β-蒎烯對人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞的抑制效果

【摘要】 目的 探討松節(jié)油的重要組分β-蒎烯對人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞的抑制作用。方法 2020年10—12月，培養(yǎng)人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)內(nèi)容物不同分為：β-蒎烯組（濃度梯度設(shè)置為0.000、0.315、1.260、5.050、20.160、80.640、322.560 μmol/L）、甲醇組、姜黃素組。細(xì)胞劃痕實驗觀察0、24和48 h后在顯微鏡下細(xì)胞擴(kuò)散情況；采用MTT法檢測經(jīng)過處理24 h和48 h后對細(xì)胞增殖的抑制作用并光鏡下觀察SW872細(xì)胞形態(tài)變化；克隆形成實驗檢測β-蒎烯對SW872細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果 β-蒎烯作用于人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞24 h后，與對照組相比，在100 μg/mlβ-蒎烯的作用下，人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞發(fā)生皺縮、變圓、細(xì)胞間隙增大；1 000 μg/mlβ-蒎烯作用下更為明顯。β-蒎烯組、甲醇組、姜黃素組SW872細(xì)胞遷移能力比較：β-蒎烯組與甲醇組相比24 h和48 h遷移時間延長、遷移能力減弱（Plt;0.05）；與姜黃素組24 h和48 h遷移能力相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。在β-蒎烯對脂肪肉瘤細(xì)胞系SW872增殖的影響中濃度為20.16 μmol/L、80.64 μmol/L和322.56 μmol/L組的β-蒎烯組光密度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；濃度為20.16 μmol/L以上的β-蒎烯組出現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。β-蒎烯10 μg/ml組、100 μg/ml組和1 000 μg/ml組與對照組（0 μg/ml）細(xì)胞克隆比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；β-蒎烯10 μg/ml組與100 μg/ml組細(xì)胞克隆比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。20.16和80.64μmol/Lβ-蒎烯組SW872細(xì)胞分化與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)論 β-蒎烯具有抑制SW872細(xì)胞分化、遷移、增殖的作用。

【關(guān)鍵詞】 脂肪肉瘤；松節(jié)油；β-蒎烯；抗腫瘤

【中圖分類號】 R 738.6 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

Observation of the Inhibitory Effect of β-pinene on Human SW872 Liposarcoma Cells QIAN Xu，ZHOU Ji*，F(xiàn)U Zijie，ZHU Haoxiang，CHEN Kaihua，DONG Yuhong，ZHAO Yifan，LIU Lu，F(xiàn)AGN Guoqiang，GUO Siyan

Changsha Medical University，Changsha 410219，China

*Corresponding author：ZHOU Ji，Lecturer；E-mail：676357605@qq.com

【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of β-pinene，an important component of turpentine oil，on human SW872 liposarcoma cells. Methods Human-derived SW872 liposarcoma cells were cultured，and a control group and β-pinene 0.000，0.315，1.260，5.050，20.160，80.640，322.560μmol/L groups were established. The cell scratch experiment was observed at 0，24，and 48 hours and then the cell proliferation was observed under a microscope；MTT method was used to detect the inhibitory effect on cell proliferation after treatment for 24 h and 48 h，and the morphological changes of SW872 cells were observed under a light microscope；the clone formation experiment was used to detect the effect of β-pinene on the cloning ability of SW872 cells. Results After β-pinene acted on human SW872 liposarcoma cells for 24 hours，compared with the control group，it was found that under the action of 100μg/ml β-pinene，human SW872 liposarcoma cells shrank，rounded，and the intercellular space increased. Large；more obvious under 1 000μg/mlβ-pinene；comparison of SW872 cell migration ability in β-pinene group，methanol group and curcumin group： Compared with the methanol group，the β-pinene group had longer migration time at 24h and 48h，and the migration ability was weakened，which was statistically significant（Plt;0.05）；compared with the curcumin group at 24h and 48h，the migration ability was not statistically significant（Pgt;0.05）. In the effect of β-pinene on the proliferation of liposarcoma cell line SW872，the optical density values of the β-pinene group in the 20.16μmol/L，80.64μmol/L and 322.56μmol/L groups had statistically significant differences（Plt;0.05）；when the β-pinene group at a concentration of 20.16μmol/L or more，cytotoxicity occurs，which leads to cell death. With the increase of β-pinene concentration and time，the effect was significantly enhanced；β- Pinene 10 μg / ml group，100 μg / ml group and 1 000 μg / ml group and control group（0 μg/ml） cell clone，the difference was statistically significant（Plt;0.05）；β- Pinene 10 μg/ml group and 100 μ There was significant difference in cell clone in g/ml group（Plt;0.05）. Compared with the control group，20.16 and 80.64 μmol/L β-pinene group had statistical significance in the differentiation of SW872 cells（Plt;0.05）.Conclusion β-Pinene can inhibit the differentiation，migration and proliferation of SW872 cells.

