共刺激分子4-1BB與腫瘤治療的研究進展

顧詮，馮繼鋒

1 4-1BB及其配體4-1BBL的結(jié)構(gòu)和特性

4-1BB基因最早于1989年在小鼠身上被發(fā)現(xiàn)并報道，研究者在細胞毒性T細胞和輔助性T細胞增殖相關mRNA中發(fā)現(xiàn)了由256個堿基構(gòu)成的4-1BB基因片段，并發(fā)現(xiàn)4-1BB在兩種T細胞增殖的過程中都具有誘導作用且具有大量膜受體和跨膜蛋白的特性[1]。4-1BB在1996年召開的全世界CD命名大會上被命名為CD137，是一種相對分子質(zhì)量為30 000的Ⅰ型跨膜蛋白，由細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細胞質(zhì)內(nèi)區(qū)三部分構(gòu)成。人4-1BB基因最先從人外周血的活化T細胞的cDNA文庫中利用分子雜交技術(shù)分離獲得。人4-1BB基因定位于1p36，包含10個外顯子和9個內(nèi)含子[2]。4-1BB主要表達于CD4+T、CD8+T表面，也可表達于NK細胞、NKT細胞、肥大細胞、中性粒細胞和Foxp3+T細胞。其配體4-1BBL是一種Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達于樹突狀細胞、B細胞及巨噬細胞這些專職抗原提呈細胞，也可以表達于肥大細胞、NK細胞、平滑肌細胞等[3]。

2 4-1BB信號通路在免疫中的作用

在機體產(chǎn)生腫瘤免疫應答的過程中，T細胞起到了至關重要的作用。T細胞活化需要“雙受體”和“雙信號”。T細胞抗原受體(TCR)與抗原肽的特異性結(jié)合，致使CD3胞內(nèi)段“免疫受體酪氨酸激活模體(ITAM)”序列的磷酸化，并啟動細胞活化的分子級聯(lián)反應，為T細胞活化提供第一信號。第二信號即共刺激信號，由T細胞和APC表面的共刺激分子之間的相互作用所介導，4-1BB/4-1BBL是除CD28/B7之外的另一組重要的共刺激分子。CD28/B7協(xié)同刺激信號主要作用于T細胞活化前期，而4-1BB/4-1BBL的協(xié)同刺激信號主要作用于活化后期。除了活化上的協(xié)同作用外，4-1BB/4-1BBL的協(xié)同刺激信號對CD8+T細胞的存活和記憶性殺傷也至關重要。4-1BB分子通過激動性抗體的交聯(lián)傳遞一種獨特而有效的共刺激信號，導致CD4+T和CD8+T細胞的激活和分化。4-1BB通過TRAF2-NIK傳導信號并激活NF-κB。通過4-1BB中繼信號抑制誘導活化細胞死亡，并在活化后期維持免疫系統(tǒng)的功能。

4-1BB分子的抗體可增加移植物抗宿主反應，并根除已存在的腫瘤。干擾4-1BB/4-1BBL信號通路對一些免疫性疾病如HIV具有治療作用。4-1BB缺陷的小鼠表現(xiàn)出免疫反應失調(diào)及對T細胞依賴性抗原免疫球蛋白的高反應性[4]。當CD28由于重復的刺激而下調(diào)時，4-1BB信號對于CD28的共同刺激在維持T細胞活化方面是至關重要的。4-1BB信號通過降低維持增殖和IL-2產(chǎn)生所需的抗CD28的閾值來與CD28共刺激信號起協(xié)同作用。4-1BB信號還通過增強Th1同時抑制Th2型細胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)CD28介導的細胞因子譜。4-1BB信號介導Th1型細胞的生成，這一過程通過細胞內(nèi)IFN-γ產(chǎn)生所識別。在表達4-1BB的細胞中可以檢測IFN-γ誘導，而表達CD30的則檢測不到IFN-γ的產(chǎn)生。4-1BB和CD30在CD4+和CD8+T細胞中均被誘導，但在每個T細胞亞群中，這兩個分子的位置是相互排斥的。研究提示，4-1BB信號調(diào)節(jié)靶細胞亞群中的CD28共刺激，以利于Th1的發(fā)育和維持細胞的長期生長[5]。

