消糖靈片的超高效液相色譜指紋圖譜建立、含量測(cè)定 及化學(xué)模式識(shí)別

王素娟，賀凡珍，王乾蕾，李哲，許潤(rùn)娟（中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437）

消糖靈片是臨床常用的降糖類藥物，由11味中藥（知母、天花粉、黃連、白芍、黃芪、人參、枸杞子、丹參、五味子、杜仲及沙苑子）與西藥格列本脲組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱瀉火、益腎縮尿之功效，臨床上用于治療陰虛燥熱、氣陰兩虛所致的消渴病，癥見口渴喜飲、體倦乏力、多食、多尿、消瘦；2型糖尿病見上述癥候者[1]。消糖靈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第七十六冊(cè)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為YBZ03442004-2008Z），原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)黃芪甲苷、人參皂苷Re和人參皂苷Rg1、黃連藥材進(jìn)行了薄層鑒別，并對(duì)芍藥苷與格列本脲進(jìn)行了含量測(cè)定。但僅對(duì)部分藥味進(jìn)行薄層色譜鑒別和含量測(cè)定，無(wú)法全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量。目前尚未見有消糖靈片化學(xué)成分與指紋圖譜的相關(guān)研究報(bào)道[2-3]。 中藥復(fù)方制劑由多味中藥材共同配伍而成，通過不同活性成分共同作用達(dá)到治療疾病的目的，因此對(duì)中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的方法應(yīng)能夠更加客觀、全面地反映其所含的化學(xué)成分。中藥指紋圖譜能標(biāo)示中藥的化學(xué)成分特征，通過對(duì)其潛藏的大量數(shù)據(jù)和變量進(jìn)行挖掘和評(píng)價(jià)，能夠有效反映出中藥內(nèi)在的化學(xué)成分信息[4-5]，實(shí)現(xiàn)鑒別產(chǎn)品真實(shí)性、評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可靠手段[4-5]。因此，本試驗(yàn)旨在建立消糖靈片的UPLC指紋圖譜，并進(jìn)行多組分含量測(cè)定，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，為消糖靈片的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC H-CLASS 超高液相色譜儀，PDA檢測(cè)器（美國(guó)沃特世公司）；Millipore Integral-5超純水機(jī)（德國(guó)默克公司）；METTLER XS 205電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多）；超聲波清洗機(jī)（天津瑞普）。

1.2 試藥

15批消糖靈片樣品（7批由廣東先通藥業(yè)有限公司提供，8批購(gòu)自市場(chǎng)），具體信息見表1。對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：110753-201817，含量：96.8%）、芒果苷（批號(hào)：111607-201704，含量：98.1%）、芍藥苷（批號(hào)：110736-201943，含量95.1%）、鹽酸黃連堿（批號(hào)：112026-201802，含量：94.0%）、鹽酸巴馬汀（批號(hào)：110732-201913，含量：85.7%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201814，含量：86.7%）、五味子醇甲（批號(hào)：110857-201815，含量：99.7%）、格列本脲（批號(hào)：100135-201806，含量：99.5%，HPLC）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：PF190926-15，含量：98.87%）、沙苑子苷（批號(hào)：PF190618-05，含量：98.56%）、丹酚酸B（批號(hào)：PF191019-03，含量：98.66%）（Stanford Chemicals公司）；對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)：O0970010，含量：99.4%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純（MERCK公司），超純水由Millipore超純水機(jī)制備。

表1 消糖靈片樣品信息 Tab 1 Samples of Xiaotangling tablet

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水（加1 mL三乙胺調(diào)pH至2.6）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，98%～84%A；10～14 min，84%～77%A；14～22.5 min，77%～70%A；22.5～33 min，70%～30%A；33～36 min，70%A）；體積流量0.2 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

