經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)在肺癌術(shù)前病理分型中的應(yīng)用價值研究

王妍，石芳，劉俊霞，顏晶晶

肺癌作為世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國有著較高的發(fā)病率和死亡率，因為多發(fā)生于支氣管黏膜上皮，所以也被稱為支氣管肺癌，其主要因為肺組織細(xì)胞產(chǎn)生不受機(jī)體控制的分裂，然后增殖而導(dǎo)致惡性病變［1-2］。臨床常見的肺癌包括非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）及小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中NSCLC又包括腺癌（glandular cancer，AC）、鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）等，不同類型肺癌治療手段有明顯差別，如果在術(shù)前不能對肺癌分型進(jìn)行準(zhǔn)確評估，那么可能因為選擇不適當(dāng)?shù)氖中g(shù)方式而影響手術(shù)效果，最終難以改善患者預(yù)后，而術(shù)前正確進(jìn)行組織學(xué)分型和分子病理學(xué)分型成為幫助患者獲得有效治療的重要保障［3］。由于肺癌患者肺內(nèi)病灶在影像學(xué)上的表現(xiàn)通常不典型，臨床常通過支氣管鏡獲取活檢組織進(jìn)行分子標(biāo)志物檢測［4］。但普通支氣管鏡活檢僅適用于肺內(nèi)病變即中央型肺癌及部分周圍型肺癌，不能對管腔黏膜內(nèi)明顯腫瘤侵犯的占位性病變及縱隔或淋巴結(jié)腫大患者進(jìn)行完全探查，而經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)具有獨特優(yōu)勢，其探查范圍相對更廣，能對管腔黏膜內(nèi)明顯腫瘤侵犯的占位性病變及縱隔和淋巴結(jié)腫大患者進(jìn)行完全探查［5］，但由于其抽取的標(biāo)本量較少，其病理分型的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步研究證實［6-7］。本研究通過回顧性分析2017年10月至2020年10月在河北醫(yī)科大學(xué)附屬燕達(dá)醫(yī)院、河北中石油中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的180例肺癌患者的臨床資料，探討經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)在肺癌術(shù)前病理分型中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2017年10月至2020年10月在河北醫(yī)科大學(xué)附屬燕達(dá)醫(yī)院、河北中石油中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的肺癌患者180例為研究對象，按照術(shù)后病理組織活檢結(jié)果將其分為AC組（n=82）、SCC組（n=58）及SCLC組（n=40）。三組患者性別、年齡、吸煙率（過去1年內(nèi)吸煙或每天吸煙1支及以上判定為吸煙）、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。所有患者術(shù)前行經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)，為確?；颊唠[私，本研究所有數(shù)據(jù)未泄露給研究以外人員。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)附屬燕達(dá)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

表1 三組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data in the three groups

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）參照《肺癌影像診斷與臨床新進(jìn)展》［8］相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)術(shù)前影像學(xué)檢查及術(shù)后病理組織活檢診斷為AC、SCC或SCLC的患者；（2）年齡45～75歲；（3）TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期，且可行全肺切除術(shù)或肺葉切除術(shù)；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非原發(fā)性肺癌者；（2）合并其他部位腫瘤或呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病者；（3）不可手術(shù)治療者；（4）無法耐受支氣管鏡檢查者；（5）伴有上腔靜脈綜合征或存在出血傾向者。

1.3 經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù) 術(shù)前詢問患者病史，并完善心電圖、胸部影像學(xué)等檢查，入手術(shù)室后行常規(guī)生命體征監(jiān)測，建立靜脈通道后給予靜脈全身麻醉，根據(jù)術(shù)前影像學(xué)檢查顯示的腫大淋巴結(jié)或縱隔腫物進(jìn)行穿刺；在超聲引導(dǎo)下選擇合適路徑對病灶進(jìn)行穿刺，采用22 G穿刺針連同針芯插入內(nèi)徑管道，固定好穿刺針后根據(jù)病灶大小對進(jìn)針長度進(jìn)行調(diào)整，插入后連接負(fù)壓注射器，維持5～15 ml負(fù)壓后反復(fù)抽取細(xì)胞及組織樣本；送檢病理科后將其置于細(xì)胞凍存管中，于液氮中保存待用。ENDOECHO EU-MEI型超聲主機(jī)為Olympus公司生產(chǎn)，BF-UC-260FW型超聲光纖電子支氣管鏡為Olympus公司生產(chǎn)，NA201SX-4022型穿刺吸引活檢針為Olympus公司生產(chǎn)。