除了作用于CD4+T和CD8+T細胞，4-1BB信號途徑還可作用于其他細胞。Choi等[6]通過對比4-1BB完整的DC細胞和4-1BB缺陷的DC細胞的成熟過程，發(fā)現(xiàn)后者的成活率明顯低于前者，由此認為4-1BB對于DC細胞的成活有促進作用。4-1BB可參與共刺激B細胞的增殖。除了共刺激性外，4-1BB還具有抑制性,在特定情況下，4-1BB可作用于B細胞，下調(diào)其數(shù)量和產(chǎn)生抗體的能力；也可對CD4+T細胞產(chǎn)生抑制作用[7]。4-1BB對于Treg作用至今存在爭議，Elpek等[8]提出4-1BB在Treg的增殖中起正向促進作用并增強Treg對于免疫應答的抑制作用。而Choi等[9]的實驗結(jié)論則是Treg內(nèi)的4-1BB信號途徑并不影響Treg的增殖，同時4-1BB信號通路還可以拮抗Treg的免疫抑制作用。

3 4-1BB信號通路與腫瘤的關系

腫瘤免疫的過程主要由T細胞完成，因此4-1BB在腫瘤免疫中有重要作用。4-1BB在血管壁、內(nèi)皮層和血管平滑肌細胞中表達較強。實驗結(jié)果顯示，在32個健康組織樣本中沒有表達4-1BB的血管，在良性腫瘤(2/14)和炎性組織(2/9)中只有少數(shù)具有4-1BB表達的血管，然而在惡性腫瘤中有4-1BB表達的血管的比例明顯增高(11/34)[10]。Kamijo等[11]通過實驗證實5個皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)細胞系異常表達4-1BBL，抗4-1BBL中和抗體通過抑制AKT、ERK1/2、p38 MAPK和JNK的磷酸化而抑制CTCL細胞的增殖、存活以及CXCR4介導的遷移和體內(nèi)生長。此外，4-1BBL信號還可以通過減少抗凋亡蛋白、Bcl-2和磷酸化不良來起到抗腫瘤的作用。研究者還研究了調(diào)節(jié)4-1BBL表達的轉(zhuǎn)錄因子。GATA6在許多4-1BBL表達異常的腫瘤中作為癌基因已被提出，研究發(fā)現(xiàn)GATA6在CTCL中表達以及GATA6在4-1BBL表達中的作用。DNA低甲基化和組蛋白乙?；T導CTCL細胞GATA6過度表達，GATA6直接上調(diào)4-1BBL的表達。GATA6通過上述途徑抑制CTCL細胞的存活和體內(nèi)生長[11]。Thum等[12]通過構(gòu)建小鼠腫瘤模型研究4-1BB在腫瘤免疫中的作用，發(fā)現(xiàn)4-1BB可以促進CD8+T細胞增殖，同時促使CD8+向腫瘤內(nèi)浸潤。一方面4-1BB可以直接增強CD8+的免疫效應，另一方面可以通過增強CD4+T細胞、NK細胞的免疫功能來增強CD8+T細胞介導的腫瘤免疫應答。4-1BB信號通路可以增加促炎細胞因子的分泌，提升細胞溶解能力和增效抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用[13]。在胃癌中，癌細胞的免疫狀態(tài)與4-1BB/4-1BBL的表達狀態(tài)有關，如果腫瘤細胞4-1BBL呈高表達，則機體對于腫瘤細胞的殺傷作用會更強，反之，如果4-1BBL呈低表達，不能很好的構(gòu)建4-1BB/4-1BBL信號通路，機體對于腫瘤的免疫監(jiān)視作用便會減弱，更容易發(fā)生免疫逃逸[14]。Li等[15]使用4-1BBL基因修飾小鼠前胃癌細胞，使癌細胞呈4-1BBL高表達，數(shù)據(jù)顯示小鼠體內(nèi)高表達的4-1BBL可以明顯延緩腫瘤的生長，并且上調(diào)腫瘤浸潤淋巴細胞的細胞毒性，但在體外高表達的4-1BBL并不能抑制腫瘤的生長。由此認為4-1BBL對于腫瘤細胞并沒有直接的殺傷作用，而是通過增強腫瘤浸潤淋巴細胞的細胞毒性的方式來發(fā)揮抗腫瘤效應[15]。在前列腺癌中，癌細胞通過誘導樹突狀細胞凋亡來逃避免疫系統(tǒng)的殺傷，而激活的4-1BB信號可以通過上調(diào)Bcl-2、Bcl-xL的表達，增加TNF-α和IL-12的分泌來增強樹突狀細胞抵御癌細胞誘導的凋亡的能力[16]。一項探討4-1BB表達與非小細胞肺癌關系的研究結(jié)果顯示,4-1BB/4-1BBL在癌旁組織中呈高表達[17]。另一項探究4-1BB表達與胃癌關系的研究結(jié)果顯示，4-1BB/4-1BBL在胃癌組織和外周血中也呈高表達，且表達水平與局部和全身的免疫狀態(tài)有關[18]。在大腸癌患者血清中也發(fā)現(xiàn)4-1BB顯著增高，后續(xù)ELISA法證實4-1BB在大腸癌的診斷中特異度為97%，敏感度為83%，有望成為新的早期大腸癌診斷標志物[19]。

