2020年ATC腎移植相關(guān)基礎與轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究國際前沿熱點

何健楠 孫啟全

2020年美國移植年會（American Transplant Congress，ATC）于2020年5月30日至6月1日以線上會議形式舉行，主題為“明天的科學始于今天”（The Science of Tomorrow Starts Today）。本次會議內(nèi)容豐富，涉及移植相關(guān)的各個領(lǐng)域，重磅報道眾多，展示了移植臨床、基礎研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學的新思路、新技術(shù)與新進展。本文摘取了本次會議中腎移植相關(guān)的重點報道，就其中基礎與轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究的國際前沿熱點和新進展作一綜述。

1 免疫記憶

免疫記憶被認為是適應性免疫的一種特征，在免疫反應中，初始T細胞和B細胞轉(zhuǎn)化為記憶表型，為機體提供長期的保護。記憶性細胞在保護性免疫中不可或缺，但在移植中卻是一個獨特的挑戰(zhàn)。一方面，記憶性細胞能夠抵御病原體入侵，降低機體感染的風險；而另一方面，供體反應性的記憶性細胞會影響移植物的存活，并導致移植物丟失。記憶性細胞的兩面性在移植物存活管理中形成了治療的難點。隨著研究的深入，人們對記憶性細胞的認識正在不斷演變。

1.1 組織定居型記憶性T細胞

記憶性細胞雖然是由血液循環(huán)中的初始細胞和效應性細胞分化形成，但部分細胞在局部組織中成熟后可駐留在局部，成為定居型細胞，其位置和功能受局部特定環(huán)境調(diào)節(jié)。因此，對移植物局部的記憶性細胞進行探索和處理，將能避免全身性消除記憶性細胞所帶來的風險。組織定居型記憶性T細胞（tissue resident memory T cell，TRM）在功能、轉(zhuǎn)錄和表型上都不同于循環(huán)效應性T細胞和中央記憶性T細胞?，F(xiàn)在普遍認為TRM在局部組織中起到了重要的免疫監(jiān)視和應對感染的作用[1-2]。而TRM在移植中的作用尚不清楚。

美國匹茲堡大學Abou-Daya等[3]利用小鼠腎移植模型，探索了TRM在移植中的作用。研究者首先將同基因B6小鼠和異基因（B6×Balb/c）F1.ova小鼠的腎臟分別移植給B6受體小鼠，第2 日予輸注100萬的OT-I效應性T細胞。移植術(shù)后測定血清肌酐的變化，在第4周和第8周取移植物、血液、骨髓等組織進行分析。剔除帶有體內(nèi)標記的T細胞后，TRM的表型確定為CD44highCD62LlowCD69+CD103+/-細胞。結(jié)果顯示，異基因組小鼠的平均血清肌酐水平高于同基因組，異基因組移植物的組織學表現(xiàn)為急性和慢性混合性排斥反應。流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)上述表型的TRM存在于OT-I效應性T細胞和內(nèi)源性T細胞中。

為了進一步證明TRM的定居特性，研究者將移植術(shù)后4周的CD45.1 B6小鼠（含OT-I效應性T細胞）和接受了F1.ova供腎的CD45.2 B6小鼠（不含OT-I效應性T細胞）進行聯(lián)體共生實驗（通過聯(lián)體手術(shù)使得兩只小鼠形成血液、體液交互）。然而OT-I效應性T細胞在共生鼠的移植腎和血液循環(huán)中均未檢測到，說明TRM確實只是定居在移植物中而不會進入血液循環(huán)。

最后，為驗證TRM是否足以引起排斥反應，研究者在再次移植模型中，使用切除脾臟的LTBR-/-小鼠作為含有TRM的F1.ova腎臟的二級受體。為了進一步確定定居型OT-I效應性T細胞（TRM）和排斥反應之間的因果關(guān)系，實驗組在移植術(shù)后第4周使用Thy1.1單克隆抗體將OT-I效應性T細胞耗盡，其排斥反應明顯弱于未使用Thy1.1單克隆抗體組。這項研究說明了供體特異性的TRM具有效應功能，而且在排斥反應中發(fā)揮了重要作用。