1.4 實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測分子標(biāo)志物表達(dá)水平先對凍存的病理組織樣本進(jìn)行提取，使其在室溫下放置5 min至完全溶解，在裂解樣品中加入0.2 ml三氯甲烷，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。檢測的分子標(biāo)志物分別為甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF-1）、Napsin A、細(xì)胞角蛋白5（cytokeratin 5，CK5）、細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、P40、P63、Ki67，采用配套試劑盒，儀器為BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀。使用引物列表對其進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)，TTF-1上游引物為5'-CGTTCTCAGTGTCTGACATCTTGA-3'、下游引物為5'-CCTCCATGCCCACTTTCTTG-3'，Napsin A上游引物為5'-GACAAGCCCATCTTCGTACCTCT-3'、下游引物為5'-TCCACAGACAGAATGGGAAAACC-3'，CK5上游引物為5'-ATCGCCACTTACCGCAAGCTGCTGGAGGG-3'、下游引物為5'-AAACACTGCTTGTGACAAGAGAG-3'，CK7上游引物為5'-GTTCCATTTGCAAAGGCTGT-3'、下游引物為5'-CAGGTGGTTACCCGAAAGA-3'，P40上游引物為5'-GAACGCATTGCCACATAC-3'、下游引物為5'-AGGCACCTGACCCTTGTA-3'，P63上游引物為5'-GGAAAACAATGCCCAGACTC-3'、下游引物為 5'-GCGCGTGGGTCTGTGTTAAG-3'，Ki67上游引物為5'-GCAGGACTTCACTTGCTTCC-3'、下游引物為5'-TCATTTGCGTTTGTTTCACG-3'，內(nèi)參GAPDH上游引物為5'-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3'、下游引物為5'-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGA-3'。

1.5 觀察指標(biāo) （1）比較三組患者分子標(biāo)志物（TTF-1、Napsin A、CK5、CK7、P40、P63、Ki67）表達(dá)水平。（2）以術(shù)后病理組織活檢結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，分析分子標(biāo)志物對AC、SCC及SCLC的診斷價值；術(shù)后病理組織切片經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后采用免疫組化法進(jìn)行染色，染色結(jié)果由染色深度及陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合判斷。其中染色深度評分方法為：無著色記為0分、淡黃色記為1分、棕黃色記為2分、棕褐色記為3分；陽性細(xì)胞百分比評分方法為：陽性細(xì)胞百分比≤10%記為1分，10%＜陽性細(xì)胞百分比≤25%記為2分，25%＜陽性細(xì)胞百分比≤75%記為3分，75%＜陽性細(xì)胞百分比≤100%記為4分。綜合評分=染色深度評分×陽性細(xì)胞百分比評分，最終根據(jù)綜合評分分別劃定為陰性（-）（0分）、陽性（+～+++）（1～12分），采用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照［9］。TTF-1、Napsin A及CK7均為陽性則診斷為AC，CK5、P40及P63均為陽性則診斷為SCC，TTF-1、P40及Ki67均為陽性則診斷為SCLC。所有切片由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師單獨鑒定，儀器為美國貝克曼公司生產(chǎn)的BENCHMARK XT全自動免疫組化機(jī)，單克隆抗體均為配套。（3）記錄患者經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用EpiData 3.1建立數(shù)據(jù)庫，運用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用四格表計算分子標(biāo)志物診斷AC、SCC及SCLC的正確率、靈敏度、特異度；一致性檢驗采用Kappa檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者分子標(biāo)志物表達(dá)水平比較 三組患者TTF-1、Napsin A、CK5、CK7、P40、P63、Ki67表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SCC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達(dá)水平低于AC組，CK5、P40、P63表達(dá)水平高于AC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SCLC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達(dá)水平低于AC組，P40、Ki67表達(dá)水平高于AC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SCLC組患者TTF-1、Ki67表達(dá)水平高于SCC組，CK5、P40、P63表達(dá)水平低于SCC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組患者分子標(biāo)志物表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of molecular marker expression levels in the three groups

