茯苓水提物對(duì)環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環(huán)境的影響

【摘要】 目的 探討茯苓水提物對(duì)環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環(huán)境的影響。方法 2020年5月將40只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和茯苓水提物低、中、高劑量組，各8只?？瞻捉M不予造模，其余各組均建立環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠模型，從造模當(dāng)日起，空白組和模型組均采用等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃；茯苓水提物低、中、高劑量組灌胃劑量分別為15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg；連續(xù)灌胃28 d。觀察小鼠脾臟、胸腺指數(shù)、脾臟NK細(xì)胞及CD4+、CD8+細(xì)胞比例、NK細(xì)胞活性。結(jié)果 與空白組比較，造模組小鼠胸腺指數(shù)降低、脾臟指數(shù)升高（Plt;0.05）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)升高，脾臟指數(shù)降低（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟NK細(xì)胞比例降低（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟NK細(xì)胞比例均增加（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟CD4+細(xì)胞比例降低、CD8+細(xì)胞比例升高（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟CD4+細(xì)胞比例升高、CD8+細(xì)胞比例降低（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠NK細(xì)胞活性降低（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性均增加（Plt;0.05）。結(jié)論 茯苓水提物改善環(huán)磷酰胺引起的毒副作用，可能是通過增加脾臟NK、CD4+、CD8+細(xì)胞比例及增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性發(fā)揮免疫調(diào)控作用。

【關(guān)鍵詞】 腫瘤；茯苓；環(huán)磷酰胺；免疫功能；小鼠

【中圖分類號(hào)】 R 739.9 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

Effect of Poria Cocos Water Extract on Immune Microenvironment of Cyclophosphamide Tumor Bearing Mice DENG Peng，XU Ri，LIU Yanwei，HU Fang，LIU Zhongyong*

Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China

*Corresponding author：LIU Zhongyong，Professor，Chief physician，Doctoral supervisor；E-mail：Lzyonggmail@163.com

【Abstract】 Objective To investigate the effect of Poria cocos water extract on immune microenvironment of cyclophosphamide tumor bearing mice. Methods In May 2020，40 mice were randomly divided into blank group，model group and low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract，with 8 mice in each group. No model was made in the blank group，and cyclophosphamide tumor bearing mouse models were established in other groups. From the day of modeling，the blank group and model group were perfused with equal volume of 0.9% sodium chloride solution；The intragastric doses of Poria cocos water extract in low，medium and high dose groups were 15 mg / kg，30 mg / kg and 60 mg / kg respectively；Continuous gavage for 28 days. The indexes of spleen and thymus，the proportion of spleen NK cells and CD4+，CD8+ cells，and the activity of NK cells were observed. Results Compared with the blank group，the thymus index decreased and the spleen index increased in the model group（Plt;0.05）；Compared with the model group，the thymus index increased and the spleen index decreased in the low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract （Plt;0.05）. Compared with the blank group，the proportion of spleen NK cells in the model mice decreased （Plt;0.01）；Compared with the model group，the proportion of spleen NK cells in low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract increased（Plt;0.05）. Compared with the blank group，the proportion of CD4+ and CD8+ cells in spleen of model mice decreased（Plt;0.01）；Compared with the model group，the proportion of CD4+ and CD8+ cells in spleen of mice in low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract increased（Plt;0.05）. Compared with the blank group，the activity of NK cells in the model mice decreased（Plt;0.01）；Compared with the model group，the activity of NK cells in low，medium and high dose groups of Poria cocos water extract increased（Plt;0.05）. Conclusion Poria cocos water extract can improve the toxic and side effects caused by cyclophosphamide，which may play an immune regulatory role by increasing the proportion of spleen NK，CD4+，CD8+ cells and enhancing the activity of NK cells.

【Key words】 Neoplasms；Poria；Cyclophosphamide；Immunity；Mice

肺癌屬于西醫(yī)學(xué)病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及特征歸于“咳嗽”“肺壅”“肺巖”等范疇。肺癌是由全身氣血陰陽失調(diào)導(dǎo)致的，病性屬于本虛標(biāo)實(shí)，病位在肺，與脾相關(guān)，以正虛為本。茯苓又稱“茯菟”，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為“九大仙草”“四君八珍”之一，久服可安魂養(yǎng)神、益壽延年，具有很強(qiáng)的滋補(bǔ)功效?！队盟幮姆ā分杏涊d“茯苓，淡能利竅，甘以助陽......味甘平補(bǔ)陽，益脾逐水，生津?qū)狻?。茯苓具有延緩衰老、抗炎、利尿、保肝、促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、增強(qiáng)免疫等功效［1］，多應(yīng)用于養(yǎng)生保健藥膳及補(bǔ)品中。本研究探討了茯苓水提物對(duì)環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2020年5月選取SPF級(jí)5周齡C57BL/6N近交系雄性小鼠40只（購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為：20170011007017），體質(zhì)量18～20 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，室溫（20±2）℃、濕度50%～70%、每12 h進(jìn)行照明/黑暗交替。

1.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液（HyClone，Cat SH30027.01），YAC-1（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），F(xiàn)ITC anti-mouse CD4抗體（Biolegend，Cat 100406），PE anti-mouse CD3抗體（Biolegend，Cat 100206），PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8抗體（Biolegend，Cat 100734），APC anti-mouse NKp46抗體（Biolegend，Cat 137608），紅細(xì)胞裂解液（Biolegend，Cat 420301），Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit I（BD Pharmingen，Cat 556547），環(huán)磷酰胺（上海櫻木生物科技有限公司，批號(hào)：#23580），恒溫水浴鍋（意大利萊卡公司），生物安全柜（Thermo Fisher Scientific），漩渦混合器（SI儀器公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific），流式細(xì)胞儀（Beckman），臺(tái)式多功能冷凍離心機(jī)（Eppendorf）。

