多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中RAD18的表達(dá)及其與放射抵抗的關(guān)系

【摘要】 目的 探究多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中RAD18的表達(dá)及其與放射抵抗的關(guān)系。方法 選取2019年8月至2020年8月收治的50例放射治療后復(fù)發(fā)及50例放射治療后未復(fù)發(fā)的多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者作為研究對象，將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（A172）分別轉(zhuǎn)染空白和裝有RAD18的質(zhì)粒載體，應(yīng)用克隆實驗檢測經(jīng)相同劑量射線照射后兩組細(xì)胞增殖情況，對放射治療后復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中RAD18 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，探討RAD18與多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗的相關(guān)性。結(jié)果 在RAD18蛋白表達(dá)上，A172與正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞（NHAs）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；在轉(zhuǎn)染后的RAD18蛋白表達(dá)上，轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172比轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體高（Plt;0.05）；在γ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量上，轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172比轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體RAD18多（Plt;0.05）；復(fù)發(fā)性多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的RAD18蛋白表達(dá)比原發(fā)性多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤高（Plt;0.05）；RAD18與多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗呈正相關(guān)（r=0.608，Plt;0.05）。結(jié)論 對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤采取放射治療時會導(dǎo)致DNA損傷，增加RAD18表達(dá)，導(dǎo)致DNA的修復(fù)能力得到極大提升，進(jìn)而引起患者放射抵抗，因此臨床在放射治療過程中對RAD18進(jìn)行抑制，能提升治療效果。

【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；放射療法；影像引導(dǎo)；RAD18；放射抵抗；復(fù)發(fā)

【中圖分類號】 R 730.264 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

The Expression of RAD18 in Glioblastoma Multiforme and Its Relationship with Radioresistance WANG Zhihan，ZENG Hongjun*

Shanghai Pudong Hospital，Shanghai 201300，China

*Corresponding author：ZENG Hongjun，Associate chief superintendent nurse；E-mail：lcxsjo@126.com

【Abstract】 Objective To explore the expression of RAD18 in glioblastoma multiforme and its relationship with radioresistance. Methods Selected 50 patients with recurrence after radiotherapy and 50 patients with glioblastoma who did not relapse after radiotherapy received from August 2019 to August 2020 as the research objects，and the human glioma cell line（A172）. The blank and plasmid vectors containing RAD18 were transfected respectively，and the cell proliferation of the two groups after irradiation with the same dose of radiation was detected by cloning experiment，and the expression of RAD18 mRNA in the samples of recurrent glioblastoma multiforme after radiotherapy was detected. To explore the correlation between RAD18 and radioresistance of glioblastoma multiforme. Results In the expression of RAD18 protein，the difference between A172 and normal human astrocytes（NHAs） was not statistically significant（Pgt;0.05）；in terms of the expression of RAD18 protein after transfection，the ratio of A172 transfected with RAD18 plasmid was Transfection blank plasmid vector is high（Plt;0.05）；after γ-ray irradiation，the number of cell clones formed is more transfected with RAD18 plasmid A172 than transfected blank plasmid vector RAD18（Plt;0.05）；recurrent polymorphic gel the expression of RAD18 protein in glioblastoma was higher than that in primary glioblastoma multiforme （Plt;0.05）；RAD18 was positively correlated with radioresistance of glioblastoma multiforme（r=0.608，Plt;0.05）. Conclusion Radiation therapy for glioblastoma multiforme can cause DNA damage and increase the expression of RAD18，which leads to a greatly improved DNA repair ability，which in turn causes radiation resistance in patients. Therefore，RAD18 is inhibited during the clinical radiotherapy.Can enhance the therapeutic effect.