表2 三組患者分子標(biāo)志物表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of molecular marker expression levels in the three groups

注：TTF-1=甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1，CK5=細(xì)胞角蛋白5，CK7=細(xì)胞角蛋白7；a表示與AC組比較，P＜0.05；b表示與SCC組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) TTF-1 Napsin A CK5 CK7 P40 P63 Ki67 AC 組 82 1.34±0.37 1.38±0.36 0.74±0.21 1.20±0.21 0.75±0.24 0.87±0.24 0.68±0.24 SCC 組 58 0.58±0.27a 0.74±0.26a 1.41±0.52a 0.74±0.35a 1.38±0.33a 1.39±0.33a 0.79±0.31 SCLC 組 40 1.15±0.37ab 0.81±0.18a 0.69±0.24b 0.81±0.24a 1.24±0.28ab 0.69±0.28b 1.41±0.34ab F值 90.087 95.254 77.482 58.251 96.024 89.263 90.512 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 分子標(biāo)志物對AC的診斷價值 TTF-1、Napsin A及CK7聯(lián)合檢測診斷AC的正確率為0.872，靈敏度為0.866，特異度為0.878，Kappa值為0.743，見表3。

表3 分子標(biāo)志物診斷AC的四格表（例）Table 3 Four-grid table for diagnosing AC by molecular markers

2.3 分子標(biāo)志物對SCC的診斷價值 CK5、P40及P63聯(lián)合檢測診斷SCC的正確率為0.878，靈敏度為0.879，特異度為0.877，Kappa值為0.730，見表4。

表4 分子標(biāo)志物診斷SCC的四格表（例）Table 4 Four-grid table for diagnosing SCC by molecular markers

2.4 分子標(biāo)志物對SCLC的診斷價值 TTF-1、P40及Ki67聯(lián)合檢測診斷SCLC的正確率為0.889，特異度為0.914，靈敏度為0.800，Kappa值為0.859，見表5。

表5 分子標(biāo)志物診斷SCLC的四格表（例）Table 5 Four-grid table for diagnosing SCLC by molecular markers

2.5 并發(fā)癥發(fā)生情況 患者經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)后發(fā)生的并發(fā)癥主要包括氣胸、出血和感染，其發(fā)生率分別為2.2%（4/180）、2.8%（5/180）、8.3%（15/180），總并發(fā)癥發(fā)生率為13.3%（24/180）。氣胸患者給予臥床休息、充分吸氧，肺壓縮程度嚴(yán)重者給予胸腔閉式引流；出血及感染患者給予止血、抗生素治療；經(jīng)治療后患者均恢復(fù)良好。

3 討論

研究表明，合并肺門淋巴結(jié)或縱隔腫大的肺癌患者通常不適合手術(shù)治療，放化療及靶向治療為其主要治療方式，但具體治療方案應(yīng)根據(jù)肺癌組織病理學(xué)類型來選擇，因此術(shù)前選擇合適的標(biāo)本獲取方法進(jìn)行病理分型尤為重要［10-11］。本研究旨在探討經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)在肺癌術(shù)前病理分型中的應(yīng)用價值，以期為臨床提供參考。