1.2 記憶性細胞的調(diào)節(jié)功能及抑制性受體

記憶性細胞并非任何時候都持續(xù)執(zhí)行其記憶功能，在某些移植模型中，研究者發(fā)現(xiàn)記憶性細胞中的亞群顯示出調(diào)節(jié)性細胞的功能，促進了移植物的生存，這與其本來定義的功能恰恰相反[4-5]。由此說明，記憶性細胞的功能并不是單向的，其在不同條件下會發(fā)生改變。為了尋找移植術(shù)后調(diào)控記憶性T細胞功能的新途徑，美國埃默里大學Morris等[6]對傾向于免疫耐受及傾向于免疫排斥的兩組CD8+記憶性T細胞群體進行了高維免疫表型分析。FcγRⅡB是一種抑制性IgG受體，既往認為FcγRⅡB僅表達于B細胞和初始免疫細胞表面。研究者發(fā)現(xiàn)在同種免疫反應過程中，F(xiàn)cγRⅡB亦可表達于CD44highCD8+記憶性T細胞表面。FcγRⅡB在CD8+記憶性T細胞上的表達水平與皮膚移植動物模型中的受體中位存活時間呈正相關(guān)，且與共刺激阻斷治療相關(guān)。與野生型小鼠相比，當敲除移植物CD8+記憶性T細胞的FcγRⅡB基因后，即使給予共刺激阻斷治療，皮膚移植小鼠仍出現(xiàn)加速性排斥反應。該研究表明，在異基因免疫應答過程中，F(xiàn)cγRⅡB是CD8+記憶性T細胞免疫應答的負調(diào)節(jié)因子，提示針對該通路的靶向治療可改善致敏個體的移植結(jié)局。

1.3 天然免疫細胞的記憶功能

已有研究表明某些類型的先天性免疫細胞，如自然殺傷（natural killer，NK）細胞和巨噬細胞，也可獲得記憶特性，從而強化免疫記憶反應[7-8]。最近的一項研究中，Dai等[9]報道了一個顛覆性的發(fā)現(xiàn)——天然免疫細胞具有抗原特異性記憶功能。研究者發(fā)現(xiàn)小鼠單核細胞和巨噬細胞獲得了針對主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ抗原的特異性記憶反應，并明確A型配對免疫球蛋白樣受體（paired immunoglobulin-like receptor A，PIR-A）是記憶反應所必需的。敲除受體體內(nèi)的PIR-A或阻斷PIR-A與供體MHCⅠ結(jié)合，均可阻斷記憶反應，并減弱腎移植和心臟移植的排斥反應。因此，先天性免疫細胞的同種異體抗原特異性記憶反應將是進一步改善移植物存活的重要靶點。

2 排斥反應和免疫耐受

2.1 CD11b與CD154的相互作用

T細胞針對外來抗原產(chǎn)生有效免疫應答需要2種不同的分子信號：一是由抗原特異性T細胞受體（T cell receptor，TCR）與抗原提呈細胞上的MHC-抗原肽復合物結(jié)合提供的第一信號；二是由共刺激分子參與傳遞的第二信號。在已發(fā)現(xiàn)的對排斥反應起關(guān)鍵作用的多種協(xié)同刺激通路中，CD40-CD154是最具特征的信號通路之一[10]。數(shù)十年來，阻斷CD40-CD154共刺激通路，被認為是抑制T細胞應答反應的有效方法，可提高小鼠及非人靈長類哺乳動物的移植物存活率，但抗CD154單克隆抗體的血栓栓塞并發(fā)癥阻礙了其臨床應用，并促使產(chǎn)生靶向CD40的藥物作為替代治療[11]。然而，抗CD40單克隆抗體在提高移植物存活率方面不如抗CD154單克隆抗體，提示CD154可能與另一受體相結(jié)合從而發(fā)揮作用。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)CD11b很可能擔當了這一重要角色。研究者通過對照研究發(fā)現(xiàn)，在野生型和CD40-/-受體小鼠中，使用抗CD154單克隆抗體均可顯著減少移植物CD8+T細胞浸潤，表明CD154的作用不依賴于CD40。研究者進一步使用了一種特定的肽拮抗劑，可以阻斷CD154與CD11b的結(jié)合，但對CD154和CD40的相互作用沒有影響。結(jié)果顯示，與單獨使用抗CD40單克隆抗體相比，阻斷CD154與CD11b的結(jié)合顯著增強了抗CD40單克隆抗體在提高移植物存活率方面的效果，并減少了移植物CD8+T細胞浸潤，其效果與抗CD154單克隆抗體相當。這些數(shù)據(jù)表明，CD11b很可能正是CD154的另一受體。因此，了解CD154和CD11b的相互作用及其影響，并進行臨床轉(zhuǎn)化應用，對改善目前臨床上抗CD40單克隆抗體的治療效果有著非常重要的意義。

