細(xì)菌抗噬菌體感染主動(dòng)免疫機(jī)制的研究進(jìn)展

朱 丹，王 英，文 豪，邢 坤，林思楊

（四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

1 概述

噬菌體（Phage）作為病毒的一種，可特異性“捕食”細(xì)菌。根據(jù)噬菌體是否導(dǎo)致細(xì)菌死亡，可分為溫和性噬菌體和烈性噬菌體。噬菌體作為抗生素的替代品之一，具有制備工藝簡單、高特異性和不受細(xì)菌耐藥性影響等優(yōu)點(diǎn)［1］。目前噬菌體已廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中，特別是在家禽養(yǎng)殖中用于預(yù)防和控制大腸桿菌、沙門氏菌和空腸彎曲桿菌等細(xì)菌感染。但細(xì)菌會針對噬菌體的感染進(jìn)化出自我防御機(jī)制，自我防御機(jī)制可以分為兩大類，分別為被動(dòng)免疫及主動(dòng)免疫。被動(dòng)免疫主要是通過細(xì)菌的莢膜、生物膜等外部結(jié)構(gòu)或者次級代謝產(chǎn)物來抵御噬菌體的侵蝕，而主動(dòng)免疫機(jī)制較為復(fù)雜，本文就細(xì)菌抗噬菌體感染的主動(dòng)免疫機(jī)制進(jìn)行介紹，為今后開發(fā)和應(yīng)用噬菌體制劑提供理論參考。

2 主動(dòng)免疫機(jī)制

2.1 阻止噬菌體吸附 在噬菌體侵染過程中，噬菌體的受體結(jié)合蛋白通過特異性識別細(xì)菌的脂多糖、莢膜多糖以及外膜蛋白等受體完成吸附，而細(xì)菌通過改變表面受體的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象等方式，有效限制噬菌體的吸附。如鼠疫耶爾森菌的合成脂多糖相關(guān)基因會自發(fā)突變，導(dǎo)致該菌產(chǎn)生對多種噬菌體的抗性。還有一些細(xì)菌可利用產(chǎn)生的“柵欄”來干擾噬菌體對受體的辨別，如大腸桿菌K1的莢膜能有效阻止噬菌體T7 吸附脂多糖。此外，細(xì)菌還能通過結(jié)合外環(huán)境中的小分子封閉噬菌體結(jié)合位點(diǎn)來阻止噬菌體吸附。

2.2 抑制噬菌體DNA 侵入 超感染排除系統(tǒng)（Sie）是細(xì)菌防止噬菌體DNA 入侵菌體的“首道屏障”。以大腸桿菌的Sie系統(tǒng)為例，Sie系統(tǒng)是由Imm 和Sp 蛋白的Imm 系統(tǒng)和Sp 系統(tǒng)組成。Imm系統(tǒng)和Sp 系統(tǒng)能阻止DNA 侵入細(xì)菌，防止噬菌體的進(jìn)一步感染。其中，Imm 系統(tǒng)中兩個(gè)位于細(xì)胞膜的特殊跨膜區(qū)域可在噬菌體DNA 侵入時(shí)發(fā)生構(gòu)象改變，但I(xiàn)mm系統(tǒng)須在其他膜蛋白的協(xié)同作用下發(fā)揮對噬菌體的抑制作用。噬菌體T4 溶菌酶通過降解細(xì)胞壁肽聚糖形成空洞，讓噬菌體DNA 侵入細(xì)菌［2］，而Sp 蛋白可通過抑制T4 溶菌酶的活性來防止肽聚糖層的降解。