【Key words】 Glioblastoma；Radiotherapy，image-guided；RAD18；Radiation resistance；Recurrence

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤又稱多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，屬WHO Ⅳ級，是惡性程度最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，預(yù)后差，確診后即使給予正規(guī)的治療（包括手術(shù)、放化療等），絕大多數(shù)患者的生存期仍少于1年，主要臨床表現(xiàn)為顱高壓癥狀（頭痛、惡心、嘔吐）及神經(jīng)功能異常（癲癇、運動及感覺功能障礙）［1］。目前國際通行的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為Stupp方案——即最大限度保護腦功能的前提下最大范圍手術(shù)切除腫瘤，隨后同步進(jìn)行替莫唑胺（temozolomide，TMZ）放療及后續(xù)的TMZ化療，但未取得滿意的臨床治療效果。放射治療技術(shù)近年來進(jìn)展很大，適性調(diào)強放射治療、圖像引導(dǎo)放射治療及最新的螺旋斷層放射治療系統(tǒng)等精確放療技術(shù)的應(yīng)用，在保證了腦內(nèi)重要器官照射劑量的同時，對術(shù)后瘤床區(qū)域達(dá)到放射治療劑量，從而提高了局部的控制率［2］。但即使如此，高復(fù)發(fā)率問題仍然無法有效避免，臨床還是有相當(dāng)一部分患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，臨床已經(jīng)證實其復(fù)發(fā)的原因與放射抵抗有關(guān)［3］。故本研究將2019年8月至2020年8月收治的50例放射治療后復(fù)發(fā)及50例放射治療后未復(fù)發(fā)的多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者作為研究對象，探討RAD18與多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗的相關(guān)性，報道結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月至2020年8月上海市浦東醫(yī)院收治的50例放射治療后復(fù)發(fā)及50例放射治療后未復(fù)發(fā)的多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者作為研究對象，本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)［批號：2019年審（22）號］，患者均簽署知情同意書。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），見表1。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者意識清晰，無意識障礙；（2）病歷資料完整，中途未退出者；（3）患者均經(jīng)過臨床診斷及檢查確診為多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，經(jīng)影像學(xué)檢查及手術(shù)證實是否復(fù)發(fā)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有不同程度認(rèn)知障礙者；（2）近期急性、慢性感染者；（3）聽力障礙或者無法交流者；（4）預(yù)計生存期lt;3個月者。

1.2 方法

1.2.1 正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞及人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司提供）中放置A172（上?；鄯f生物科技有限公司提供）細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)液中含有的1%青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司提供）、10%胎牛血清（上海雙洳生物科技有限公司提供）。將NHAs置于含重組人表皮生長因子（深圳市華生元基因工程發(fā)展有限公司提供）、氨基酸（金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠提供）、左旋谷氨酰胺（上海和序生物科技有限公司提供）、5%胎牛血清、胰島素（四環(huán)藥業(yè)股份有限公司提供）及GA-1000的培養(yǎng)基（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司提供）中孵育。

1.2.2 Western blot檢測NHAs及A172中RAD18蛋白質(zhì)表達(dá) 分別收集正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用冰磷酸鹽（PBS，北京Solarbio生物科技有限公司）對其漂洗2次，加入美國CellSignaling公司生產(chǎn)的RIPA裂解液后于5 min冰上靜置。展開超聲破碎細(xì)胞，隨后將其離心30 min，應(yīng)用Bradford試劑盒（北京天根生化科技提供）對RAD18蛋白濃度進(jìn)行檢測，電泳后將膠轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美國Thermo Scientific公司提供）膜上。膜上加入1：250稀釋的上?，庬嵣锟萍加邢薰咎峁┑氖罂谷薘AD18一抗，洗膜將艾美捷科技有限公司提供的經(jīng)1：1 000稀釋的羊抗鼠Ig G二抗加入其中，再次孵育，觀察信號時使用增強化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。