4 4-1BB在腫瘤治療中的應用

4.1 4-1BB在腫瘤化療中的應用前景

Kim等[20]使用4-1BB抗體和環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)合治療小鼠B16黑色素瘤，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療產(chǎn)生協(xié)同抗癌作用，相較于單用其中任一種治療都可以產(chǎn)生更多的腫瘤特異性CTL。聯(lián)合治療的抗腫瘤作用主要依賴于CD8+T細胞，CTX可以增強CD4+和CD8+T細胞表面4-1BB的表達，同時4-1BB抗體可以促進腫瘤特異性CTL的增殖，單獨或聯(lián)合應用CTX能有效抑制外周Treg的負向調(diào)節(jié)作用，還可以減輕化療所帶來的淋巴細胞減少等不良反應。4-1BB抗體與CTX有成為聯(lián)合治療方案的潛在可能，但還須后續(xù)研究進一步驗證。另外有研究發(fā)現(xiàn)使用多柔比星可以增加CD4+T細胞表面的4-1BB表達。在CD4+T細胞活化的情況下，用多柔比星預處理的樹突狀細胞比用活化CD8+T細胞培養(yǎng)的樹突狀細胞具有更高的存活率。由此我們認為，腫瘤患者在進行4-1BB單抗治療前使用多柔比星預處理，可能是增強抗腫瘤免疫應答的方法。其機制可能與增加抗原特異性CD4+Th1免疫應答有關[21]。

4.2 4-1BB在腫瘤靶向治療中的應用前景

西妥昔單抗，一種EGFR靶向的IgG1單抗，用于治療頭頸部腫瘤和結(jié)直腸癌可使患者獲益，但臨床改善有限。研究發(fā)現(xiàn)在多種小鼠異種移植模型中，包括EGFR高表達的腫瘤、KRAS野生型和KRAS突變型的結(jié)直腸癌，聯(lián)合應用西妥昔單抗和4-1BB單抗具有協(xié)同作用，導致腫瘤完全消退和延長存活時間，這種獲益取決于NK細胞的存在。在接受西妥昔單抗治療的患者中，循環(huán)和腫瘤內(nèi)NK細胞上的4-1BB水平取決于接受西妥昔單抗治療后的時間和宿主FcyRIIIA基因的多態(tài)性。NK細胞的4-1BB表達的增加直接與EGFR特異性CD8+T細胞的增加相關[22]。另外還有研究提示，4-1BB抗體與曲妥珠單抗[23]以及利妥昔單抗[24]聯(lián)合治療也有增效的作用。

