外泌體在腦膠質(zhì)瘤化療耐藥中的研究進展

劉彥廷 孫 拯 田春雷

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 神經(jīng)外科， 湖北 宜昌 443003)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。目前臨床治療過程中，膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物敏感性逐步降低，嚴重影響患者預(yù)后。膠質(zhì)瘤細胞源性的外泌體可攜帶或富集多種生物分子，如microRNA(miRNAs)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)、mRNAs或蛋白質(zhì)等，直接調(diào)控腫瘤細胞化療耐藥。此外，外泌體轉(zhuǎn)運載體生物相容性好，更易通過顱內(nèi)血腦屏障；對外泌體膜蛋白或糖基進行修飾后，可靶向進入顱內(nèi)腫瘤細胞，是理想的生物治療載體[1]。本文現(xiàn)將外泌體在腦膠質(zhì)瘤化療中的研究進展進行簡要綜述。

1 外泌體的組成結(jié)構(gòu)

外泌體是一種起源于細胞膜囊泡內(nèi)吞途徑或直接從細胞質(zhì)膜釋放到細胞外的囊性小泡，直徑約40～120 nm，電子顯微鏡下呈現(xiàn)脂質(zhì)雙層球形結(jié)構(gòu)[2]。外泌體的形成過程分為合成和釋放兩個階段：即外泌體首先在多泡體內(nèi)形成腔內(nèi)小泡，細胞溶質(zhì)RNA或蛋白質(zhì)進入腔內(nèi)小泡后，裂解成游離小泡；隨后與外周膜融合并釋放到細胞微環(huán)境中[3]。目前已在膠質(zhì)瘤細胞源性外泌體中鑒定出多種生物分子，如特征性蛋白質(zhì)：小G蛋白(Rab11，Rab27a，Rab27b)、跨膜蛋白家族CD63、CD81，以及RNA，如miRNAs、mRNAs、lncRNAs和小干擾RNA(small interference RNAs， siRNAs)等。通過分析外泌體內(nèi)的生物分子，可間接判斷腦膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的敏感度[4]。

2 外泌體通過攜帶生物分子調(diào)控腦膠質(zhì)瘤化療耐藥

2.1 miRNAs

研究證實，外泌體可作為miRNAs的有效載體，直接調(diào)控腦膠質(zhì)瘤化療耐藥。如替莫唑胺(temozolomide，TMZ)刺激下，膠質(zhì)瘤U87細胞源性外泌體內(nèi)miR-221含量增加，從而改變細胞對TMZ的敏感性[5]。將富集miR-10b或miR-21的外泌體加入膠質(zhì)瘤細胞SHG-44培養(yǎng)基后，細胞對TMZ及伊馬替尼的耐藥性均增加[5]。此外，將攜帶miR-146b的外泌體注射進入大鼠膠質(zhì)瘤模型后，可顯著降低腫瘤體積，推測外泌體可能通過miR-146b抑制小果蠅母體抵抗因子家族蛋白活性，提高膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的敏感性[6]。將TMZ與攜帶miR-1238的外泌體共同注入小鼠膠質(zhì)瘤模型后，腫瘤組織的體積及重量均高于單獨注射TMZ[7]。因此，多數(shù)學(xué)者認為，外泌體可以攜帶功能性miRNAs，通過對受體細胞相應(yīng)靶基因mRNAs進行翻譯抑制，調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的化療敏感性。

此外，少數(shù)外泌體所攜帶的miRNAs，可直接作用于藥物排出泵，如跨膜轉(zhuǎn)運蛋白或P-糖蛋白，通過影響細胞內(nèi)的化療藥物濃度，改變腫瘤細胞的化療敏感性。外泌體攜帶miR-21進入受體細胞后，可下調(diào)ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族G或丟失性磷酸酶張力蛋白(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)，恢復(fù)腫瘤多藥耐藥組件活性，改變細胞對藥物的敏感程度[8]。