1.2.3 A172細(xì)胞系轉(zhuǎn)染及細(xì)胞克隆實驗 （1）參照Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，用EDTA將空白質(zhì)粒載體A172細(xì)胞及A172細(xì)胞系轉(zhuǎn)染裝有RAD18的質(zhì)粒載體消化成細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中孵育，當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時，加入4 μg預(yù)裝AD18的美國Addgene公司提供的pc DNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞。對其進(jìn)行孵育48 h，在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中加入美國Sigma公司提供的新霉素衍生物Geneticin（G418）600 μg/ml。孵育4周后，對有抗性的細(xì)胞進(jìn)行篩選。用Western blot檢測兩組RAD18變化。（2）以1×103/孔的密度將已轉(zhuǎn)染裝有空白質(zhì)粒載體的A172及RAD18質(zhì)粒載體細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，對其進(jìn)行2 Gyγ射線照射。放入培養(yǎng)基中孵育10～14 d，每3 d更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)克隆出現(xiàn)時，終止孵育?？寺〉臉?biāo)準(zhǔn)為超過50個的孤立細(xì)胞群，計算克隆形成數(shù)量，滴入結(jié)晶紫染色。

1.2.4 qRT-PCR對比原發(fā)及復(fù)發(fā)GBM標(biāo)本中RAD18 mRNA的表達(dá)情況 采用試劑盒提取組織標(biāo)本中的總RNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行?？俁NA應(yīng)用隨機引物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化成c DNA。PCR擴增條件：95 ℃溫度下預(yù)變性3 min，然后于95 ℃變性10 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，一共進(jìn)行40個循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo) 嚴(yán)格按照試劑盒說明書，對原發(fā)性及復(fù)發(fā)多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中的RAD18 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行實時熒光定量對比，總RNA采用試劑盒提取。RAD18引物序列：下游引物5'－TTACTGAGGTCATATTATCTTC－3'，上游引物5'－TTCACAAAAGGAAGCCGCTG－3'。內(nèi)參GAPDH的引物序列：下游引物5'－GAAGATG-GTGATGGGATTTC－3'，上游引物5'－GAAGGT－GAAGGTCGGAGTC－3'。利用2－△△CT計算分析，以GAPDH的表達(dá)量為內(nèi)參，對基因表達(dá)水平變化進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗，RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗采用相關(guān)分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAD18在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 應(yīng)用Western blot方法檢測RAD18蛋白顯示，A172細(xì)胞系中RAD18蛋白表達(dá)（0.17±0.01）與NHAs（0.18±0.01）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒或空白對照質(zhì)粒載體的A172細(xì)胞系中RAD18蛋白的表達(dá) 經(jīng)轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172細(xì)胞的RAD18蛋白表達(dá)（0.93±0.10）高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體組的RAD18蛋白表達(dá)（0.20±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖2。

2.3 A172、NHAs的RAD18蛋白表達(dá)水平 A172在RAD18蛋白表達(dá)（0.17±0.01）與NHAs（0.18±0.02）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.162，P=0.002）。

2.4 轉(zhuǎn)染后RAD18蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172（0.89±0.08）比轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體RAD18蛋白表達(dá)（0.24±0.02）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=55.737，P=0.001）。

2.5 γ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量 在γ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量上，轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172（155.39±15.24）比轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體RAD18（55.63±5.57）多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=43.474，P=0.001）。

2.6 復(fù)發(fā)性與原發(fā)性蛋白表達(dá) 復(fù)發(fā)性多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的RAD18蛋白表達(dá)（13.79±1.56）比原發(fā)性多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（7.28±0.73）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=26.727，P=0.001）。

2.7 RAD18與多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗的相關(guān)性 RAD18與多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗呈正相關(guān)（r=0.608，Plt;0.05）。

3 討論

多行性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為高級別膠質(zhì)瘤，來源于神經(jīng)上皮組織，是一種高度惡性、浸潤性、異質(zhì)性和致命性的腦內(nèi)腫瘤，在腦內(nèi)腫瘤中發(fā)病率高達(dá)30%，超過50%的表現(xiàn)為WHO4級（多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤），該病治療效果差、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差，平均生存期18個月。臨床可表現(xiàn)為頭痛、抽搐及精神癥狀等［4-5］。