【Key words】 Liposarcoma；Turpentine oil；β-pinene；Anti-tumor

松節(jié)油是我國重要的天然可再生資源，來源廣泛［1］，具有特殊的生物活性。β-蒎烯作為松節(jié)油的主要組成成分之一，化學(xué)性質(zhì)活潑，具有潛在的研究價值［2］。松節(jié)油在臨床用來治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打腫痛、高血壓、癌癥、水腫及鉤蟲病［3-5］等，近來有文獻(xiàn)顯示松節(jié)油具有抗氧化、清除自由基、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能［6-8］。本研究旨在探討松節(jié)油的重要組分β-蒎烯對人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞的抑制作用，并觀察β-蒎烯對SW872細(xì)胞增殖及分化是否有影響，旨在從細(xì)胞水平探討β-蒎烯防治SW872脂肪肉瘤的可能機(jī)制，為臨床治療脂肪肉瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 2020年10—12月。（1）主要材料：β-蒎烯、姜黃素、胎牛血清、油紅O、吉姆薩染色液、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、氯化鈉注射液、無水乙醇等，均由青島市三凱醫(yī)學(xué)提供；實驗用SW872細(xì)胞株，取自長沙醫(yī)學(xué)院新型藥物制劑湖南省重點(diǎn)實驗室。（2）主要設(shè)備：SIGMA3K15高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；EPS-502分析天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；YT-CJ-1ND超凈工作臺（北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶重光儀器公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人源SW872脂肪肉瘤培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，補(bǔ)充雙抗（青霉素和鏈霉素）至最終體積的0.1%。培養(yǎng)箱條件為37 ℃飽和濕度并含有5%的CO2。培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基隔天換液一次，胰蛋白酶消化、收集并傳代保存。根據(jù)內(nèi)容物加入不同進(jìn)行分組，分別為β-蒎烯組（濃度梯度設(shè)置為0、1.26、5.05、20.16、80.64 μmol/L）、甲醇組、姜黃素組。

1.3 觀察內(nèi)容 （1）光鏡下觀察人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞形態(tài)：將處于對數(shù)生長期的人源SW872細(xì)胞常規(guī)消化、計數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整到1×105/L，并調(diào)整濃度分別為0、100、1 000 μg/ml的β-蒎烯劑量，2 ml每孔接入6孔板中，待24 h后在顯微鏡下觀察，拍照記錄。

（2）人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞劃痕實驗：通過細(xì)胞計數(shù)，在6孔板中加入10萬個細(xì)胞/孔，設(shè)置2個復(fù)孔。在加入細(xì)胞到孔板前，用尺和標(biāo)記筆在孔板底部畫三條橫線，加入細(xì)胞后十字法使細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置待細(xì)胞貼壁后，用黃色的200 μl槍頭畫“井”字。去除原來的培養(yǎng)基，并取1 ml的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）加入孔中，35 ℃顛倒數(shù)次，重復(fù)3次清除雜質(zhì)，最后加入1 ml含1%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基，分別于0、24、48 h后在顯微鏡下觀察β-蒎烯、甲醇和姜黃素組細(xì)胞游走情況，拍照記錄。

