囊性纖維化、敗血癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤等，已經(jīng)報(bào)道了與NETs形成相關(guān)的病理機(jī)制。根據(jù)2020年全球哮喘倡議(GINA 2020)更新，數(shù)據(jù)表明哮喘影響全球約3億人[1]。哮喘的異質(zhì)性反映了復(fù)雜的潛在分子機(jī)制，會(huì)導(dǎo)致疾病產(chǎn)生不同的表現(xiàn)。有研究表明，哮喘發(fā)展期間形成過(guò)量的NETs，其誘導(dǎo)了氣道上皮細(xì)胞的炎癥損傷[2]。目前就針對(duì)NETs的結(jié)構(gòu)、對(duì)生物體的影響以及對(duì)于哮喘的作用和治療來(lái)進(jìn)行闡述。

1 NETs的結(jié)構(gòu)及形成

中性粒細(xì)胞是占比最大的白細(xì)胞類型。它們?cè)诠撬柚谐墒欤尫诺酵庵苎褐?，在那里循環(huán)6～8 h。然而，在組織中它們可以存活數(shù)天，通過(guò)內(nèi)皮來(lái)滲出，它們通過(guò)血流進(jìn)入組織，并沿著趨化梯度向感染部位遷移，是宿主針對(duì)病原體反應(yīng)的重要組成部分。中性粒細(xì)胞被認(rèn)為是免疫防御的第一線的一部分，可以通過(guò)吞噬、脫顆粒和產(chǎn)生NETs來(lái)對(duì)抗入侵的微生物[3]。中性粒細(xì)胞通過(guò)脫顆粒后產(chǎn)生殺菌分子來(lái)消除病原體。不同類型的顆粒按順序釋放，首先釋放三級(jí)顆粒(如組織蛋白酶、明膠酶)，然后釋放二級(jí)顆粒(如乳鐵蛋白、堿性磷酸酶、溶菌酶、腸溶菌素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和膠原酶)。最后分泌的初級(jí)顆粒含有最多的促炎和抗菌蛋白，如彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶、組織蛋白酶G、防御素[4]。

NETs是在2004年由BRINKMANN等[5]第一次提出。NETs具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。高分辨掃描電鏡分析顯示，NETs由直徑15～20 nm(染色質(zhì))的光滑纖維組成，其間點(diǎn)綴著＞25 nm的球狀結(jié)構(gòu)域[3]。NETs的核心是含有帶負(fù)電荷的染色質(zhì)作為主鏈的生物結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)裝飾有多達(dá)20種不同的抗菌蛋白和多肽，例如髓過(guò)氧化物酶(MPO)、組織蛋白酶G、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)和組蛋白。中性粒細(xì)胞可被多種物質(zhì)，如白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子-α、脂多糖(LPS)、粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子、佛波醇-12-肉豆蔻-13-乙酸酯(PMA)等刺激[6]。NETs的形成常常會(huì)跟隨著中性粒細(xì)胞的破壞和病原微生物的死亡，這整一過(guò)程被定義成NETosis，會(huì)導(dǎo)致獨(dú)特形式的細(xì)胞死亡，這種死亡區(qū)別于凋亡或者壞死，從而使它們能夠截留和殺死微生物，從而保護(hù)宿主免受感染。相反，NETs的過(guò)度形成會(huì)激發(fā)相關(guān)自身免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)展。NETs的形成可總結(jié)為以下六個(gè)步驟：(1)中性粒細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞核特有的分葉結(jié)構(gòu)喪失；(2)核膜和顆粒膜變得通透；(3)組蛋白失活導(dǎo)致染色質(zhì)膨脹進(jìn)入胞漿；(4)解聚的染色質(zhì)與釋放的顆粒內(nèi)容物聚集；(5)內(nèi)膜丟失導(dǎo)致胞液細(xì)胞器消失；(6)質(zhì)膜變得通透，內(nèi)容物釋放到胞外空間[7]。