4.3 4-1BB在腫瘤免疫治療中的應用前景

4.3.1 與IL-12聯(lián)合使用 癌癥免疫治療常常因受到抗腫瘤免疫應答的阻礙而失敗。既往研究證實白細胞介素12(IL-12)產(chǎn)生強烈的自然殺傷(NK)細胞介導的抗腫瘤反應，并減少結(jié)腸癌細胞系誘導的肝轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型中，研究者聯(lián)合應用IL-12和4-1BBL治療小鼠，對照單用IL-12的小鼠長期存活率明顯增高。腺病毒介導的IL-12和4-1BBL基因直接轉(zhuǎn)移至肝腫瘤導致腫瘤消退，并產(chǎn)生強有力的、持久的抗腫瘤免疫，可能為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移提供了新的診療思路[25]。

4.3.2 與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用 阻斷CTLA-4或激活4-1BB的抗體可促進某些小鼠對腫瘤的排異反應，但單藥治療免疫原性差的腫瘤例如B16黑色素瘤效果并不理想。Curran等[26]聯(lián)合使用CTLA-4抗體與4-1BB抗體治療黑色素瘤發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療方案有協(xié)同作用，促使CD8+T細胞向腫瘤浸潤并誘導抗腫瘤的免疫微環(huán)境重塑。Xiao等[27]利用共刺激分子4-1BBL單抗結(jié)合可溶性PD-1單抗建立有效的抗腫瘤免疫途徑，在肝癌小鼠模型中，這樣的聯(lián)合治療清除了荷瘤小鼠體內(nèi)較小的腫瘤，而對于較大腫瘤，也有60%得到了清除。在結(jié)腸腺癌模型中，應用PD-1信號通路阻斷和4-1BB信號通路激活聯(lián)合治療荷瘤小鼠，在其腫瘤局部發(fā)現(xiàn)大量T細胞浸潤，相較于單用任一種治療，4-1BB激活和PD-1阻斷聯(lián)合對腫瘤生長有明顯抑制作用。單用抗PD-1抑制腫瘤生長的抑制作用不明顯，用抗4-1BB單抗和抗PD-1聯(lián)合治療荷瘤小鼠具有最好的抗腫瘤反應[28]。進一步的研究表明4-1BB共刺激增強CD8+T細胞的功能，抗PD-1介導CD8+T細胞的再活化，從而發(fā)揮更強的抗腫瘤作用[29]。

4.3.3 在嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)中的應用 CAR-T細胞成功根除腫瘤取決于CAR-T細胞的持久性和效應器功能。CD4+和CD8+T細胞可能表現(xiàn)出不同的持久性和效應表型，這取決于產(chǎn)生CAR的特定細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導域(ICD)的身份。首先，共刺激分子的ICD顯著提高了表達CAR的CD4+T細胞的體內(nèi)持久性，這反過來又增加了CD8+T細胞的持久性[29]。這些數(shù)據(jù)表明，CD8+T細胞的持久性高度依賴于ICD提供的輔助效應，ICD用于重定向CD4+T細胞。其次，在第三代CAR中，ICOS和4-1BB的ICD結(jié)合顯示出優(yōu)越的抗腫瘤效果和增強的體內(nèi)持久性。有趣的是，在第三代CAR中，膜-近端ICD在遠端區(qū)域顯示出主導作用。在第三代CAR-T細胞中觀察到的最佳抗腫瘤和持久性益處要求ICOS的ICD位于細胞膜附近，并與ICOS跨膜結(jié)構(gòu)域連接。因此，具有ICOS和4-1BB的ICD的CAR在實體瘤模型中顯示出比現(xiàn)有的基于4-1BB的CAR更高的功效，并且是臨床測試的有前途的治療藥物[30]。

