MYC與BCL6蛋白在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的病理分析

董衛(wèi)紅，張海鵬，李慶娜

(1.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院 病理科，河南 安陽(yáng) 455002；2.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院 腫瘤科，河南 安陽(yáng) 455002；3.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，河南 安陽(yáng) 455002)

目前彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤占非霍奇金淋巴瘤的30%，在臨床中屬于常見(jiàn)的亞型淋巴瘤。臨床中主要采用妥昔單抗治療彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤，治愈率高達(dá)50%，但部分患者采用常規(guī)放化療方案的治愈率較低，且病情易出現(xiàn)反復(fù)，臨床預(yù)后較差[1]。2016年WHO 淋巴瘤分類更新顯示[2]，新增了一類多重打擊淋巴瘤，分為雙重打擊淋巴瘤和三重打擊淋巴瘤，其中雙重打擊淋巴瘤主要指MYC 的基因鏈發(fā)生了斷裂造成其他基因位B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生，而三重打擊淋巴瘤是指MYC 基因易位的同時(shí)伴有BCL-6 基因易位的B 細(xì)胞淋巴瘤。目前采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)MYC 與BCL-6 蛋白共表達(dá)被稱為雙重表達(dá)淋巴瘤，檢出率高于基因分子學(xué)定義的雙重打擊淋巴瘤，且免疫組織化學(xué)染色法的操作方法簡(jiǎn)便、快速可滿足臨床諸多需求[4]。本研究分析在濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院確診為彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤的患者，測(cè)定BCL-6、MYC 蛋白表達(dá)在彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中的表達(dá)情況，了解并表達(dá)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床病理特征和預(yù)后，以期為臨床提供有利參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年8月至2021年8月在本院確診為彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤的患者，收集患者的臨床資料和蠟塊組織標(biāo)本，篩選出可完成免疫組化學(xué)染色的標(biāo)本115例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)活檢組織病理確診為彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤；資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；年齡≤18 歲；蠟塊組織較少。本文已通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2015CL17)。

1.2 治療方法

共表達(dá)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中采用R-CHOP(R 為美羅華375 mg/m2dl、C 為環(huán)磷酰胺750 mg/m2dl、H 為阿 霉 素50 mg/m2dl、O 為長(zhǎng) 春 新 堿1.4 mg/m2dl、P 為強(qiáng)的松100 mg/m2dl) 和CHOP(C 為環(huán)磷酰胺750 mg/m2dl、H 為阿霉素素50 mg/m2dl、O 為長(zhǎng)春新堿、P 為強(qiáng)的松100 mg/m2dl) 化療。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

①切片制作：采用旋轉(zhuǎn)式切片進(jìn)行切片，同時(shí)將切片放入裝有溫水的玻璃器皿中，切片展開(kāi)后行水浴鍋加熱，使用防脫片劑的載玻片撈取切片，于37℃下進(jìn)行過(guò)夜。②脫蠟結(jié)束后再行脫水，脫水時(shí)分別將二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ行乙醇(100%)15 mon。在分別使用90%、80%和70% 的乙醇進(jìn)行30 s 脫水，并使用蒸餾水沖洗。③過(guò)氧化物酶活性的清除后行甲醇磷酸鹽緩沖液(PBS) 洗滌：蒸餾水沖洗5 min 后再使用PBS 沖洗5 min，重復(fù)3次。④修復(fù)抗原：將切片放入100 ℃的壓力鍋中，緩沖液(pH=8.0) 中煮沸10 min，并進(jìn)行自然冷卻，將壓力鍋放于冷水槽中沖洗10 min，冷卻后將切片取出，PBS沖洗液反復(fù)沖洗3 次，每次5min。⑤特異性一抗孵育切片和PBS 洗滌切片：滴加一抗孵育3 h 后使用PBS 對(duì)切片進(jìn)行沖洗3 次，每次5 min。⑥ABC 染色：滴加ABC試劑后使用自來(lái)水進(jìn)行沖洗，同時(shí)采用蘇木素復(fù)染，行常規(guī)脫水后進(jìn)行封片。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

染色依據(jù)KRAJEWSKA 方法對(duì)BCL-6 和MYC 蛋白陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行判定。體力狀況(ECOG score standard) 和國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分分別參考美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組[5]和國(guó)際預(yù)后指數(shù)[6]進(jìn)行評(píng)價(jià)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的體能狀態(tài)；根據(jù)Ann-Arbor 分期(Cotswolds 會(huì)議修訂版)[7]對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者進(jìn)行臨床分期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 觀察彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中MYC 和BCL-6 的蛋白陽(yáng)性表達(dá)

115 例彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中，MYC 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者為39 例(33.91%)，BCL-6 蛋白陽(yáng)性者為58例(50.43%)，見(jiàn)表1。

表1 觀察彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中MYC和BCL-6的蛋白陽(yáng)性表達(dá)Table 1 The positive protein expression of MYC and BCL-6 was observed in patients with diffuse large B-cell lymphoma