NETosis的形成有三種模式，第一種模式稱為自殺式，是最常見(jiàn)的一種類型。當(dāng)中性粒細(xì)胞通過(guò)受體識(shí)別刺激后，通過(guò)蛋白激酶C激活絲裂原活化蛋白激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Raf-MEK-ERK)通路，進(jìn)而使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活化，刺激活性氧(ROS)的產(chǎn)生，促使肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)催化組蛋白瓜氨酸化，從而使染色質(zhì)發(fā)生解聚，另外活性氧通過(guò)誘導(dǎo)核膜逐漸分離和丟失，緊接著染色質(zhì)經(jīng)過(guò)膜孔釋放到細(xì)胞外來(lái)，從而促進(jìn)NETs形成[8]。第二種模式稱為細(xì)胞核DNA釋放式，細(xì)胞膜和核膜的完整性得以保留，補(bǔ)體C3蛋白和Toll樣受體可促進(jìn)此種形式產(chǎn)生[9]。第三種是線粒體DNA釋放式，這種形式依賴于ROS的產(chǎn)生，當(dāng)中性粒細(xì)胞受到脂多糖或者粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激后可產(chǎn)生[10]。

根據(jù)是否依賴于NADPH氧化酶，NETosis可分成兩種類型。第一種類型是NADPH氧化酶依賴性NETosis，依賴于線粒體ROS的產(chǎn)生。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)導(dǎo)致NADPH氧化酶的激活和超氧自由基的產(chǎn)生，這些自由基被超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化物[8]。MPO使得次氯酸轉(zhuǎn)化成為過(guò)氧化氫，進(jìn)而激活NE。NE負(fù)責(zé)細(xì)胞骨架和核膜的降解，使細(xì)胞核內(nèi)容物和細(xì)胞質(zhì)混合在一起[11]。組蛋白被激活的PAD4去亞胺，MPO和NE對(duì)其進(jìn)行蛋白水解，導(dǎo)致染色質(zhì)解縮。染色質(zhì)纖維與顆粒和細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合，然后釋放到細(xì)胞外[12]。第二種類型是NADPH氧化酶非依賴性NETosis，一旦與鈣結(jié)合，胞漿中的PAD4就移位到細(xì)胞核中，作用于組蛋白上的帶正電荷的精氨酸脫亞胺為不帶電荷的瓜氨酸，從而促進(jìn)染色質(zhì)的解縮，特別是在啟動(dòng)子區(qū)域[13]。

2 NETs的生物學(xué)作用

2.1 NETs對(duì)機(jī)體的積極作用各式各樣的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)微生物誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞可通過(guò)自殺式、非典型的NETosis觸發(fā)NETs。通過(guò)截留微生物，NETs阻止了微生物傳播到繼發(fā)感染部位，并且在某些情況下，NETs具有直接的抗菌功能。研究表明，NETs能限制生長(zhǎng)或殺死菌體，如葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、宋內(nèi)志賀氏菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、丙酸桿菌、銅綠假單胞菌等[8，14]，進(jìn)而消除病原體。對(duì)于病毒方面，F(xiàn)UNCHAL等[15]發(fā)現(xiàn)，對(duì)于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，中性粒細(xì)胞是通過(guò)TLR7以及TLR8來(lái)辨別HIV-1衍生的RNA，從而釋放活性氧，隨后誘導(dǎo)NETs的形成。隨后可通過(guò)髓過(guò)氧化物酶和α-防御素的作用來(lái)對(duì)抗HIV。對(duì)于寄生蟲方面，ABDALLAH等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠鼻內(nèi)感染弓形蟲的模型中，中性粒細(xì)胞通過(guò)形成NETosis來(lái)誘捕并殺死機(jī)體中的病原體來(lái)阻止弓形蟲的傳播。

