中藥香囊揮發(fā)油對(duì)呼吸道常見致病菌的抑菌作用分析

呂鵬，白明學(xué)，金云隆，高曉潔，馬守芳

(鄭州市中醫(yī)院 制劑室，河南 鄭州 450007)

呼吸道感染是常見的傳染類疾病，一般由金黃色葡萄球菌等致病菌引起[1]。臨床上常用抗生素進(jìn)行治療，但大量抗生素會(huì)使致病菌具有抗藥性從而難以治療[2]。目前預(yù)防和治療呼吸道感染受到各界的關(guān)注。有研究表明，中藥中的揮發(fā)性成分具有抗菌、抗炎、平緩呼吸道平滑肌的作用[3-4]。古代中藥香囊一般用于驅(qū)蚊、提神、辟邪等，但近幾年有研究表明，中藥香囊中的揮發(fā)性成分具有一定的防病治病的作用[5]。文中將檀香、石菖蒲、艾葉、白芷、肉桂等中藥制成香囊，探究其揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等三種呼吸道常見致病菌的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

白芷、檀香、石菖蒲、艾葉、肉桂均由毫州康博中藥飲片有限責(zé)任公司提供。干燥后制成粉末后混合，稱取20g 裝入香囊。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

TSA 培養(yǎng)基、M HB 肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)于上海廣銳生物科技有限公司，0.9%氯化鈉注射液，揮發(fā)油提取裝置(96 孔正壓提取裝置，北京祥生興業(yè)科技有限公司)，立式電熱恒溫培養(yǎng)箱( 型號(hào)：LI-9082，北京奧科匯生物科技有限公司)，超凈工作臺(tái)( 型號(hào)：SW-CJ-1FD，北京巴古頓生物科技有限公司)，電熱蒸氣消毒器( 型號(hào)：HXD-4208，上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，移液槍購(gòu)于北京澤平科技有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)室冷藏箱(型號(hào)：HLR-310F，杭州諾丁科學(xué)器材有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 菌株的分離

臨床菌株選用金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等3 種，從2019年1月至2021年3月本院肺病科門診及病房的樣本中分離出金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌各30 株，銅綠假單胞菌40 株。將菌株純培養(yǎng)后，置于30% 甘油肉湯中，并于-20℃環(huán)境中保存，待用。

1.2.2 菌液及菌液培養(yǎng)基的配置

采用無(wú)菌接種環(huán)，將分離出的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌從30% 甘油肉湯管中刮取菌液到血平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，采用無(wú)菌接種環(huán)挑取2 ～3 個(gè)菌落，溶于生理鹽水，制成0.5麥?zhǔn)蠁挝?，濃度?×108 cfu?mL-1的懸液。

在TSA 培養(yǎng)基上，加入5 mL 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌菌液，使菌液均勻分布，分別制作菌液供試平皿、陽(yáng)性平皿及不含菌液的陰性平皿。

1.2.3 揮發(fā)油提取

根據(jù)《中國(guó)藥典》[6]附錄中XD 的方法提取揮發(fā)油，水蒸氣蒸餾法：取部分中藥材( 單獨(dú)成分揮發(fā)油采用一種藥材，混合揮發(fā)油則將藥材混合)，置于揮發(fā)油測(cè)定燒瓶中，加入300 mL 的蒸餾水，并于燒瓶底部放置幾顆玻璃球，分別連接測(cè)定器、冷凝管，將揮發(fā)油測(cè)定裝置連接完成后加入二甲苯(1 mL)，蒸餾30 min，完成后室溫放置約20 min 等待降溫( 揮發(fā)油量= 得到的揮發(fā)油量- 二甲苯含量)。加入無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水，脫水后加入揮發(fā)油進(jìn)行融化，密封保存。

1.2.4 揮發(fā)油供試品的制備

取檀香、石菖蒲、肉桂、白芷、艾葉揮發(fā)油各600 μl，在無(wú)菌操作下進(jìn)行過濾，置于棕色試劑瓶中，自然揮發(fā)5 min 后，待用。取白芷、檀香、石菖蒲、艾葉、肉桂揮發(fā)油各100 μL，在無(wú)菌操作下進(jìn)行過濾，并置于棕色試劑瓶中混合搖勻，將滅菌后濾紙片放入瓶中，濕潤(rùn)后取出，自然晾干，待用。