2.2 臨床病理特征

115 例彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中MYC/BCL-6 蛋白共表達(dá)者為28 例(24.34%)，發(fā)病年齡為38 ～79 歲，中位發(fā)病年齡64 歲；乙型肝炎病毒感染6 例(6/28)、結(jié)節(jié)外16 例(16/28)、B組癥狀14 例(14/28)、結(jié)節(jié)外受累數(shù)目＞1 個(gè)17 例(17/28)；IPI 評(píng)分3 ～5 分18例(18/28)；ECOG 評(píng)分為0 ～1 分12 例(16/28 例)，2 ～4 分 為12 例(12/28)；腫塊大小≤7.5 cm 為18例(18/28)；LDH 升高26 例(26/28)；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期12 例，Ⅲ～Ⅳ期16 例；肝臟受侵8 例(8/28)；脾臟受侵4 例(4/28)；骨髓受侵6 例(6/28)；Ki67 指數(shù)≤50%者為24 例(24/28)；生發(fā)中心B 細(xì)胞淋巴瘤(GCB) 型15 例(15/28)，non-GCB 型13 例(13/28)。

2.3 MYC/BCL-6 共表達(dá)者的生存情況

115 例彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的中位生存時(shí)間為46 個(gè)月，見(jiàn)圖1。18 例MYC/BCL-6 蛋白共表達(dá)者的中位生存時(shí)間為14 個(gè)月，見(jiàn)圖2。

圖1 所有彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的生存曲線Figure 1 Survival curves for all patients with diffuse large B cell lymphoma

圖2 共表達(dá)者生存時(shí)間Figure 2 Survival time of coxenters

2.4 觀察全組共表達(dá)患者治療后的臨床預(yù)后情況

共表達(dá)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中，24 例接受治療后的生存時(shí)間為(15.98±2.56) 個(gè)月，4 例放棄治療時(shí)間為(2.00±1.02) 個(gè)月(P=0.000)。28 例接受治療的共表達(dá)患者中，采用單純化療的為20 例，生存時(shí)間為(15.98±1.87) 個(gè)月，4 例為放化療聯(lián)合治療后的生存時(shí)間為(18.99±13.13) 個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.846)；8 例單純化療的共表達(dá)患者中，行R-CHOP和CHOP 治療的各12 例，生存時(shí)間分別為(16.99±4.46)個(gè)月、(14.98±2.25) 個(gè)月，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.872)，見(jiàn)表2。

表2 觀察全組共表達(dá)患者治療后的臨床預(yù)后情況Table 2 observed the clinical prognosis of the treatment of co-expressed patients in the whole group

2.5 觀察不同化療方案對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的影響

共表達(dá)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中化療者為12例，生存時(shí)間為(16.99±4.46) 個(gè)月，31 例非共表達(dá)者的生存時(shí)間為(82.98±12.81)個(gè)月，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。采用CHOP 化療的共表達(dá)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者為12 例，生存時(shí)間為(14.98±2.25)個(gè)月，55 例非共表達(dá)者的生存時(shí)間為(50.00±4.30) 個(gè)月，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見(jiàn)表3。

表3 觀察不同化療方案對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的影響Table 3 shows the effect of different chemotherapy regimens on the prognosis of patients with diffuse large B cell lymphoma

3 討 論

彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤在臨床中具有高度的侵襲性，在分子遺傳學(xué)、免疫分型和臨床預(yù)后中具備顯著異質(zhì)性[8]。隨著科技的不斷發(fā)展，基因芯片技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)各種疾病中，且基因芯片技術(shù)用于檢測(cè)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的發(fā)病機(jī)制中可明確患者疾病發(fā)生的原因，為臨床提供了有利參考意見(jiàn)，還可通過(guò)此技術(shù)判斷患者的預(yù)后。

經(jīng)過(guò)對(duì)收治115 例彌漫性大B 細(xì)胞淋巴癌患者臨床數(shù)據(jù)分析中，提示患者大部分為中老年群體，有24.34%比例患者為MYC/BCL-6 蛋白共表達(dá)，其中15 例為GCB，13 例為non-GCB 型。在28 例患者中具備典型的病理特征，諸如病灶位于結(jié)節(jié)外，存在B 組癥狀，結(jié)節(jié)外受侵襲數(shù)量超過(guò)1 個(gè)等，同時(shí)可通過(guò)對(duì)腫塊體積測(cè)量和LDH 濃度檢測(cè)來(lái)作為輔助判斷的依據(jù)，彌漫性大B 細(xì)胞淋巴癌患者的典型表現(xiàn)是臨床鑒別和判斷病情的重要依據(jù)，在收治此類患者時(shí)應(yīng)該高度重視。