2.2 消糖靈片UPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 指紋圖譜對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品（綠原酸、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、沙苑子苷、鹽酸黃連堿、丹酚酸B、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、五味子醇甲、格列本脲）各約5 mg，加甲醇溶解定容于10 mL量瓶中，配制成質(zhì)量濃度約為0.5 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取2 mL，置同一50 mL量瓶中，用50%甲醇水溶液稀釋定容至刻度，制成質(zhì)量濃度約0.02 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取消糖靈片10片，除去薄膜衣，研細(xì)，混勻，精密稱取0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液25 mL，密塞，超聲處理（40 kHz）30 min，取出，放冷，用50%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取樣品 S6 供試品溶液6份，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值在0.20%～2.9%。表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品 S6共6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值在0.52%～2.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在“2.1”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h精密吸取樣品 S6 供試品溶液進(jìn)樣，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值在0.38%～2.4%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 指紋圖譜建立及相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.1版本）對(duì)所得的不同批次消糖靈片的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以S6為參照色譜圖，采用多點(diǎn)校正法建立指紋圖譜[6]，得到15批消糖靈片指紋圖譜見圖1，相似度計(jì)算數(shù)據(jù)顯示，15批消糖靈片樣品的指紋圖譜相對(duì)于對(duì)照指紋圖譜（R）的相似度均大于0.996，結(jié)果見圖2。

圖1 15批樣品UPLC指紋圖譜Fig 1 UPLC fingerprints of 15 batches of samples

圖2 15批樣品相似度計(jì)算結(jié)果Fig 2 Similarities of 15 batches of samples

2.2.7 色譜峰指認(rèn) 在消糖靈片UPLC指紋圖譜中共標(biāo)定25個(gè)共有峰，通過與混合對(duì)照品溶液圖譜的峰保留時(shí)間及光譜圖對(duì)照，分別指認(rèn)了12個(gè)色譜峰。其中4號(hào)峰為綠原酸，5號(hào)峰為芒果苷，8號(hào)峰為芍藥內(nèi)酯苷，10號(hào)峰為芍藥苷，11號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，14號(hào)峰為沙苑子苷，17號(hào)峰為鹽酸黃連堿，18號(hào)峰為丹酚酸B，19號(hào)峰為鹽酸巴馬汀，20號(hào)峰為鹽酸小檗堿，23號(hào)峰為五味子醇甲，25號(hào)峰為格列本脲，結(jié)果見圖3。

圖3 混合對(duì)照品溶液的UPLC色譜圖Fig 3 UPLC chromatography of mixed reference substances

2.3 7種組分的含量測(cè)定

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品（鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲）各適量，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成各對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加50%甲醇水溶液制成鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度分別為11.319、22.639、45.279、90.558、181.116 μg·mL－1，鹽酸黃連堿質(zhì)量濃度分別為8.800、17.601、35.203、70.406、140.812 μg·mL－1，芒果苷質(zhì)量濃度分別為0.8497、1.699、3.399、6.798、13.596 μg·mL－1，芍藥苷分別為4.454、8.909、17.82、35.64、71.28 μg·mL－1，毛蕊異黃酮葡萄糖苷分別為2.236、4.472、8.944、17.89、35.78 μg·mL－1，五味子醇甲分別為0.7415、1.483、2.966、5.932、11.86 μg·mL－1， 格列本脲分別為3.783、7.567、15.13、30.15、60.54 μg·mL－1的混合系列對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項(xiàng)下操作。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)S6）和空白溶液（50%甲醇水溶液）適量，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果各待測(cè)成分的色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于80 000，拖尾因子為0.9～1.4，空白溶液對(duì)7種成分的測(cè)定無(wú)干擾，見圖4。

圖4 供試品（A）、混合對(duì)照品（B）和空白溶液（C）色譜圖Fig 4 UPLC chromatogram of Xiaotangling tablets（A），mixed reference（B）and blank solution（C）

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下各混合系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 7種組分的回歸方程與線性范圍 Tab 2 Regression equation and linearity of 7 components