2.2 NETs對(duì)機(jī)體的消極作用中性粒細(xì)胞和NETs在生物機(jī)體內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生兩方面作用。它們都會(huì)保護(hù)宿主免受病原體的入侵，但是也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生破壞性，越來(lái)越多的證據(jù)表明，NETs的過(guò)度產(chǎn)生和這些結(jié)構(gòu)的低效拆解可能會(huì)潛在地?fù)p害宿主，如自身免疫疾病和自身炎癥性疾病。已經(jīng)由研究證明NETs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有毒性[17]?；罨膬?nèi)皮誘導(dǎo)了NETs的形成[18]，這會(huì)造成惡性循環(huán)，從而造成更大的損害，內(nèi)膜發(fā)生病變進(jìn)而會(huì)造成動(dòng)脈粥樣硬化以及斑塊的形成。WARNATSCH等[19]發(fā)現(xiàn)，NETs在斑塊形成的過(guò)程中起著相當(dāng)大的作用。當(dāng)人類中性粒細(xì)胞與膽固醇晶體接觸時(shí)，它們會(huì)自發(fā)地發(fā)生NETosis。NAKAZAWA等[20]研究表明，顯微鏡下多血管炎患者血液中的IgG很容易誘導(dǎo)NETs，并且NETs的生成量與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種主要發(fā)生在關(guān)節(jié)的慢性自身炎癥性疾病，滑液中有大量的中性粒細(xì)胞。由于大多數(shù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎自身抗體是針對(duì)瓜氨酸蛋白的，NETs及其瓜氨酸成分可能參與誘導(dǎo)自身反應(yīng)性B細(xì)胞。與健康人體的中性粒細(xì)胞相比，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病患機(jī)體中的中性粒細(xì)胞，無(wú)論是從循環(huán)血液中分離出來(lái)的，還是從滑液中分離出來(lái)的，都觀察到了增多的NETs[21]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是慢性的中性粒細(xì)胞炎癥。長(zhǎng)期暴露于吸入刺激物(如煙草煙霧)后，該類患者會(huì)頻頻發(fā)生細(xì)菌和病毒的感染，導(dǎo)致長(zhǎng)期反復(fù)地發(fā)作甚至加重。已發(fā)現(xiàn)煙草煙霧直接誘導(dǎo)NETs形成[22]。COPD的嚴(yán)重程度也與NETs的數(shù)量有關(guān)，NETs的數(shù)量在加重期最高[23]。

3 NETs與哮喘

哮喘是一種異質(zhì)性慢性氣道炎癥性疾病，其通常會(huì)出現(xiàn)反復(fù)喘息、呼吸急促、胸悶和/或咳嗽等。哮喘的主要發(fā)病機(jī)理包括各類型炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性、氧化應(yīng)激[24]以及氣道重塑。此外，大多數(shù)哮喘患者表現(xiàn)出特征性的炎癥，即氧化應(yīng)激，一種已知會(huì)導(dǎo)致生物損害的情況，指的是體內(nèi)氧化應(yīng)激和抗氧化防御機(jī)制之間的失衡。氧化應(yīng)激使得大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，各類酶形成以及分泌增多，形成相當(dāng)大數(shù)量的氧化產(chǎn)物。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)活性氧和活性氮水平維持在較低濃度。哮喘經(jīng)常會(huì)伴隨ROS產(chǎn)生增加和抗氧化系統(tǒng)能力降低，導(dǎo)致氣道氧化應(yīng)激[25]。研究表明，全球約有3億多人患有哮喘，其中有嚴(yán)重哮喘的人數(shù)就高達(dá)10%[26]，這使其成為最常見(jiàn)的慢性肺部疾病。在大多數(shù)患者中，小劑量吸入皮質(zhì)類固醇療法能夠減輕氣道炎癥，并成功控制癥狀和惡化。其中5%～10%的哮喘患者受到嚴(yán)重哮喘的影響[27]。即使經(jīng)過(guò)最大限度的治療，仍有相當(dāng)比例的嚴(yán)重哮喘患者的癥狀處于次優(yōu)控制狀態(tài)。這些持續(xù)失控哮喘患者的發(fā)病率很高，并且不成比例地使用哮喘醫(yī)療資源。在這個(gè)難以控制的哮喘人群中，表型的異質(zhì)性和對(duì)現(xiàn)有治療方法的不同反應(yīng)證明了潛在疾病相關(guān)生物學(xué)的復(fù)雜性和多變性。