本研究結(jié)果顯示，SCC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達(dá)水平低于AC組，CK5、P40、P63表達(dá)水平高于AC組；SCLC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達(dá)水平低于AC組，P40、Ki67表達(dá)水平高于AC組；SCLC組患者TTF-1、Ki67表達(dá)水平高于SCC組，CK5、P40、P63表達(dá)水平低于SCC組；提示經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)取病理組織檢測上述分子標(biāo)志物可能對肺癌病理類型的鑒別有一定價值。TTF-1作為一種調(diào)節(jié)甲狀腺的蛋白，是轉(zhuǎn)錄蛋白NKx2基因家族成員之一，主要分布于人體內(nèi)胚層分化的甲狀腺濾泡上皮和肺泡上皮，其在肺泡上皮來源的細(xì)胞中有較高表達(dá)水平，通常用于鑒別SCC和AC。楊光等［12］研究發(fā)現(xiàn)，P63、TTF-1有助于診斷SCLC，然而其并未采用經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)獲取病理標(biāo)本，因而其獲得的病理指標(biāo)可能存在一定誤差。Napsin A是天冬氨酸的一種蛋白酶，具備蛋白水解酶活性，在Ⅱ型肺上皮細(xì)胞中廣泛分布，可誘導(dǎo)蛋白前體成熟、維持肺的形態(tài)及正常功能，在AC患者中呈陽性表達(dá)。CK7、CK5是一類堿性細(xì)胞角蛋白，作為中間絲蛋白，陽性顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)，其中CK7主要表達(dá)于大部分正常組織的腺上皮和移行上皮中，因而可作為AC分化的標(biāo)志性指標(biāo)，且不會在鱗狀上皮上表達(dá)；CK5為高相對分子質(zhì)量的角蛋白，主要表達(dá)于鱗狀上皮和導(dǎo)管上皮的基底細(xì)胞，臨床多作為SCC的標(biāo)志物［13］。P40、P63在表皮、泌尿道、前列腺等具有鱗狀上皮分化潛在能力的基底細(xì)胞和旁基細(xì)胞中廣泛分布，因而可用于SCC的診斷。既往研究已證實，Ki67抗原表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞增殖活性越高，G1期時Ki67可呈低表達(dá)，G2、M期時其表達(dá)水平達(dá)到峰值，因此能特異性地展示細(xì)胞增殖活性［14］。SCLC的癌細(xì)胞呈淋巴細(xì)胞樣或燕麥細(xì)胞型，人為擠壓癌組織以致細(xì)胞核拉長變形在臨床極為常見，但Ki67卻在擠壓嚴(yán)重的癌組織中仍呈陽性表達(dá)，因而可用于鑒別診斷SCLC。

本研究結(jié)果顯示，TTF-1、Napsin A及CK7聯(lián)合檢測診斷AC的正確率為0.872，靈敏度為0.866，特異度為0.878，Kappa值為0.743；CK5、P40及P63聯(lián)合檢測診斷SCC的正確率為0.878，靈敏度為0.879，特異度為0.877，Kappa值為0.730；TTF-1、P40及Ki67聯(lián)合檢測診斷SCLC的正確率為0.889，特異度為0.914，靈敏度為0.800，Kappa值為0.859；提示經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)對肺癌術(shù)前病理分型具有較高的鑒別診斷價值。同時趙子龍等［15］也在肺癌病理分型的鑒別診斷中證實p63、CK5、CK6、Napsin A及TTF-1抗體可用于AC及SCC的鑒別診斷，本研究結(jié)果與之相似。同時本研究還在p63、CK5、Napsin A、TTF-1的基礎(chǔ)上觀察P40、Ki67鑒別診斷AC、SCC、SCLC的價值，這也是本研究的創(chuàng)新之處。

本研究結(jié)果顯示，患者經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)后發(fā)生的并發(fā)癥主要包括氣胸、出血和感染，總并發(fā)癥發(fā)生率為13.3%（24/180）；經(jīng)治療后患者均恢復(fù)良好；提示經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)有良好的安全性。經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)作為一種安全、簡便、先進(jìn)的支氣管鏡技術(shù)，只需中等程度鎮(zhèn)靜，準(zhǔn)確率較高，其雖然為微創(chuàng)操作，但難免引起出血、氣胸風(fēng)險，因而對術(shù)者操作有較高的要求［16-17］。而且操作過程中也存在因獲取組織量不足而出現(xiàn)漏診的情況，同時本研究并未分析淋巴結(jié)位置、穿刺淋巴結(jié)個數(shù)、組織處理等因素對結(jié)果的影響。另外，本研究由于樣本量較小，所檢測的指標(biāo)可能不具有明顯的代表性，因此還需在后續(xù)研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來驗證本研究結(jié)論。

綜上所述，經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)在肺癌術(shù)前病理分型中有較好的應(yīng)用價值，且安全性良好，值得臨床推廣。其中TTF-1、Napsin A及CK7聯(lián)合檢測可有效診斷AC，CK5、P40及P63聯(lián)合檢測可有效診斷SCC，TTF-1、P40及Ki67聯(lián)合檢測可有效診斷SCLC。

作者貢獻(xiàn)：王妍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，撰寫論文；王妍、石芳、劉俊霞、顏晶晶進(jìn)行研究的實施、資料收集；王妍、石芳進(jìn)行論文的修訂；王妍、顏晶晶負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。