2.2 mRNAs

外泌體可攜帶與腦膠質(zhì)瘤化療耐藥相關(guān)的mRNAs或膠質(zhì)瘤干細胞特性相關(guān)mRNAs，改變腫瘤細胞的化療敏感性。如TMZ耐藥細胞株源性的外泌體，可攜帶高濃度的O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)、甲基嘌呤DNA糖基化酶或谷氨酰胺酶mRNAs，進入受體細胞后，改變腫瘤細胞對TMZ的敏感性[9]。有學(xué)者提出，外泌體包含的mRNA多與細胞核定位有關(guān)，如外泌體攜帶的MGMT mRNA水平與該基因啟動子甲基化狀態(tài)相關(guān)，是表觀遺傳沉默的一種形式[9]。

此外，外泌體還可攜帶非化療耐藥相關(guān)基因發(fā)揮作用，如膠質(zhì)母細胞瘤患者血清中的外泌體，可通過富集表皮生長因子受體變體Ⅲ、異檸檬酸脫氫酶-1等mRNAs發(fā)揮作用。因此，有學(xué)者提出，在患者治療期間檢測上述分子可以判斷腫瘤細胞對化療的敏感性[10]。

2.3 lncRNAs

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可攜帶lncRNAs，通過吸附受體細胞內(nèi)的miRNAs、干擾轉(zhuǎn)錄因子活性或與細胞內(nèi)核酸分子形成復(fù)合體等方式，影響腦膠質(zhì)瘤化療敏感性。如將GBM細胞與攜帶lncRNA SFB2-AS1的外泌體共培養(yǎng)48 h后，細胞對TMZ敏感性降低[11]。將lncRNA PTENP1導(dǎo)入外泌體并加入U87細胞后，可競爭性結(jié)合受體細胞內(nèi)的miR-10a-5p，影響受體細胞PTEN含量，改變腫瘤細胞的化療敏感性[12]。此外，外泌體攜帶lncRNA ATB或lncRNA CCAT2后，通過抑制miR-204-3p，抑制缺氧誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而改變細胞對TMZ的敏感性[13]。

2.4 siRNA

外泌體還可通過攜帶siRNAs調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞化療耐藥。然而，siRNA進入外泌體必須借助于電穿孔或基因工程技術(shù)。目前已有學(xué)者針對膠質(zhì)瘤化療耐藥蛋白MGMT或ABCB1，設(shè)計對應(yīng)siRNA，在電穿孔技術(shù)輔助下，使外泌體富集siRNA。將其注入小鼠膠質(zhì)瘤模型后發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞內(nèi)的MGMT，ABCB蛋白含量降低[14]。在結(jié)合TMZ藥物治療的同時，小鼠膠質(zhì)瘤模型中的腫瘤體積及重量均低于對照組，提示外泌體可通過siRNA下調(diào)受體細胞內(nèi)的耐藥基因，提高細胞對化療藥物的敏感性[15]。

2.5 蛋白質(zhì)

在腫瘤微環(huán)境中，膠質(zhì)瘤細胞源性外泌體可攜帶化療藥物抗性相關(guān)蛋白，改變受體細胞的藥物敏感性。如TMZ刺激下，膠質(zhì)瘤細胞T98源性外泌體中，ABC家族蛋白、DNA損傷修復(fù)酶濃度與TMZ作用時間均存在正相關(guān)性[16]。

此外，外泌體還可通過攜帶非耐藥相關(guān)蛋白發(fā)揮作用。如低濃度TMZ刺激下，腫瘤細胞源性外泌體可富集穹窿蛋白、端粒酶相關(guān)蛋白、聚ADP核糖聚合酶等[17]。將其注射入小鼠膠質(zhì)瘤模型后發(fā)現(xiàn)，小鼠皮下腫瘤的體積及重量均降低[18]。將此類外泌體重新加入膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)基后，發(fā)現(xiàn)受體細胞凋亡比例下降，進而降低細胞對TMZ的敏感性。目前已證實，外泌體還可富集白細胞介素6 、血小板源性生長因子受體α、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶2、熱休克蛋白、凋亡抑制蛋白及過氧化氫酶蛋白等，分別通過不同的下游通路或機制發(fā)揮作用[19]。