哮喘根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為激素依賴型哮喘、激素抵抗型哮喘、脆性哮喘以及致死型哮喘。根據(jù)觀察誘導(dǎo)痰中粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，哮喘可分為四種不同的表型，分別為嗜酸性粒細(xì)胞型、中性粒細(xì)胞型、混合性粒細(xì)胞型和少粒細(xì)胞型[28]。有研究發(fā)現(xiàn)約50%哮喘患者的氣道以中性粒細(xì)胞為主，且中性粒細(xì)胞與重癥哮喘、遲發(fā)型哮喘以及激素抵抗型哮喘的相關(guān)性大。2006年SIMPSON等[29]將誘導(dǎo)痰中的中性粒細(xì)胞含量大于61%的哮喘釋義成中性粒細(xì)胞型哮喘?？刂葡膫鹘y(tǒng)治療方案?jìng)?cè)重于使用有效的抗炎藥，特別是類固醇，它們對(duì)效應(yīng)細(xì)胞及其介體具有廣譜抑制活性。哮喘的緩解和控制藥物包括糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑、茶堿、白三烯調(diào)節(jié)劑、抗IgE單克隆抗體、抗IL-5抗體和抗IL-4/IL-13抗體等[30]。中性粒細(xì)胞型哮喘患者通常病情較為嚴(yán)重，對(duì)傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)效果欠佳，甚至?xí)觿〔∏樽兓?，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素會(huì)延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞的生存期。

3.1 NETs在哮喘進(jìn)展中的作用哮喘由于其病因復(fù)雜而難以治療，闡明其潛在機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)低副作用的高效藥物非常重要。經(jīng)過(guò)多年不斷的研究，發(fā)現(xiàn)NETs在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中產(chǎn)生出來(lái)的是消極的效應(yīng)。氣道上皮位于宿主與外界環(huán)境的交界處，不僅是一道有效的物理屏障，而且也是抵御微生物、環(huán)境中刺激物和過(guò)敏原的第一道防線。氣道上皮通過(guò)其物理屏障功能、纖毛清除功能和天然免疫防御功能來(lái)維持呼吸道黏膜的健康[31]。它在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。另一方面，其結(jié)構(gòu)和功能的改變會(huì)直接影響到炎癥反應(yīng)，促進(jìn)疾病的形成。NETs的成分可損傷氣道上皮并引發(fā)炎癥反應(yīng)。NETs可通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8和激活嗜酸性粒細(xì)胞釋放顆粒來(lái)促使機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[32]。此外，NETs的相關(guān)成分可能誘導(dǎo)黏液高分泌和氣道重塑，從而加重哮喘[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞型哮喘與其他類型的哮喘相比，誘導(dǎo)痰中的dsDNA以及NETs各類成分的水平顯著偏高[34]。有研究觀察到中性粒細(xì)胞型哮喘小鼠的支氣管肺泡灌洗液中的總細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量有顯著增加。對(duì)于細(xì)胞因子，哮喘小鼠的血清，支氣管肺泡灌洗液和肺組織中的腫瘤壞死因子-α、白介素-23、白介素-17、白介素-6和白介素-1β的水平均顯著升高[35]。WAN等[36]研究證明NETs通過(guò)TLR4/NF-κB途徑刺激氣道細(xì)胞表達(dá)趨化因子(CXCL1、CXCL2和CXCL8)，從而將中性粒細(xì)胞招募到病變部位。這些結(jié)果表明了NETs會(huì)增加哮喘的炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子的數(shù)量。另外機(jī)體通過(guò)激活Raf-MEK-ERK通路，活化NADPH氧化酶，刺激ROS的產(chǎn)生，其通過(guò)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的炎癥損傷從而促進(jìn)哮喘的發(fā)病。一氧化氮也參與NETs的生成，機(jī)制之一可能是其活性氮參與氧化應(yīng)激導(dǎo)致組蛋白瓜氨酸的形成[37]。