1.3 觀察指標(biāo)

(1) 最低抑菌濃度(MIC) 值：將揮發(fā)油稀釋成不同濃度，采用多點(diǎn)接種裝置，將不同揮發(fā)油接種至血平板，培養(yǎng)24 h，若培養(yǎng)液混濁表明有細(xì)菌生長(zhǎng)( 陽(yáng)性)，培養(yǎng)液澄清透明為無(wú)菌生長(zhǎng)( 陰性)。培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)的的最低濃度即為MIC。

(2) 香囊揮發(fā)油成分抑菌圈大?。簩]發(fā)油滴至3種致病菌培養(yǎng)皿上，24 h 后周圍的致病菌生長(zhǎng)受到抑制，從而形成一個(gè)透明圈，即抑菌圈。測(cè)量并記錄抑菌圈直徑大小。

(3) 香囊揮發(fā)油成分抑菌能力排序：根據(jù)不同中藥揮發(fā)油的抑菌作用大小，進(jìn)行排序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 香囊揮發(fā)油的抑菌MlC 值及抑菌率比較

香囊揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌的抑制率分別為60%、90% 及40%(MIC 值的范圍分別為0.001 25 ～0.002 5、0.002 5 ～0.006 25、大于0.08)，見表1。

表1 香囊揮發(fā)油的抑菌MIC值及抑菌率比較Table 1 Comparison of antibacterial MIC value and antibacterial rate of essential oil of sachet

2.2 香囊揮發(fā)油成分對(duì)致病菌的抑菌圈大小比較

香囊中白芷、檀香、石菖蒲、艾葉、肉桂及混合油均對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用，白芷、石菖蒲、艾葉、肉桂及混合油對(duì)大腸埃希菌及銅綠假單胞菌有抑菌作用，但檀香對(duì)于對(duì)大腸埃希菌及銅綠假單胞菌無(wú)抑菌作用，具體抑菌圈大小見表2。

表2 香囊揮發(fā)油成分對(duì)致病菌的抑菌圈大小比較(± s ，mm)Table 2 Comparison of bacteriostatic zone size of volatile oil components of sachets on pathogenic bacteria (x±s,mm)

表2 香囊揮發(fā)油成分對(duì)致病菌的抑菌圈大小比較(± s ，mm)Table 2 Comparison of bacteriostatic zone size of volatile oil components of sachets on pathogenic bacteria (x±s,mm)

菌株 混合油 白芷 檀香 石菖蒲 艾葉 肉桂金黃色葡萄球菌 12.53±1.05 6.99±0.42 8.22±0.42 11.91±0.69 6.75±0.39 28.24±1.91大腸埃希菌 9.31±0.54 6.71±0.44 0.00 8.71±0.81 6.18±0.41 19.97±1.08銅綠假單胞菌 8.05±1.13 6.05±0.40 0.00 7.31±0.10 7.20±0.38 15.17±2.18

2.3 香囊揮發(fā)油成分對(duì)致病菌抑菌能力排序情況

根據(jù)表2 中抑菌圈的大小，香囊成分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力排序?yàn)椋喝夤穑净旌嫌停臼牌眩咎聪悖景总疲景~；對(duì)于大腸埃希菌達(dá)到抑菌能力排序?yàn)椋喝夤穑净旌嫌停臼牌眩景总疲景~＞檀香；對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌能力排序?yàn)椋喝夤穑净旌嫌停臼牌眩景~＞白芷＞檀香，見表3。

表3 香囊揮發(fā)油成分對(duì)致病菌抑菌能力排序情況Table 3 The ranking of the volatile oil components of sachets on the antibacterial ability of pathogenic bacteria