2.3 阻斷或干擾噬菌體DNA復(fù)制

2.3.1 限制-修飾系統(tǒng) 限制-修飾系統(tǒng)（RM）存在于75%的原核生物基因組中，許多DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶是一些限制性-修飾基因系統(tǒng)的成分［3］。RM 系統(tǒng)可阻止噬菌體DNA 進(jìn)入，從而使細(xì)菌能夠抵抗噬菌體感染。此功能主要取決于噬菌體是否含有RM 系統(tǒng)基因編碼產(chǎn)物的識別序列，與噬菌體的類別沒有絕對的聯(lián)系。EcoRII 甲基轉(zhuǎn)移酶（M.EcoRII）屬于Ⅱ型限制-修飾系統(tǒng)，可以對DNA序列甲基化，并抑制EcoRII核酸內(nèi)切酶對該DNA 序列進(jìn)行切割。當(dāng)EcoRII RM 基因復(fù)合體受到擾亂以后，其甲基化轉(zhuǎn)移酶不能發(fā)揮正常的修飾作用，從而導(dǎo)致限制酶對自身DNA 序列酶切，最終基因組被破壞，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

天藍(lán)色鏈霉菌中還存在另外一種RM 系統(tǒng)，噬菌體生長限制（Pgl）系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要針對類似φC31 噬菌體等溫和性噬菌體，由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶PglX、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PglW、ATPase酶PglY、堿性磷酸酶家族PglZ 4 種蛋白組成［4］。在未被噬菌體感染的細(xì)菌中，PglX與PglZ類似于毒素/抗毒素系統(tǒng)，PglZ 能夠抑制PglX 的活性［5］。Pgl＋鏈霉菌被噬菌體φC31 感染時(shí)，PglW 通過磷酸化作用將信號傳遞給其他Pgl 蛋白，激活PglX DNA甲基化酶作用［6］。

2.3.2 CRISPR-Cas 系統(tǒng) 細(xì)菌CRISPR-Cas 系統(tǒng)由具有典型間隔短回文重復(fù)單元（CRISPR）和分布在操縱子區(qū)域的多種Cas 基因組成。CRISPR 單元主要位于細(xì)菌染色質(zhì)上，由富含AT的前導(dǎo)序列（Leader sequence）、高度保守的重復(fù)序列（repeats，21-48 bp）和間隔序列（Spacer）組成。在CRISPR 位點(diǎn)附近，存在4～10 個(gè)保守的CRISPR 相 關(guān)（CRISPR-associated，Cas）基 因。CRISPR-Cas 系統(tǒng)作為細(xì)菌特有的主動(dòng)免疫系統(tǒng)，可特異性抵抗外源基因的入侵［7］。CRISPRCas 系統(tǒng)作為細(xì)菌的主動(dòng)免疫系統(tǒng)，不但具有可遺傳性，還具有與真核免疫細(xì)胞類似的特異性和記憶性。

2.3.3 BREX 系統(tǒng) 噬菌體排除系統(tǒng)（BREX）首次發(fā)現(xiàn)于蠟樣芽孢桿菌中，約10%細(xì)菌基因中具有該系統(tǒng)，該系統(tǒng)位于基因組的防御島上。BREX 系統(tǒng)一般在噬菌體感染后期發(fā)揮作用，具有與Pgl系統(tǒng)中相同的同源物——甲基化酶PglX和堿性磷酸酶PglZ。與Pgl系統(tǒng)不同，BREX系統(tǒng)通過m6A DNA腺嘌呤甲基化酶使細(xì)菌基因組中的非回文TAGGAG 序列甲基化，而噬菌體DNA不會甲基化［8］。BREX系統(tǒng)僅抑制噬菌體DNA復(fù)制和繁殖，不會降解噬菌體DNA。

2.3.4 DISARM 系統(tǒng) DISARM 系統(tǒng)是一種新型抗噬菌體防御系統(tǒng)，它能預(yù)防來自有尾雙鏈DNA噬菌體的感染。構(gòu)成DISARM系統(tǒng)的核心基因是解旋酶基因（drmA）、DUF1998（pfam0939）結(jié)構(gòu)域基因（drmB）和PLD（磷脂酶D）結(jié)構(gòu)域編碼基因（drmC）。DISARM 系統(tǒng)分為I 型和II 型。除3 個(gè)核心基因外，I 型包括2 個(gè)基因，分別為腺嘌呤甲基化酶基因（drmMI）、SNF2 家族解旋酶基因（drmD）；而II 型也包含2 個(gè)基因，分別為胞嘧啶甲基化酶基因（drmII）、某個(gè)功能未知的基因。Ofir 等［9］在不含II 型DISARM 系統(tǒng)的枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入該系統(tǒng)后，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入該系統(tǒng)的枯草芽孢桿菌具備了抗多種雙鏈DNA 噬菌體的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)不僅能限制性切割噬菌體DNA，還可以甲基化修飾細(xì)菌DNA 的CCWGG（W＝A/T）序列。