2.2 重組促紅細胞生成素在誘導移植免疫耐受中的作用

在誘導移植免疫耐受的轉(zhuǎn)化研究方面，美國和德國的研究者利用靈長類動物進行了嘗試。先前的研究表明，使用重組促紅細胞生成素（recombinant erythropoietin，rEPO）進行治療，可以延長小鼠心臟移植物的存活時間，其機制與調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）的增殖有關(guān)。Ahrens等[13]首次在MHC完全錯配的食蟹猴心臟移植模型中，使用高劑量促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）和抗CD8單克隆抗體治療后，成功誘導免疫耐受。這些數(shù)據(jù)為進一步研究EPO和抗CD8單克隆抗體治療對移植物存活時間的影響提供了基礎。

3 異種移植

同種移植已經(jīng)在臨床上廣泛應用，而目前用于移植的供者器官主要來源于公民逝世后器官捐獻，遠遠不能滿足終末期器官衰竭患者的需求，而異種移植有望開辟新的器官來源途徑。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)過多基因編輯的豬有望成為器官供體[14]。器官供體豬的基因改造工程主要涉及2個方面：（1）敲除豬的3個關(guān)鍵抗原中的1個或多個基因；（2）插入人類轉(zhuǎn)基因，以保護器官免受人類補體或凝血活動的影響[15]。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)（如CRISPR-Cas9），在豬體內(nèi)實現(xiàn)多基因操作變得越來越容易，成本也越來越低，從而加速了該技術(shù)在臨床應用方面的進展[14]。

本次ATC報道了一項相關(guān)的最新研究成果，研究者嘗試將經(jīng)過三基因敲除及插入的基因編輯豬的腎臟移植給食蟹猴，觀察其存活情況。所有供體豬均被敲除三聯(lián)抗原基因，并在3種變異豬體內(nèi)表達不同水平的人類補體、凝血和免疫調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因。移植術(shù)后受體接受單克隆抗體的誘導治療，并使用抗CD154單克隆抗體、嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）、甲潑尼龍和西羅莫司進行維持治療。隨后對受體進行臨床隨訪，隨訪項目包括實驗室檢查、超聲檢查和常規(guī)活組織檢查（活檢）等。其中存活時間最長的受體在移植術(shù)后237 d活檢時無排斥反應，而在術(shù)后265 d死于繼發(fā)性難治性貧血[16]。此前報道的基因編輯豬腎臟移植給靈長類動物的異種腎移植受體最長存活時間為125 d[17]。通過敲除異種抗原基因和插入人類轉(zhuǎn)基因的基因修飾，異種腎移植受體的存活時間得到了很大的提高，這為進一步的研究和臨床轉(zhuǎn)化帶來了希望。

4 抗體介導的排斥反應

在過去的30年中，免疫抑制劑的使用已顯著降低T細胞介導的急性排斥反應的發(fā)生率，但移植物的長期存活改善甚微。研究認為，抗體介導的排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR）是晚期移植物丟失的主要原因之一[18]。目前臨床尚無經(jīng)批準可明確有效治療AMR的藥物，因此，相關(guān)藥物的研發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化顯得尤為迫切。

補體是導致炎癥反應和移植物損傷的主要因素，在缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）、移植物功能延遲恢復（delayed graft function，DGF）及急、慢性AMR的發(fā)生發(fā)展過程中尤其重要。C1抑制劑（C1 inhibitor，C1-INH）在發(fā)揮其抑制炎癥和抗移植物損傷作用的同時，保留了旁路途徑和膜攻擊復合物（C5-9），因此機體的天然抗菌防御功能保持不變，保障了機體安全。來自動物和體外實驗的大量數(shù)據(jù)表明，C1-INH可改善IRI和慢性AMR[19]。為促進C1-INH在移植中的臨床轉(zhuǎn)化，來自美國和新西蘭的研究者Blanton等[20]通過靈長類動物實驗，證實了使用重組人C1-INH（recombinant human C1-INH，rhC1-INH）可有效減少AMR的發(fā)生。研究者通過使用獼猴腦死亡供體模型發(fā)現(xiàn)，與單純供體或受體治療相比，供、受體接受rhC1-INH的雙重干預后，受體的腎功能恢復更快，無AMR生存率更高。該研究表明，供、受者雙重干預的rhC1-INH治療方法是預防腎移植術(shù)后DGF和降低AMR發(fā)生率的一種新策略，有望應用于臨床試驗。