多行性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤好發(fā)于額葉、顳葉白質(zhì)及大腦深部，其生長方式為沿白質(zhì)纖維、腦膜等浸潤性或中央膨脹性生長、周圍浸潤性生長，由于血-腦脊液屏障破壞，血漿中的水及大分子物質(zhì)從血管中溢出，因此常伴有瘤周水腫；其病理特點為瘤組織內(nèi)見到明顯壞死灶，周圍瘤細(xì)胞呈柵欄狀排列，瘤細(xì)胞呈多形性［6-7］。放療是治療多行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的必要手段，放射治療的靶標(biāo)是腫瘤細(xì)胞的DNA分子，可殺滅殘存的腫瘤細(xì)胞及臨床亞腫瘤病灶、提高局部控制率和生存

率［8-9］。手術(shù)即使做到影像學(xué)上的全切除，生物學(xué)上仍有殘存的腫瘤細(xì)胞，因此多行性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤必須輔以放療［10］。鄭忠濤等［11］回顧性分析了年齡大于70歲的老年多行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的臨床資料，結(jié)果顯示，接受術(shù)后放療患者的中位生存期為8個月，而僅接受放療患者的中位生存期為４個月，可見術(shù)后放療可明顯延長患者的生存期。但放射治療仍有復(fù)發(fā)情況，DNA損傷后的修復(fù)能力與腫瘤細(xì)胞對放射治療的有效性密切相關(guān)，復(fù)發(fā)的原因與腫瘤細(xì)胞對放射治療產(chǎn)生抵抗性有關(guān)。RAD18是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，在直腸癌、黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤等多個惡性腫瘤中表達(dá)增加，具有泛素連接酶E3特有的典型RING結(jié)構(gòu)［12-13］。為弄清RAD18與放射抵抗之間的關(guān)系，本次研究特選取與正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量相近的A172細(xì)胞系。為了使細(xì)胞增殖能力明顯高于普通的A172細(xì)胞，本次實驗通過轉(zhuǎn)染的方式提升其表達(dá)水平，隨后進(jìn)行同等劑量照射，以此來證明腦膠質(zhì)瘤對放射治療的抵抗性與RAD18表達(dá)水平有關(guān)［14-15］。本研究顯示，A172在蛋白表達(dá)上與NHAs無明顯差異（Pgt;0.05）；轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172顯著比轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體RAD18蛋白表達(dá)高（Plt;0.05）；在γ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量上，轉(zhuǎn)染裝有RAD18質(zhì)粒的A172顯著比轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒載體RAD18多（Plt;0.05）；復(fù)發(fā)性多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的RAD18蛋白表達(dá)顯著比原發(fā)性多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤高（Plt;0.05）；RAD18與多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗呈正相關(guān)（Plt;0.05）；復(fù)發(fā)性多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的RAD18 mRNA表達(dá)量顯著高于原發(fā)性，其原因可能在于放射治療不可避免引起DNA損傷，當(dāng)患者進(jìn)行放射治療時，RAD18與泛素結(jié)合酶RAD6結(jié)合形成二聚體，會對損傷起到修復(fù)作用，促使增殖細(xì)胞核抗原發(fā)生單泛素化，導(dǎo)致DNA的修復(fù)能力得到極大提升，減少了腫瘤細(xì)胞凋亡，這也是實驗結(jié)果顯示RAD18升高的原因，在此情況下，會導(dǎo)致多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者產(chǎn)生放射抵抗，因此，若以RAD18為靶點，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制RAD18表達(dá)，可能會增強放療的效果。

綜上所述，對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤采取放射治療時會導(dǎo)致DNA損傷，增加RAD18表達(dá)，導(dǎo)致DNA的修復(fù)能力得到極大提升，進(jìn)而引起患者放射抵抗，因此臨床在放射治療過程中對RAD18進(jìn)行抑制，能提升治療效果。

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（本文編輯：崔莎）