3 外泌體通過調(diào)控免疫應(yīng)答干預(yù)化療耐藥

外泌體可通過多種方式調(diào)節(jié)腫瘤化療過程中的免疫反應(yīng)，影響宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷作用，如削弱效應(yīng)T細胞或自然殺傷細胞的功能，抑制樹突狀細胞分化，擴大髓系來源的抑制細胞等。將膠質(zhì)瘤G26細胞源性外泌體注射入小鼠膠質(zhì)瘤模型后，外泌體可降低CD8+T細胞的損耗，減少干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和Granzyme B細胞毒性因子產(chǎn)生[20]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可減少吲哚胺2，3-二氧基酶、趨化因子CCL2和CCL22的產(chǎn)生，調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的T細胞數(shù)量，影響腫瘤細胞免疫反應(yīng)[21]。此外，自然殺傷細胞源性外泌體在體內(nèi)外對膠質(zhì)母細胞瘤均表現(xiàn)出抗腫瘤作用，如異種移植小鼠膠質(zhì)瘤病灶內(nèi)注射自然殺傷細胞源性外泌體后，生物熒光成像顯示腫瘤生長減緩，腫瘤體積縮小[22]。上述結(jié)果提示，外泌體可通過干預(yù)免疫調(diào)節(jié)，改變免疫應(yīng)答，影響機體對化療藥物的敏感性。

4 外泌體通過增強遞質(zhì)轉(zhuǎn)運效果，影響腦膠質(zhì)瘤化療敏感性

外泌體作為藥物及生物分子的轉(zhuǎn)運遞質(zhì)，具有多個優(yōu)點。首先，外泌體是核酸的天然載體，攜帶分子范圍大，可攜帶多種RNAs并通過血腦屏障。通過靶向肽和基因工程方法修飾后的外泌體，血腦屏障透過率更高[23]。多柔比星和紫杉醇均難以透過血腦屏障，而將上述藥物導(dǎo)入腦內(nèi)皮細胞源性外泌體后，其治療效果明顯優(yōu)于靜脈給藥[24]。其次，外泌體具有高度靶向性，通過遺傳工程技術(shù)對其表面受體分子進行修飾后，可放大特異性受體配體模式，有望成為靶向藥物的理想載體[25]。此外，外泌體轉(zhuǎn)運載體具有良好的生物分布和生物相容性，以便將特定的功能性RNAs加載到外泌體中，同時避免細胞外核酸內(nèi)切酶的破壞。與脂質(zhì)納米顆粒相比，外泌體在血流中具有穩(wěn)定性和隱身能力，免疫源性低，如修飾后的外泌體對αV整聯(lián)蛋白陽性乳腺癌細胞的靶向性明顯提高[26]。

5 其他機制

除上述機制以外，外泌體還可以在膠質(zhì)瘤化療過程中發(fā)揮協(xié)同作用。如外泌體通過抑制靶基因X連鎖凋亡抑制蛋白，延長可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand，sTRAIL)半衰期，提高sTRAIL的抗腫瘤效果[27]。在裸鼠膠質(zhì)瘤模型中，外泌體與TRAIL同時進入體內(nèi)后，膠質(zhì)瘤細胞的成瘤能力及生長速度均低于TRAIL單獨使用[27]。此外，外泌體可通過干擾腫瘤細胞遷移、侵襲及分化能力等，調(diào)節(jié)腫瘤干細胞與非干細胞之間的平衡。如膠質(zhì)瘤細胞源性的外泌體通過促進粘著斑激酶、樁蛋白和原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src活化，激活整合素連接的激酶和黏著斑激酶，改變膠質(zhì)瘤細胞的化療敏感性[28]。

6 結(jié)語

腦膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類生命健康。由于化療耐藥的出現(xiàn)，導(dǎo)致患者遠期預(yù)后較差。結(jié)合前述所知，外泌體在腦膠質(zhì)瘤化療耐藥中的調(diào)控作用，不僅取決于自身所富集的生物分子，還與受體細胞的靶向性，腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答，人工合成物的組織相容性密切相關(guān)。此外， 外泌體所涉及的下游調(diào)控靶點，不僅包括MGMT或ABCB1等膠質(zhì)瘤化療耐藥相關(guān)蛋白，還與腫瘤細胞增殖凋亡相關(guān)蛋白、腫瘤干細胞分化因子等密切相關(guān)。相信隨著逐步深入的探索，利用外泌體改善腦膠質(zhì)瘤化療效果將成為一種新的臨床治療策略。