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲峰面積的RSD分別為0.060%、0.10%、0.35%、0.20%、0.26%、2.0%、0.21%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取消糖靈片樣品（編號(hào)S6）0.4 g，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果7種成分峰面積的RSD在0.52%～2.3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S6）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果7種成分峰面積的RSD在0.38%～2.3%。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的消糖靈片樣品（編號(hào)S6）約0.2 g，共9份，分別按已知含量的80%、100%、120%加入7種對(duì)照品儲(chǔ)備液（各3份），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲的平均加樣回收率分別在96.11%～101.06（RSD在0.27%～1.1%）、94.96%～96.46%（RSD在0.32%～0.82%）、98.60%～103.74%（RSD在1.1%～1.4%）、94.53%～99.10%%（RSD在0.23%～0.58%）、98.45%～99.97%（RSD在0.63%～2.1%）、95.17%～97.27%（RSD在1.1%～1.9%）、98.81%～100.9%（RSD在0.41%～1.3%）。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取消糖靈片15批，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。測(cè)得樣品中鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲的含量分別在3.951～4.356、1.325～1.665、0.205～0.331、2.444～3.119、0.184～0.296、0.264～0.380、1.598～1.786 mg·g－1，結(jié)果見表3。

表3 15批消糖靈片中7個(gè)成分含量的測(cè)定結(jié)果(n＝3，mg·g－1) Tab 3 Content of 7 components in 15 batches of Xiaotangling tablets (n＝3，mg·g－1)

2.4 化學(xué)模式識(shí)別方法

2.4.1 聚類分析（CA） 應(yīng)用SPSS 20.0軟件，以共有峰的相對(duì)峰面積為變量，對(duì)消糖靈片樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，采用組間平均連接法，以歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)[7]，結(jié)果見圖5。當(dāng)距離刻度為25時(shí)，15批樣品主要分為2大類，S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S11、S13、S14、S15為第1類，S1、S4、S10、S12為第2類。

圖5 15 批樣品聚類樹狀圖Fig 5 Dendrogram of cluster analysis of 15 batches of samples

2.4.2 主成分分析（PCA） 以各批次消糖靈片的指紋圖譜所得共有峰的峰面積為變量，構(gòu)建15×25的原始數(shù)據(jù)矩陣，通過變量統(tǒng)計(jì)分析軟件（SIMCA 14.1）對(duì)15批消糖靈片樣品進(jìn)行PCA，繪制出主成分分析圖，結(jié)果見圖6，表明15批消糖靈片樣品呈現(xiàn)的分類與聚類分析結(jié)果基本吻合。PCA載荷圖中的每一個(gè)點(diǎn)表示為一個(gè)色譜峰，其與原點(diǎn)（0，0）的距離越遠(yuǎn)，代表該色譜峰對(duì)樣品整體分布貢獻(xiàn)的程度越大[8]。3、4、5、6、10、11、12、13、14、16、17、19、20、22和25號(hào)色譜峰在坐標(biāo)系中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，表明其對(duì)消糖靈片的質(zhì)量有重要影響，見圖7。

圖6 15 批樣品PCA圖Fig 6 PCA plot for 15 batches of samples

圖7 15 批樣品PCA載荷圖Fig 7 Load scatter diagram of 15 batches of samples

2.4.3 OPLS-DA 本研究采用OPLS-DA模型對(duì)樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，得到各批次樣品間的差異性成分，見圖8。

圖8 15批樣品OPLS-DA分析散點(diǎn)圖Fig 8 Scatter diagram of OPLS-DA of 15 batches of samples

為篩選出對(duì)上述樣品分類貢獻(xiàn)較大的成分，以變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）＞1.0 為篩選標(biāo)準(zhǔn)[9]，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。共得到10個(gè)有意義變量，按照變量投影重要度值大小依次為13號(hào)峰＞17號(hào)峰（鹽酸黃連堿）＞20號(hào)峰（鹽酸小檗堿）＞16號(hào)峰＞2號(hào)峰＞18號(hào)峰（丹酚酸B）＞25號(hào)峰（格列本脲）＞5號(hào)峰（芒果苷）＞10號(hào)峰（芍藥苷）＞11號(hào)峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷），結(jié)果見圖9。這些成分是導(dǎo)致15批樣品之間差異的主要原因，有一定的標(biāo)志作用，該結(jié)果與PCA中載荷圖的分析結(jié)果基本一致。在以后對(duì)消糖靈片的研究中可以重點(diǎn)關(guān)注上述成分的質(zhì)量變化，以便更加系統(tǒng)、高效地評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量。

圖9 15批樣品各成分VIP圖Fig 9 VIP diagram of various constituents from 15 batches of samples