（3）人源SW872 脂肪肉瘤細(xì)胞的增殖、生長率檢測：采用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（Methylthiazol tetrazolium bromid，MTT）法進(jìn)行檢測，將SW872細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板，DMEM/F12（3∶1）+10%胎牛血清培養(yǎng)，隔日換液，直到細(xì)胞完全匯合，用無菌PBS沖洗兩次，加入不同濃度β-蒎烯（0.000、0.315、1.260、5.050、20.160、80.640、322.560 μmol/L）作用24、48 h，用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞。

（4）β-蒎烯對SW872細(xì)胞克隆形成的檢測：將處于對數(shù)生長期的人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞消化、離心、計數(shù)，鋪于12孔板中，每孔500個細(xì)胞，500 μl體系（含10%FBS的L-15），2個復(fù)孔。直到細(xì)胞貼壁后，每孔加入濃度分別為：0、10、100、1 000 μg/ml的β-蒎烯，1周后，細(xì)胞對照組出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落，進(jìn)行Giemsa染色，在顯微鏡下觀察，拍照記錄。

（5）人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞的分化情況：將人源SW872脂肪肉瘤細(xì)胞接種于24孔板中，直到細(xì)胞完全匯合后，加入含不同濃度β-蒎烯：0、1.26、5.05、20.16、80.64μmol/L。培養(yǎng)72 h后，對各劑量組細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色（油紅O 0.5 g和50%乙醇100 ml充分混合）。570 nm波長處檢測光密度值，對脂肪肉瘤細(xì)胞系SW872細(xì)胞分化程度進(jìn)行定量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較用成組t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-蒎烯組、甲醇組、姜黃素組SW872細(xì)胞遷移能力比較 β-蒎烯組24 h（65.74±5.21），48 h（57.11±4.19）；甲醇組24 h（46.34±3.73），48 h（38.56±2.55）；姜黃素組24 h（68.53±5.37），48 h（60.32±4.02）。β-蒎烯組與甲醇組相比24 h和48 h遷移時間延長，遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；與姜黃素組24 h和48 h遷移能力相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。見圖1。

2.2 β-蒎烯組不同濃度設(shè)置對SW872細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的影響 β-蒎烯對SW872細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的影響隨濃度增加而越發(fā)明顯。β-蒎烯作用于SW872細(xì)胞24 h后，與細(xì)胞對照組相比，100 μg/mlβ-蒎烯的作用下，SW872細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮、變圓、細(xì)胞間隙逐漸增寬；1 000 μg/mlβ-蒎烯下，SW872細(xì)胞滿視眼變圓、間隙明顯增大，見圖2。

2.3 β-蒎烯組不同濃度設(shè)置對SW872細(xì)胞增殖和生長率的影響 β-蒎烯處理24 h后，隨著時間的延長，低濃度β-蒎烯對細(xì)胞沒有明顯作用；濃度為20.160 μmol/L時，β-蒎烯使細(xì)胞生長速度減緩，細(xì)胞增殖受抑制，濃度為20.160 μmol/L、80.640 μmol/L和322.560 μmol/L組的β-蒎烯組光密度值（570 nm）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.4 β-蒎烯抑制SW872細(xì)胞克隆的形成 對照組平均形成（147.22±8.74）個細(xì)胞克隆，β-蒎烯10 μg/ml組平均形成（57.05±6.19）個細(xì)胞克隆，β-蒎烯100 μg/ml組平均形成（19.22±7.50）個細(xì)胞克隆，β-蒎烯1 000 μg/ml組無SW872細(xì)胞克隆的形成，β-蒎烯10 μg/ml組、100 μg/ml組和1 000 μg/ml組與對照組（0 μg/ml）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；β-蒎烯10 μg/ml組與100 μg/ml組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。見圖3。