4.3.4 在過繼性T細胞回輸中的應用 經(jīng)基因修飾以表達選擇性共刺激分子的人工APC(aAPC)為人類T細胞的多克隆擴增和過繼免疫治療提供了可重復、成本效益高和方便的方法。在已經(jīng)研究的各種aAPC中，表達抗CD3和抗CD28的脫細胞的aAPC能有效地擴增CD4+T細胞，但不能擴增CD8+T細胞?；诩毎腶APC能有效地擴增細胞溶解CD8+T細胞，但尚未確定最佳共刺激信號。而用HLA-A2-Fc融合蛋白與4-1BBL aAPC相連，可誘導特異性CD8+CTL擴增。此外，與使用CD28共刺激擴增的細胞溶解性T細胞相比，使用4-1BB共刺激擴增的CTL介導的細胞的細胞毒作用更強，部分原因是NKG2D上調(diào)。這些結(jié)果表明，4-1BB共刺激對在體外擴增記憶性CD8+T細胞是必不可少的，并且優(yōu)于CD28共刺激產(chǎn)生Ag特異性產(chǎn)物用于過繼細胞治療[31]。

4.3.5 4-1BB相關的單克隆抗體 烏托米單抗(Utomilumab)和Urelumab是兩個以4-1BB為靶點的新免疫藥物。研究發(fā)現(xiàn)，浸潤人和小鼠腫瘤的Treg細胞上4-1BB呈高表達。4-1BB單抗可以耗竭腫瘤內(nèi)Treg細胞，同時促進效應T細胞增殖。這些不同的機制是競爭性的，并且依賴于抗體種型和Fcγ受體的有效性。在多種實體瘤模型中，給予優(yōu)先消耗Treg細胞的抗4-1BB IgG2a單抗，然后給予激動性抗4-1BB IgG1單抗或抗PD-1單抗可增強抗腫瘤反應[32]。這些機制的研究為抗4-1BB單抗的臨床應用奠定了基礎。

Utomilumab是一種人源化IgG2激動性單克隆抗體，能有效、特異地與人4-1BB胞外段的結(jié)構(gòu)域結(jié)合[33]。一項研究Utomilumab安全性、抗腫瘤活性、藥代動力學和藥效學的Ⅰ期臨床實驗[34]結(jié)果顯示：23例既往接受過多線治療的晚期實體瘤患者接受每3周Utomilumab和帕博利珠單抗(Pembrolizumab)的聯(lián)合治療，無劑量限制性毒性。治療相關的不良事件多為1～2級，且沒有因不良事件終止治療的患者。6例(26.1%)患者療效評估認定為部分緩解或完全緩解。在這6例患者中，有5例獲得了持續(xù)時間6個月以上的抗腫瘤免疫效應。與無應答者相比，應答者外周血CD8+T細胞活性有升高的趨勢。單獨或聯(lián)合給藥時，Utomilumab和Pembrolizumab的藥代動力學和免疫原性相似。

Urelumab是一種人源化IgG4單克隆抗體，通過部分覆蓋4-1BB/4-1BBL結(jié)合位點來阻斷相互作用[35]。一項探究Urelumab與納武利尤單抗(Nivolumab)在RAG2-/IL2Rγ缺乏荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性的研究數(shù)據(jù)顯示，在移植人結(jié)直腸HT-29癌細胞或人胃癌細胞的免疫缺陷小鼠中，聯(lián)合治療方案明顯減緩了腫瘤的生長，這可能與聯(lián)合治療之后產(chǎn)生IFNγ的活化人T淋巴細胞數(shù)量增加，以及腫瘤移植物中調(diào)節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量減少有關[36]。Michiko等選取9例術(shù)前接受紫杉類+蒽環(huán)類藥物新輔助化療的三陰性乳腺癌患者術(shù)后的癌組織進行培養(yǎng)，在使用Urelumab處理后發(fā)現(xiàn)，Urelumab不僅可以增加CD8+T細胞增殖的數(shù)量，而且增強了它們的細胞毒作用[37]。Urelumab的藥物相關不良反應主要是肝毒性，當藥物劑量>1 mg/kg時肝毒性明顯增加，另外也有骨髓抑制的不良事件報道，但多為1～2級。目前研究數(shù)據(jù)顯示0.1～0.3 mg/kg的藥物劑量是較為安全的治療方案[38]。Urelumab聯(lián)合細胞毒藥物、伊馬替尼、利妥昔單抗、西妥昔單抗、埃羅妥珠單抗等治療多種轉(zhuǎn)移性實體瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床試驗正在進行中。