3.2 針對(duì)NETs的哮喘治療在哮喘發(fā)展過(guò)程中，過(guò)量的NETs和其相關(guān)成分的積累以及持續(xù)存在與哮喘嚴(yán)重程度、肺功能和癥狀惡化有關(guān)。因此迫切需要進(jìn)一步探索有針對(duì)性的治療，調(diào)節(jié)NETs可能是哮喘的新靶標(biāo)治療方法。CitH3、MPO和dsDNA被評(píng)估為NETs的生物標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，給予DNase I通過(guò)減少肺泡腔和血漿中dsDNA-MPO復(fù)合體來(lái)分解NETs，并減輕了對(duì)仙臺(tái)病毒感染的早期炎癥反應(yīng)。在感染急性期，抑制NETs形成的重要物質(zhì)PAD4也能抑制白細(xì)胞的聚集和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[38]。為了進(jìn)一步證實(shí)NETs在仙臺(tái)病毒感染的早期炎癥反應(yīng)中的作用，仙臺(tái)病毒感染的小鼠注射了PAD抑制劑氯脒，該抑制劑優(yōu)先不可逆地使PAD4的鈣結(jié)合型失活。該研究表明氯脒可抑制中性粒細(xì)胞在肺泡腔的聚集和炎性細(xì)胞因子的釋放[38]。PHAM等[32]研究發(fā)現(xiàn)NETs可以通過(guò)損傷氣道上皮并觸發(fā)外周血中性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致哮喘加重。還有研究表明，通過(guò)減少巨噬細(xì)胞數(shù)量和抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β的活性可以減少體內(nèi)NETs的產(chǎn)生并改善中性粒細(xì)胞型哮喘小鼠的癥狀[35]。因此調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞形成的NETs可能是難治性哮喘的新治療方向。

核酸酶具有多種功能，例如獲取核苷酸的營(yíng)養(yǎng)、允許或阻止外源DNA的攝取、控制生物膜的形成及擴(kuò)散和調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)[39]。TOUSSAINT等[40]發(fā)現(xiàn)鼻病毒感染小鼠模型會(huì)觸發(fā)dsDNA的釋放，并且與NETs的形成相關(guān)。進(jìn)一步證明通過(guò)抑制NE或用DNA酶來(lái)降解NETs可以保護(hù)小鼠免受2型免疫反應(yīng)的影響。LACHOWICZ-SCROGGINS等[41]發(fā)現(xiàn)了dsDNA高水平哮喘的新治療方法，例如用脫氧核糖核酸酶(DNase)吸入破壞NETs或針對(duì)炎癥小體的治療。致敏小劑量LPS誘導(dǎo)肺中性粒細(xì)胞上調(diào)CXCR4、CD49d和LAMP-1，從而釋放NETs。

一氧化氮是由L-精氨酸合成的一氧化氮合酶合成的一種氣體信號(hào)分子，有調(diào)節(jié)血管舒張、遷移、增殖、分化、凋亡等多種功能[42]。對(duì)40例哮喘患兒中性粒細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，加入去氫硝基鐵酰胺鈉(SNP)、PMA和LPS可產(chǎn)生一氧化氮。SNP可誘導(dǎo)NETs，并呈劑量和時(shí)間依賴性。PMA(160 nmol/L)誘導(dǎo)NETs的能力最強(qiáng)，LPS(200 ng/mL)次之，SNP(200μmol/L)最弱，哮喘組NETs數(shù)量明顯高于健康組。一氧化氮合酶抑制劑對(duì)PMA和LPS誘導(dǎo)的NETs具有相同的阻斷能力，而NG-硝基-L-精氨酸甲酯(500μmol/L)對(duì)SNP誘導(dǎo)的抑制作用最強(qiáng)，且呈時(shí)間依賴性[37]。

總之，還是需要更多的研究來(lái)不斷尋找用于減輕NETosis的療法。這可能需要使用聯(lián)合療法，如抗生素、抗病毒藥物和NETs靶向藥物，還需要評(píng)估對(duì)整體免疫系統(tǒng)的影響，從而以最大限度去減少對(duì)患者的不利影響。

4 小結(jié)

NETs與許多疾病的進(jìn)展過(guò)程有關(guān)，雖然在清除病原體方面具有積極作用，但由于其中產(chǎn)生的酶、活性氧及其他導(dǎo)致組織損傷物質(zhì)的釋放，因此也具有破壞性。哮喘的嚴(yán)重程度與生物體中的NETs水平呈正相關(guān)。所以抑制NETs的形成是防止NETs或其成分對(duì)哮喘有害作用的有吸引力的策略。希望將來(lái)可以通過(guò)加深對(duì)NETs形成背后的分子機(jī)制的理解，進(jìn)一步闡明NETosis的調(diào)控以及研究其過(guò)程在哮喘中的作用及聯(lián)系。這將會(huì)是針對(duì)哮喘的一個(gè)新治療靶點(diǎn)。