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

本研究在制備消糖靈片UPLC供試品溶液時(shí)，結(jié)合處方工藝和各組分化學(xué)性質(zhì)[10-15]，曾分別采用超聲（15、30、60 min）、加熱回流（60、80、100℃）的方式進(jìn)行提取，并進(jìn)行了提取溶劑的篩選（不同比例的甲醇水溶液、乙醇水溶液等）。結(jié)果顯示，加熱回流提取耗時(shí)長(zhǎng)，并且溫度高于80℃時(shí)提取60 min，格列本脲有降解。50%甲醇水溶液超聲提取所得色譜峰信息最多，更能兼顧各藥材所含化學(xué)成分，最終選擇50%甲醇超聲30 min進(jìn)行提取。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

分別對(duì)流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸水、乙腈-酸水）、色譜柱[ Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）]、體積流量（0.15、0.20、0.25、0.3 mL·min－1）、柱 溫（25、30、35℃）、檢測(cè)波長(zhǎng)（210、230、254、280、320 nm）進(jìn)行考察，綜合峰響應(yīng)強(qiáng)度和數(shù)量、基線平穩(wěn)性、分離度效果，最終確定Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，乙腈-0.1%磷酸水（加1 mL三乙胺調(diào)pH至2.6）梯度洗脫，體積流量0.2 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30℃為色譜分析條件。

3.3 相似度分析與含量測(cè)定分析

本研究建立的消糖靈片UPLC指紋圖譜，可以反映消糖靈片處方中各味藥材所含化學(xué)組分的信息。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，各批次的消糖靈片指紋圖譜具有高度的相似性，即各批樣品的化學(xué)成分一致性較好。

含量測(cè)定成分的選擇主要考慮所含的活性成分、君（臣）藥的特征成分、處方中大多數(shù)藥味的提取工藝等情況。消糖靈片中知母、天花粉、黃連為君藥；人參、黃芪為臣藥；枸杞子、白芍、丹參、五味子為佐藥；杜仲、沙苑子為使藥。其中君藥天花粉的主要有效成分為蛋白質(zhì)類、多糖類等，均無(wú)紫外吸收。其生產(chǎn)工藝中君藥黃連、人參采取粉碎為細(xì)粉入藥，其余藥材采用水提醇沉法提取。人參的主要有效成分有人參皂苷類，為脂溶性成分，且最大吸收波長(zhǎng)在203 nm，在擬定條件下難以檢出。因此選擇知母、黃連、黃芪、白芍和五味子的活性成分進(jìn)行含量測(cè)定。鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿歸屬于黃連藥材，芒果苷歸屬于知母藥材，芍藥苷歸屬于白芍藥材，毛蕊異黃酮葡萄糖苷歸屬于黃芪藥材，五味子醇甲歸屬于五味子藥材[10-15]，各組分涵蓋君、臣、佐多味藥材的有效成分。結(jié)果顯示，15批消糖靈片中鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲7 種成分含量的RSD分別為 2.5%、7.3%、17.2%、7.4%、12.3%、13.1%、3.7%，表明不同批次的消糖靈片質(zhì)量存在一定差異，這可能是投料藥材質(zhì)量存在差異所導(dǎo)致的。

3.4 CA與PCA

因目前僅有一個(gè)廠家生產(chǎn)消糖靈片，故筆者通過從生產(chǎn)和流通環(huán)節(jié)總共收集了不同批次的15個(gè)樣本。按照樣品中各成分的含量，在CA與PCA中將15個(gè)樣本分為兩大類。同時(shí)OPLS-DA 分析出對(duì)分組貢獻(xiàn)較大的差異標(biāo)志物10個(gè)，建議生產(chǎn)廠家對(duì)這10個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注，跟蹤這些標(biāo)志物在各生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的變化。本研究建立的指紋圖譜、多組分含量測(cè)定，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法為不同批次的消糖靈片質(zhì)量一致性提供新思路，能有效彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的不足，可供企業(yè)在原藥材來(lái)源、運(yùn)輸儲(chǔ)存、生產(chǎn)工藝等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控，以便科學(xué)、系統(tǒng)地保證藥品的質(zhì)量。

綜上所述，所建立的UPLC指紋圖譜穩(wěn)定、可行，含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析可為消糖靈片的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。