4.3.6 在腫瘤疫苗中的應用 腫瘤疫苗是近幾年的研究熱點，與傳統(tǒng)的放化療作用于病灶不同的是，腫瘤疫苗通過多種形式將腫瘤抗原導入人體內(nèi)，增加APC的腫瘤相關抗原提呈，從而解除腫瘤所致的免疫抑制狀態(tài)，并“教會”免疫系統(tǒng)去識別、定位、打擊腫瘤細胞。從作用機制上來看，腫瘤疫苗和4-1BB單抗應該有協(xié)同的作用，前者激活機體的抗腫瘤免疫效應，后者進一步促進腫瘤特異細胞毒性T細胞的增殖和免疫效應。在AT-3乳腺癌模型和MC38結(jié)腸癌模型中，腫瘤疫苗和4-1BB單抗聯(lián)合治療可以降低腫瘤負荷，同時在腫瘤引流淋巴結(jié)中觀察到骨髓細胞的浸潤和在腫瘤組織中觀察到CD8+T細胞、NK細胞和中性粒細胞的浸潤。相比于聯(lián)合使用免疫檢查點抑制劑，4-1BB單抗與腫瘤疫苗聯(lián)合使用展現(xiàn)出了更好的效果[39]。在MCA205纖維肉瘤小鼠模型中，腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞疫苗聯(lián)合4-1BB單抗明顯減少了腫瘤的肺轉(zhuǎn)移，同時在B16-BL6黑色素瘤模型中這樣的聯(lián)合治療也使肺部病灶明顯退縮而且獲得了更長的生存期[40]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在前臨床小鼠模型中，腫瘤疫苗聯(lián)合4-1BB單抗根除了B細胞淋巴瘤，這與荷瘤小鼠體內(nèi)T細胞的細胞毒性顯著增強、IFNγ產(chǎn)生以及T細胞增殖相關，且所有在治療后存活的小鼠都產(chǎn)生了持久的抗腫瘤免疫[41]。

4.4 4-1BB在腫瘤放療中的應用前景

放療已經(jīng)成為很多惡性腫瘤標準治療中的一部分，除了直接殺傷惡性細胞外，放療也有激活并增強腫瘤免疫應答的潛能。Shi等[42]報道在小鼠腫瘤模型中，高劑量的放療可以誘導4-1BBL的表達，在EMT6腫瘤模型中4-1BB單抗與放療的聯(lián)合應用明顯抑制了腫瘤的生長速度(腫瘤體積從200 mm3增長到1 000 mm3的中位時間從28.5 d延長到了40 d)，且延長了總生存期。聯(lián)合使用4-1BB單抗在單次放療方案和劑量分割放療方案中均有獲益。但這種治療上的協(xié)同作用與放療的總劑量和劑量分割方案有關。最新研究發(fā)現(xiàn)放療可以誘導腫瘤微環(huán)境中VEGF的表達和4-1BB的共刺激作用，聯(lián)合免疫治療可以更好地控制局部腫瘤及遠處轉(zhuǎn)移，且降低免疫治療的毒性。一項聯(lián)合靶病灶放療、4-1BB激活和CTLA-4阻斷的研究顯示，在膠質(zhì)母細胞瘤小鼠模型中，這樣的三聯(lián)治療減少腫瘤體積、提高小鼠生存率，并使其DFS延長50%以上[43]。在這樣的聯(lián)合治療方案中，CD4+T細胞的耗竭是限制療效的關鍵所在。4-1BB單抗聯(lián)合放療方案為包含顱腦腫瘤、肺癌在內(nèi)的多種實體瘤治療提供了一個新的選擇。

5 展望

如上文所述，從4-1BB信號通路被發(fā)現(xiàn)開始的20年來，我們對于4-1BB/4-BBL的結(jié)構(gòu)、特性及作用機制有了更詳細的了解。對于許多傳統(tǒng)放化療療效不佳的腫瘤以及一些難于管理的治療相關毒副反應，4-1BB相關治療手段顯示出了良好的應用前景。隨著腫瘤免疫學的發(fā)展和相關研究的進一步深入，4-1BB也許會為將來的腫瘤免疫治療提供新的思路與方法。