2.5 β-蒎烯對SW872細(xì)胞分化的影響 72 h時β-蒎烯組光密度值（OD）：β-蒎烯濃度0.000 μmol/L時（0.060±0.003）、β-蒎烯濃度0.315 μmol/L時（0.055±0.002）、β-蒎烯濃度1.260 μmol/L時（0.053±0.001）、β-蒎烯濃度5.050 μmol/L時（0.051±0.005）、β-蒎烯濃度20.160 μmol/L時（0.045±0.004）、β-蒎烯濃度80.640 μmol/L時（0.037±0.001）、β-蒎烯濃度322.560 μmol/L時（0.028±0.003）。20.16和80.64 μmol/Lβ-蒎烯濃度SW872細(xì)胞分化與0.000 μmol/L時比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。

3 討論

松節(jié)油是由松脂經(jīng)過蒸餾得到的單萜烯類液態(tài)混合物，是一種不可多得的天然產(chǎn)物資源，具有廣泛的應(yīng)用價值［9］。我國的松節(jié)油資源位于世界首列，年產(chǎn)量大于10萬噸。研究表明，松節(jié)油的中的ɑ-蒎烯和β-蒎烯總含量高于90%［10］。甚至β-蒎烯在很多松科屬植物分泌的松脂中含量也極其豐富［11］。β-蒎烯作為松節(jié)油的重要組分，人們對其結(jié)構(gòu)中活潑的官能團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，在多元環(huán)及橋環(huán)、環(huán)外雙鍵等結(jié)構(gòu)上進(jìn)行氧化、異構(gòu)、加成、氫化、聚合等多種反應(yīng)，進(jìn)而得到一系列性能優(yōu)良的產(chǎn)品［12-14］。截至目前β-蒎烯已被廣泛應(yīng)用于用于香料、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、高分子材料等行業(yè)中［15-16］。本研究以我國豐富的可再生資源松節(jié)油的重要組分β-蒎烯為原料探討其對SW872細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果表明在β-蒎烯處理24 h后，隨著時間延長，低濃度β-蒎烯對細(xì)胞沒有明顯作用；當(dāng)濃度為20.160 μmol/L時，β-蒎烯使細(xì)胞生長速度減緩，細(xì)胞增殖受抑制，并隨著β-蒎烯濃度增加，對細(xì)胞生長的抑制作用增強(qiáng)。

脂肪肉瘤是起源于脂肪細(xì)胞和向脂肪細(xì)胞分化的不同階段的間葉細(xì)胞的一種惡性腫瘤，發(fā)病率占軟組織惡性腫瘤的第2位或第3位［17］。這其中有10%～36%［18］原發(fā)于腹膜后腔，最可能的原因是腹膜后腔存在潛在的巨大腔隙，即給脂肪肉瘤足夠的生長空間又無明顯的臨床表現(xiàn)，所以常耽誤了就診時機(jī)［19］。此外，腫瘤巨大，直接侵犯周圍的組織，提升了手術(shù)難度和病灶的殘留，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤短期復(fù)發(fā)和術(shù)后生存期的縮短［20-21］。本研究為探討松節(jié)油的主要組成成分β-蒎烯在脂肪肉瘤細(xì)胞增殖、生長率的影響，采用SW872細(xì)胞作為對象，消除種屬差異，觀察β-蒎烯對其增殖分化的影響。結(jié)果表明β-蒎烯處理24 h后，隨著時間的延長，低濃度β-蒎烯對細(xì)胞沒有明顯作用；濃度為20.160 μmol/L時，β-蒎烯使細(xì)胞生長速度減緩，細(xì)胞增殖受抑制。此外，脂肪肉瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)率較高，而輔助治療在控制復(fù)發(fā)和改善預(yù)后等方面的功效目前還完善，尚需要大樣本的臨床實驗結(jié)果來驗證其功效。

綜上，β-蒎烯對SW872細(xì)胞的生長、增殖和分化功能具有抑制作用。因此，利用不同濃度的β-蒎烯調(diào)控脂肪細(xì)胞的生長、增殖，對脂肪肉瘤的臨床治療極具開發(fā)前景，可為防治脂肪肉瘤提供新的思路。

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（本文編輯：崔莎）