MYC/BCL-6 蛋白共表達(dá)者預(yù)后較差的原因尚未有明確報(bào)道，考慮到可能與基因易位、病理分型和侵襲性臨床特征有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，BCL-6 和MYC 蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)的符合率可達(dá)86%，有效提高了基因檢測(cè)率。因此本文分析了MYC 與BCL-6 蛋白表達(dá)在彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中的蛋白表達(dá)情況和臨床預(yù)后的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，115 例彌漫型大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中檢出MYC 陽(yáng)性率為33.91%，BCL-6 檢出率為50.43%，此結(jié)論與上述報(bào)道結(jié)果相同。MYC 基因發(fā)生易位突變后會(huì)形成一種高轉(zhuǎn)錄活性原癌基因，對(duì)細(xì)胞的惡性病變有促進(jìn)作用，參與了多種腫瘤的發(fā)展和形成，還可抵消治療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，嚴(yán)重影響了患者臨床預(yù)后[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的不良預(yù)后因素與MYC 易位存在明顯關(guān)聯(lián)，從數(shù)據(jù)當(dāng)中可知彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的整體中位生存時(shí)間為46 個(gè)月，而MYC/BCL-6 蛋白共表達(dá)患者的整體中位生存時(shí)間為14 個(gè)月，提示兩者在預(yù)后關(guān)系方面存在明顯差異，這里與上述研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)容相印證。MYC 在人體的正常細(xì)胞中可直接激活TP53，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡，且TP53 基因還可對(duì)MYC 的表達(dá)起到抑制作用，MYC 在促進(jìn)細(xì)胞凋亡和活性的過(guò)程中主要是激活p19-MDM2-TP53 和抑制凋亡因子BCL-2 來(lái)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)[14]。MYC 可直接驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行增殖，還可使細(xì)胞對(duì)凋亡出現(xiàn)刺激感，同時(shí)也屬于有效的安全防護(hù)，防止了潛在MYC 誘導(dǎo)惡化。若發(fā)生TP5 基因突變及BCL-2 基因重排等就會(huì)與MYC 聯(lián)合促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前MYC 重排中對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后存在明顯影響的觀點(diǎn)大致相同，MYC 的重排在彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤中的發(fā)生率約為5% ～10%，而MYC 染色體的易位伙伴對(duì)MYC 異常的預(yù)后同樣存在明顯影響，且MYC IG 易位較non-IG易位基因的預(yù)后更差，但此結(jié)論在諸多報(bào)道中并未達(dá)到共識(shí)[15]。需要在大研究數(shù)量、范圍基礎(chǔ)上展開(kāi)深入的探討，以期能夠明確MYC 染色體易位對(duì)于患者病情變化的重要意義，從而尋求針對(duì)性的干預(yù)手段以提高預(yù)后質(zhì)量。

Green T M 等學(xué)者[16]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)R-CHOP 進(jìn)行治療的彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者，共表達(dá)者的中位生存時(shí)間為13 個(gè)月，而非共表達(dá)者的生存時(shí)間為95 個(gè)月。本研究發(fā)現(xiàn)，行R-CHOP 治療的彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者共表達(dá)者的生存時(shí)間為(16.99±4.46)，非共表達(dá)者的生存時(shí)間為(82.98±12.81) 個(gè)月，治療方式與化療方案對(duì)共表達(dá)患者臨床預(yù)后的影響較小，說(shuō)明共表達(dá)患者DL-BCL 患者的治療效果差，且侵襲性較強(qiáng)，目前所采取的治療方案對(duì)于病情的干預(yù)效果未能滿足臨床需求，明確患者的病理類型對(duì)于評(píng)估治療效果也重要的指導(dǎo) 價(jià)值。

BCL-6 與BCL-2 的重排或單獨(dú)出現(xiàn)或共同發(fā)生也時(shí)常在MYC 的重排中常見(jiàn)，此類打擊因子對(duì)患者的預(yù)后也會(huì)造成影響，而有研究發(fā)現(xiàn)[17]，當(dāng)TP53 發(fā)生異常時(shí)會(huì)影響彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的預(yù)后。同時(shí)MYC的額外拷貝同樣提示了彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后差。BCL-6 基因重排在諸多報(bào)道中對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的影響并未統(tǒng)一，且有研究發(fā)現(xiàn)BCL-2 或BCL-6 發(fā)生重排時(shí)對(duì)預(yù)測(cè)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后不是很明顯，此結(jié)論與本研究所的結(jié)果不同[18]。MYC共表達(dá)的彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的不利預(yù)后主要依賴于TP53 基因突變和BCL-6 重排的“第二次打擊”，且TP53 突變可能比BCL-6 重排有更加不利的作用。BCL-6屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子，主要位于染色體3q27 末端，直接參與了淋巴細(xì)胞的分化等免疫反應(yīng)，在B 細(xì)胞發(fā)育表達(dá)中起到了明顯作用[19]。有研究發(fā)現(xiàn)[20]，彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者經(jīng)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)MYC 和BCL-6 的蛋白共表達(dá)的檢出率為29%，同時(shí)經(jīng)免疫熒光獲得了有效驗(yàn)證。

綜上所述，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DL-BCL 中的MYC 和BCL-6 蛋白表達(dá)，對(duì)患者的預(yù)后、分型起到了重要判斷作用。目前MYC/BCL-6 蛋白共表達(dá)患者的生存期短，治療效果差，但新靶點(diǎn)研究已成為此類淋巴瘤治療的關(guān)注熱點(diǎn)。