2.4 流產(chǎn)感染機(jī)制 流產(chǎn)感染（Abi），也被叫做噬菌體排斥，一般發(fā)生在噬菌體DNA侵入細(xì)菌之后，細(xì)菌通過自身死亡的方式阻止噬菌體的進(jìn)一步繁殖與釋放。毒素-抗毒素機(jī)制是一種典型的流產(chǎn)感染機(jī)制，毒素-抗毒素系統(tǒng)（TA）位于質(zhì)粒、整合性結(jié)合元件、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件上。按照抗毒素的生化特征，TA 主要分為兩種：I 型TA 系統(tǒng)抗毒素是小RNA，可以干擾毒素基因的表達(dá)［10］；II型TA系統(tǒng)抗毒素是小的且穩(wěn)定性較差的蛋白質(zhì)，可以與毒素蛋白形成復(fù)合體，使毒素蛋白處于非活性狀態(tài)。該系統(tǒng)與大量的細(xì)胞功能有關(guān)，包括程序化細(xì)胞死亡、可移動(dòng)遺傳元件、抗生素耐藥性等［11］。細(xì)菌具有多種TA 系統(tǒng)，但不同菌株分布的種類有很大差異，可能是通過水平轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移。其之所以可以進(jìn)化成功，很可能是因?yàn)橘|(zhì)粒編碼TA 系統(tǒng)具有“分離后致死效應(yīng)”［12］。近幾十年來，隨著TA 位點(diǎn)越來越多的發(fā)現(xiàn)，調(diào)控細(xì)菌生存和適應(yīng)的策略將被揭示。

除了TA系統(tǒng)外，研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀GMP-AMP合酶（cGAS）防御系統(tǒng)也屬于流產(chǎn)感染機(jī)制的一種。cGAS-STING途徑是動(dòng)物細(xì)胞自主先天免疫系統(tǒng)的核心組成部分。cGAS 蛋白是細(xì)胞質(zhì)病毒DNA 的傳感器，在檢測到DNA 時(shí)，產(chǎn)生環(huán)狀GMP-AMP 信號分子，該分子結(jié)合STING 蛋白并激活免疫應(yīng)答［13］。

3 展望和分析

在細(xì)菌免疫系統(tǒng)中，不同免疫機(jī)制相互協(xié)調(diào)，共同維持細(xì)菌穩(wěn)態(tài)。RM 系統(tǒng)、CRISPR-Cas系統(tǒng)、BREX 系統(tǒng)、DISARM 系統(tǒng)構(gòu)成了防御噬菌體感染的胞內(nèi)第一道防線，限制了噬菌體DNA和質(zhì)粒等移動(dòng)遺傳元件的有效性，阻止噬菌體的繁殖，保護(hù)單個(gè)細(xì)菌不被感染。若噬菌體突破了宿主防御的第一道防線，細(xì)菌也可通過Abi 系統(tǒng)誘發(fā)死亡，中斷噬菌體繁殖過程，限制噬菌體擴(kuò)散，以“犧牲小我”的形式保護(hù)群體不被滅絕。除了上述機(jī)制之外，在細(xì)菌的防御島上還發(fā)現(xiàn)多個(gè)抗噬菌體系統(tǒng)相關(guān)基因，但其具體的作用機(jī)制仍然不清楚。細(xì)菌利用不同免疫機(jī)制抵御噬菌體感染，一旦了解細(xì)菌免疫噬菌體的機(jī)制，臨床上就可以通過人工改造或修飾噬菌體的關(guān)鍵分子或蛋白，達(dá)到免疫逃逸的目的，有助于噬菌體制劑的開發(fā)和應(yīng)用。