5 納米醫(yī)學

納米凝膠是一種納米級別的聚合物納米顆粒，通過聚合物鏈交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡，能夠封裝生物活性材料，如低分子量藥物、蛋白質(zhì)、核酸等[21]。在熱、光、酸、堿等外部刺激下，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的改變或凝膠相的轉(zhuǎn)變可以使封裝的材料從納米凝膠中釋放出來。將蛋白質(zhì)有效地輸送到靶向部位或特定細胞，長期控制其釋放，并確保其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，這對于用作治療疾病的蛋白質(zhì)類生物制劑來說至關(guān)重要[22]。目前納米凝膠在移植中鮮有應用，美國、英國和荷蘭的研究者進行了白細胞介素（interleukin，IL）-2納米凝膠的嘗試[23]。動物體內(nèi)實驗表明，體外擴增的Treg過繼輸注在自身免疫和同種免疫方面具有巨大潛力，但Treg療法在臨床轉(zhuǎn)化應用上進展緩慢，主要原因是Treg的內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要持續(xù)的TCR配體和IL-2來維持。研究者曾嘗試通過注射低劑量的IL-2來增加內(nèi)源性Treg的反應性，然而全身性應用IL-2會導致細胞毒T淋巴細胞和NK細胞的活化，從而造成不良后果。通過利用納米凝膠技術(shù)，研究者構(gòu)建了IL-2納米凝膠工程化Treg，從而維持抗原接觸部位的細胞數(shù)量。納米凝膠與IL-2形成納米顆粒，可持續(xù)釋放IL-2。IL-2納米凝膠工程化的免疫調(diào)節(jié)性CD4+CD25+Foxp3+T細胞通過抗原-TCR的相互作用，為Treg在抗原富集區(qū)（移植物或移植物淋巴結(jié)引流區(qū)）的過繼輸注提供了細胞因子所介導的生存環(huán)境。結(jié)果顯示，IL-2納米凝膠工程化的Treg可以大大提高移植物存活率。

6 排斥反應的分子學信號

6.1 移植腎損傷分子標志物

為尋找更加合適的用于評估移植腎損傷以及預測術(shù)后移植物長期存活的分子標志物，歐洲多家中心的研究者對移植受者單核細胞源性微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）進行了定量檢測[24]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血液中有14種miRNA與AMR相關(guān)，在發(fā)生AMR的受者中表達下調(diào)；生物統(tǒng)計分析顯示，3種miRNA（miR-15b、miR-106a、miR-374a）可作為AMR的最佳分子標志物；miRNA與臨床生物化學指標相結(jié)合可提高移植腎AMR的診斷準確性。該研究為miRNA作為移植腎損傷分子標志物及其在AMR中發(fā)揮的關(guān)鍵作用提供了新的見解。

6.2 單細胞RNA測序評估移植腎疾病

單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是在單細胞水平對全轉(zhuǎn)錄組進行擴增與測序的一項新技術(shù)[25]。其原理是將分離的單個細胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA進行擴增后進行高通量測序。scRNA-seq可以識別罕見細胞類型、新細胞狀態(tài)和細胞間信號通路，為復雜的生物系統(tǒng)提供了新的探索策略，逐漸被應用到各種復雜疾病的研究中[26]。在器官移植中移植物細胞類型多樣，因此scRNA-seq的應用尤為必要[27]。

腎移植術(shù)后腎小球疾病的發(fā)生率較高，其發(fā)病機制目前無法用免疫機制解釋。腎小球內(nèi)皮細胞損傷可能與腎小球疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。美國密歇根大學的Naik等[28]通過scRNA-seq評估移植腎腎小球內(nèi)皮細胞表達產(chǎn)物的動態(tài)變化，以揭示腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的機制。研究者在活體供腎移植物再灌注前、術(shù)后3個月及術(shù)后12個月時進行活檢，并通過scRNA-seq評估腎小球內(nèi)皮細胞的活化狀態(tài)。差異表達基因分析顯示，在術(shù)后不同時間段，與細胞-細胞黏附、細胞-基質(zhì)黏附、血管生成及生長因子相關(guān)的基因表達存在差異，這可能會導致平滑肌細胞與成纖維細胞的增殖?？梢?，在移植物腎組織尚未出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷時，腎小球內(nèi)皮細胞的基因表達已經(jīng)發(fā)生改變。

7 小 結(jié)

總體而言，移植免疫在腎移植基礎研究中仍然占據(jù)著主導地位，通過移植模型來探索免疫新機制體現(xiàn)了移植研究在人類醫(yī)學發(fā)展中的重要意義，其中對于免疫記憶的顛覆性發(fā)現(xiàn)更是具有里程碑式的意義。AMR是近幾十年來一直困擾著移植研究者和臨床醫(yī)師的難題，盡管舉步維艱，但每一點新的突破都值得期待，同時研究者要拓寬角度、多管齊下，利用新技術(shù)和跨學科研究突破重圍。基因編輯技術(shù)的發(fā)展推動異種移植邁進了新里程，而如何實現(xiàn)同種異體移植完全免疫耐受仍需不懈的探索。