1.3 茯苓水提物制備 稱取茯苓200 g，用10倍體積水浸泡1 h后煎煮1 h，過濾，藥渣加8倍量水煮1 h，過濾，合并兩次濾液，旋蒸濃縮至200 ml藥液，相當(dāng)于原藥材1 g/ml。茯苓水提物低、中、高劑量組為分別含生藥量15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的藥液。

1.4 llc細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 將llc細(xì)胞放入37 ℃水浴鍋內(nèi)快融后，轉(zhuǎn)移至裝有5 ml的DMEM完全培養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）的15 ml離心管中，離心后，重懸混勻后放入培養(yǎng)箱中，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞密度80%左右時(shí)，用胰酶消化、傳代。

1.5 模型建立及分組 C57BL/6N小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組，模型組，茯苓水提物低、中、高劑量組，其中空白組不予造模，其余各組均予造模。環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠模型制備：llc消化、傳代后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×105/ml，使用呼吸麻醉機(jī)將小鼠麻醉后，將小鼠背部右側(cè)肩胛骨處的毛發(fā)使用剃毛器剃去，取100 μl混勻的調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，注射于小鼠背部右側(cè)肩胛骨處皮下。并從荷瘤模型建立的第22天開始，連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg·kg-1·d-1。

1.6 給藥方式 從造模當(dāng)日起，空白組和模型組均采用等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃；茯苓水提物低、中、高劑量組，灌胃劑量分別為15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg；連續(xù)灌胃28 d。最后一次灌胃24 h后小鼠稱重，并于安樂死后取脾、胸腺備用。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.7.1 脾臟、胸腺指數(shù)測(cè)定 取材前測(cè)量小鼠的體質(zhì)量，采用無菌剪刀和鑷子在小鼠安樂死后，取脾臟和胸腺并稱重。脾臟、胸腺指數(shù)=脾、胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.7.2 脾臟NK、CD4+、CD8+細(xì)胞比例測(cè)定 取出脾臟置于200目濾網(wǎng)上研磨后，4℃，250×g，離心5 min，棄上清。裂紅后，離心棄上清，重懸，取4×106個(gè)細(xì)胞后，加入50 μl含1% FBS的PBS及1 μl anti-CD3抗體和2μl anti-NKp46抗體；以及1μl anti-CD3抗體、1μl anti-CD4抗體和2μl anti-CD8抗體，混勻。置于4℃孵育30 min后，加入800 μl含1% FBS的PBS溶液洗滌離心，洗滌2～3次。棄上清，加入200 μl含1% FBS的PBS重懸細(xì)胞，上流式機(jī)檢測(cè)。

1.7.3 NK細(xì)胞活性測(cè)定 取出脾臟置于200目濾網(wǎng)上研磨，4℃，250×g，離心5 min，棄上清。裂紅后，離心，脾細(xì)胞：Yac-1細(xì)胞為10：1，將計(jì)數(shù)后將細(xì)胞分別加于96孔板中，放入培養(yǎng)箱共培養(yǎng)3 h，取出，24℃，250×g，離心5 min。除去上清，加入稀釋后的1X的binding buffer，annexin V 3 μl/只，碘化丙啶PI 4 μl/只，混勻，置于24℃孵育20 min后，加入500 μl配置好的1X的binding buffer洗滌3次，離心棄上清，加入150 μl的配置好的1X的binding buffer后混勻，上流式機(jī)檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脾臟、胸腺指數(shù) 五組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠胸腺指數(shù)降低、脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)升高，脾臟指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 脾臟NK細(xì)胞比例 五組脾臟NK細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟NK細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟NK細(xì)胞比例均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。

2.3 脾臟CD4、CD8陽性細(xì)胞比例 五組脾臟CD4、CD8陽性細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠脾臟CD4+細(xì)胞比例降低、CD8+細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠脾臟CD4+細(xì)胞比例升高、CD8+細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表3。

2.4 NK細(xì)胞活性 五組NK細(xì)胞活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。與空白組比較，造模組小鼠NK細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；與造模組比較，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表4。

3 討論

對(duì)于腫瘤的病機(jī)的認(rèn)識(shí)，自古就有“正虛”之說，“正虛致瘤”的理論也得到了諸多現(xiàn)代醫(yī)家的肯定，腫瘤的治療當(dāng)以“扶正”為首要目的。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來說，“正氣”可理解為機(jī)體的免疫功能，“正氣”虛，則機(jī)體免疫功能異?；虻拖隆，F(xiàn)代研究表明茯苓具有多種有效成分如三萜［2-3］、多糖［4-7］、甾體［8-9］、揮發(fā)油［10］、蛋白質(zhì)和氨基酸［11］等，具有延緩衰老、抗炎、利尿、保肝、促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、增強(qiáng)免疫等［1］作用。

本研究探討茯苓水提物對(duì)環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠免疫微環(huán)境的影響，結(jié)果表明不同劑量的茯苓水提物均可不同程度的改善環(huán)磷酰胺荷瘤模型造成的小鼠免疫器官損傷。

NK細(xì)胞是機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁，參與了腫瘤免疫監(jiān)視和維持免疫穩(wěn)態(tài)的過程，在腫瘤的免疫應(yīng)答中具有關(guān)鍵作用。CD4+T淋巴細(xì)胞即輔助性T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在抗病毒及腫瘤殺傷中發(fā)揮重要作用。茯苓水提物可增加環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠脾臟的NK、CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例，并增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性。

綜上所述，茯苓水提物可提高環(huán)磷酰胺荷瘤小鼠的免疫功能，然而對(duì)于其具體作用機(jī)制需要更深入研究。

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（本文編輯：崔莎）