3 討 論

呼吸道感染是由于致病微生物入侵呼吸道所引起，主要致病菌包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等，一般表現(xiàn)為如發(fā)熱、咳嗽、咳痰、打噴嚏、流鼻涕[7]。呼吸道感染部分是由于細(xì)菌引起，另一部分是由病毒引起，臨床上一般以抗生素進(jìn)行抗菌治療，但對(duì)于一些兒童、老人，應(yīng)該尋找更加方便、安全的方式減少呼吸道感染的發(fā)生。目前，多數(shù)研究均表明服用中藥具有消炎、抑菌的作用，能夠預(yù)防和治療呼吸道等疾病，但對(duì)于中藥中的揮發(fā)性物質(zhì)的抗菌作用研究較少[8-9]。白芷、石菖蒲具有除濕、止痛、活血等功效，艾葉同樣有溫經(jīng)止血，散寒祛濕的作用，檀香則能行氣、止痛，肉桂具有發(fā)汗、溫經(jīng)、通脈的功效[10-12]。也有研究表明[13]，上述中藥均有一定的抑菌作用。為探究中藥香囊的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)于對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌的抑菌作用，本研究對(duì)香囊成分揮發(fā)油的抑菌作用及抑菌能力進(jìn)行分析。

本研究選用白芷、檀香、石菖蒲、艾葉、肉桂制成香囊，并提取各自成分及混合成分的揮發(fā)油，檢測(cè)混合揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的MIC 值范圍及抑菌率。研究結(jié)果顯示，香囊揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌的MIC 值的范圍分別為0.001 25 ～0.002 5、0.002 5 ～0.006 25、大于0.08，當(dāng)MIC ≤0.00015，表明細(xì)菌全部受到抑制，抑制率為100%，因此文中的中藥香囊揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的抑制率分別為60%、90% 及40%，表明中藥香囊對(duì)于3 種常見的呼吸道致病菌均有一定的抑制作用，通過抑制致病菌的增長(zhǎng)與繁殖，達(dá)到防止呼吸道感染的目的，其中該香囊揮發(fā)油對(duì)于大腸埃希菌的抑制作用最強(qiáng)。因此，用于預(yù)防大腸埃希菌引發(fā)的呼吸道感染，防治作用更強(qiáng)，而對(duì)于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，也具有一定的防治作用。有研究顯示中藥香囊揮發(fā)油對(duì)于銅綠假單胞菌無(wú)抑菌作用[13]，而本研究中具有一定的抑菌作用，可能是由于香囊中中藥成分存在一定差異，或者提取單揮發(fā)油濃度 不同。

為了進(jìn)一步探究香囊內(nèi)各種有效成分的抑菌作用，對(duì)香囊各個(gè)成分進(jìn)行揮發(fā)油的提取，進(jìn)行深入分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白芷、石菖蒲、艾葉、肉桂及混合油均對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌均有抑菌作用，而檀香僅對(duì)于金黃色葡萄球菌有抑制作用，對(duì)于大腸埃希菌及銅綠假單胞菌無(wú)抑菌作用；根據(jù)抑菌圈的大小，香囊成分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力排序?yàn)椋喝夤穑净旌嫌停臼牌眩咎聪悖景总疲景~；對(duì)于大腸埃希菌達(dá)到抑菌能力排序?yàn)椋喝夤穑净旌嫌停臼牌眩景总疲景~＞檀香；對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌能力排序?yàn)椋喝夤穑净旌嫌停臼牌眩景~＞白芷＞檀香，其中肉桂對(duì)于3種致病菌的抑制作用最強(qiáng)。分析原因?yàn)椋渲邪总埔愿胨?，具有活血止痛，祛除濕氣的功效，一般用于治療頭暈頭痛感冒風(fēng)寒；檀香具有調(diào)理脾胃、開胃理氣及止痛的功效，能夠用于血清抗炎、鎮(zhèn)定安神；石菖蒲則具有化痰祛濕、開胃、醒神等功效；肉桂則具有溫?zé)狎?qū)寒、鎮(zhèn)定安神的功效，一般用于治療高血壓、高血糖的治療，也可用于鎮(zhèn)定；艾葉，一般以全草入藥，具有溫經(jīng)止血、驅(qū)寒祛濕，可以用于消炎止咳、安胎、抗過敏[14-17]。其中肉桂揮發(fā)油能夠改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，使細(xì)菌的結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用[18-19]。提示可根據(jù)不同成分揮發(fā)油對(duì)于不同致病菌，有針對(duì)性的調(diào)整成分的含量，以提高抑菌作用，長(zhǎng)時(shí)間佩戴此中藥香囊有助于呼吸道疾病的以預(yù)防和治療[20]。

綜上所述，香囊揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌具有一定的抑菌作用，其中對(duì)于大腸埃希菌的抑菌作用最強(qiáng)，長(zhǎng)期佩戴能夠預(yù)防呼吸道感染等疾病。